Едноклетъчна транскриптомика разкрива нарушения на бъбречния филтър клетъчно-клетъчни взаимодействия след ранно и селективно увреждане на подоцитите

Резултати

Single-Cell Profiling of >29,000 Обогатени с гломерули бъбречни клетки

Актуални едноклетъчни протоколи заидентифициране на целия бъбрек<2.5% glomerular cells,9 and although a пречистен гломерулен препаратизползването на магнитни перли обогатява за тази популация22, то не успява да улови друга клеткавидове бъбректова може да представлява интерес. Използван е метод на пресяване за едновременно обогатяване на гломерули и улавяне на допълнителни типове бъбречни клетки, за да се разширят тези открития и да се развие подробно разбиране на клетъчно-клетъчните взаимодействия в гломерула в контекста на целия клетъчен пейзаж на бъбрека, преди и след увреждане на подоцитите.

За идентифициране на ранните транскрипционни ефекти на аблацията на подоцитите по специфичен за клетъчния тип начин, scRNAseq се извършва сбъбречна тъканот WT и iCTCFpod / мишки, събрани чрез серийно пресяване след 1 седмица лечение с доксициклин (Фигура 1А). Бъбречна тъкан от четири WT животни (четири биологични реплики) и четири iCTCFpod / животни дават общо 14 783 WT и 14 727 iCTCFpod / клетки, профилирани след филтриране (допълнителна фигура S1, A и B; допълнителни таблици S1 и S2). Данните бяха нормализирани, за да се премахнат ефектите, дължащи се на броя на UMI и процента на митохондриалните показания. След интегриране на WT и iCTCFpod / проби, беше използвана ниска разделителна способност на клъстериране за откриване на девет клъстера (Фигура 1B). Биологични реплики на WT и iCTCFpod / проби бяха разпределени между всички клъстери (допълнителна фигура S2, AC). Всички типове клетки на гломерула, както и допълнителни видове бъбречни клетки, бяха идентифицирани с помощта на установени и извлечени от данни маркери (Фигура 1C; Допълнителна таблица S3; Допълнителна фигура S3A).

Гломерулни клетки, представляващи общо 82,1% от всички възстановени клетки [36,9% подоцити, 42,1% гломерулни ендотелни клетки (GECs), 2,7% мезангиални клетки и 0.36% PECs] бяха изолирани и повторно групирани (Фигура 1D) . Бяха идентифицирани четири клъстера от подоцити, пет клъстера от GECs и по един клъстер от мезангиални клетки и PECs, експресиращи канонични маркери от клетъчен тип (Фигура 1E; Допълнителна фигура S3B). Биологични реплики на WT и iCTCFpod / проби бяха разпределени във всички клъстери (допълнителна фигура S2, DF; допълнителна таблица S4). Както се очакваше, като се има предвид, че подоцит-специфичната делеция на CTCF води до хистологично откриваема загуба на подоцити на 2 седмици, 13 iCTCFpod / пробите съдържат по-нисък процент подоцити от WT проби (Фигура 1F; Допълнителна таблица S5). iCTCFpod / пробите имат 13,1% по-малко подо цити, 11,9% повече GECs и 1,5% повече мезангиални клетки от WT пробите (допълнителна таблица S5). PECs допринесоха<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

НОВИ БИЛКИ ЗА ЗДРАВЕ НА БЪБРЕЦИТЕ

Подоцит-специфична индуцируема CTCF делеция води до промени в генната експресия във всички типове гломерулни клетки

Диференциален експресионен анализ беше извършен във всеки от 11 клъстера, сравняващи iCTCFpod / и WT клетки (допълнителна таблица S6). Гените се считат за диференциално експресирани, ако се открият в най-малко 10% от клетките в даден клъстер, с минимална абсолютна логаритмична промяна от 0.1 и коригирано P <0. 05. Ctcf се експресира диференциално във всеки от четирите клъстера на подоцити, със средни промени в логаритмично сгъване от 0.390, 0.189, 0.331 и 0.303, съответно. Броят на клетките във всеки клъстер беше намален и анализът на диференциалната експресия се повтори, за да се сравни броят на диференциално експресираните гени сред 11-те клъстера. Подоцитните клъстери имат най-различно експресираните гени, следвани от GEC-1 и GEC-2 (Фигура 1G). Останалите три клъстера GECs, заедно с мезангиалните клетки и PECs, имаха много по-малко диференциално експресирани гени (Фигура 1G), което предполага, че GEC-1 и GEC-2, сред всички гломерулни клъстери, са били най-засегнати от последствията от увреждане на подоцитите, причинено от делеция на CTCF.

Генни програми, свързани със заболяването, идентифицирани в специфични клъстери на подоцити и ендотелни клетки

Това проучване първо се опита да проучи как отделните подоцитни клъстери реагират на нараняване. Диаграма на Venn на диференциално експресираните гени във всеки от четирите подоцитни клъстера разкрива, че подоцит 1 има най-уникалните диференциално експресирани гени от четирите подоцитни клъстера (Фигура 2A; Допълнителна таблица S7). Наблюдението, че един от четирите подоцитни клъстера е бил по-забележимо засегнат, е в съгласие с предишни хистологични данни, показващи, че не всички подоцити са засегнати с еднаква тежест в лицето на нараняване и подчертава силата на scRNAseq да характеризира молекулярно хетерогенността на клетъчните състояния в рамките на същия тип клетка.23

Беше извършен анализ на свръхпредставяне, за да се идентифицират генни програми, обогатени в резултат на загуба на CTCF в клъстера на подоцит 1 (допълнителна таблица S8). Най-обогатените термини бяха визуализирани с карта на обогатяване, за да се групират взаимно припокриващи се набори гени (Фигура 2B). Видна група от обогатени термини бяха митохондриалните функции, включително синтез на АТФ, организация на митохондриите, верига за транспортиране на електрони и окислително фосфорилиране (Фигура 2B). Тези данни разширяват скорошната работа, сочеща митохондриалната дисфункция като признак на увреждане на подоцитите. В допълнение, човешката генетика посочи значението на митохондриалните функции в подоцитите, включително няколко мутации в пътя на биосинтеза на CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, и ADCK4), които причиняват нефротичен синдром, главно при деца.25,26 Поради това се предполага, че митохондриалната дисфункция на подоцитите може да представлява изявено клетъчно състояние, свързано с всички заболявания, произтичащи от загуба на подоцити.24 Данните подкрепят това схващане в един -клетъчна разделителна способност, което предполага, че митохондриалната дисфункция може да представлява най-ранното състояние на нараняване в специфична популация от подоцити, което води до загуба на подоцити.

Беше извършен анализ на свръхпредставяне, за да се идентифицират генни програми, обогатени в резултат на загуба на CTCF в клъстера на подоцит 1 (допълнителна таблица S8). Най-обогатените термини бяха визуализирани с карта на обогатяване, за да се групират взаимно припокриващи се набори гени (Фигура 2B). Видна група от обогатени термини бяха митохондриалните функции, включително синтез на АТФ, организация на митохондриите, верига за транспортиране на електрони и окислително фосфорилиране (Фигура 2B). Тези данни разширяват скорошната работа, сочеща митохондриалната дисфункция като признак на увреждане на подоцитите. В допълнение, човешката генетика посочи значението на митохондриалните функции в подоцитите, включително няколко мутации в пътя на биосинтеза на CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, и ADCK4), които причиняват нефротичен синдром, главно при деца.25,26 Поради това се предполага, че митохондриалната дисфункция на подоцитите може да представлява изявено клетъчно състояние, свързано с всички заболявания, произтичащи от загуба на подоцити.24 Данните подкрепят това схващане в един -клетъчна разделителна способност, което предполага, че митохондриалната дисфункция може да представлява най-ранното състояние на нараняване в специфична популация от подоцити, което води до загуба на подоцити.

Една от основните групи от обогатени термини от анализа на свръхпредставяне (Фигура 2B) беше цитоскелетната организация, както и свързан единичен обогатен термин за адхезия на клетъчна матрица. Актиновият цитоскелет играе съществена роля в поддържането на уникалната и сложна структура на подоцитите и адхезията към GBM е от съществено значение за функцията на подоцитите.27 Зрелите фокални адхезии съдържат стотици протеини, които свързват актиновия цитоскелет, свързването на рецепторната матрица, вътреклетъчната сигнална трансдукция и полимеризация на актин. Един от най-регулираните надолу гени в подоцит 1 е Rhpn1 (допълнителна фигура S4A), основен компонент за установяване на динамиката на цитоскелета на подоцитите и поддържане на архитектурата на процесите на подоцитното краче.28 Комплексният компонент на Arp2/3 Arpc3, двигател на полимеризацията на актин, беше регулиран нагоре в клъстера на подоцит 1 (Фигура 2C; Допълнителна фигура S4B). Ген за допълнителен компонент на комплекса, Actr2, също беше регулиран нагоре както в подоцит 1, така и в подоцит 4. В допълнение, Wasl, чийто протеинов продукт, N-WASP, активира комплекса Arp2/3 и е необходим за поддържането на на процесите на подоцитното краче in vivo29, също беше регулиран нагоре в подоцит 1, подоцит 3 и подоцит 4. Цитоскелетният регулатор Arhgdia, чиято делеция е свързана с нефротичен синдром при мишки,30 беше регулиран надолу в подоцит 1 (Фигура 2C). Нивата на експресия на две Rho GTPases

Фигура 3 Подоцитен клъстер регулира нагоре Col4a5. A: Col4a5 беше значително регулиран нагоре в индуцируема подоцит-специфична CTCF делеция (iCTCFpod /) подоцит 1 клетки в сравнение с див тип (WT) подоцит 1 клетки. Рецепторите на колаген тип IV ɑ5 (COL4A5) са силно експресирани в мезангиални клетки и субкластери от 1 до 4 на гломерулни ендотелни клетки (GEC). Размерът на върха на стрелката представлява относителната експресия на рецептора. B: Количествено определяне на верижна реакция на хибридизация (HCR). Col4a5 беше значително повишено в iCTCFpod / Nphs2-експресиращи клетки в сравнение с WT Nphs{{20}}експресиращи клетки. Бяха оценени четири WT и четири iCTCFpod/мишки. Всички гломерули от три изображения бяха количествено определени. C: Експресия на Col4a5 в гломерули на WT и iCTCFpod / животни, както е оценено от HCR. *P <0,0001 (двустранен t-тест с корекция на Welch). Оригинално увеличение, 40; 63 (увеличения на области в кутии) (C). Скала Z 50 mm (C). IFI, имунофлуоресцентно изобразяване.

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 уникално диференциално експресирани гени (допълнителна фигура S6A; допълнителна таблица S9). Анализът на свръхпредставяне показа, че уникалните диференциално експресирани гени в GEC-1 са обогатени с генни програми за клетъчна миграция и адхезия (допълнителна фигура S6, B и C; допълнителна таблица S10). Тези анализи разкриха най-ранните транскрипционни промени, които се случват в GECs като отговор на увреждане на подоцитите.

Моделирането на междуклетъчната комуникация разкрива ключови взаимодействия между типове клетки в отговор на ранно увреждане на подоцитите

След като идентифицира нарушени генни програми в няколко отделни клетъчни клъстера, изследването след това се опита да разбере как гломерулната клетка-клетъчна кръстосана връзка е повлияна от увреждане на подоцитите. Проучването първо изследва списъка с диференциално експресирани гени в клъстери на подоцити, GEC и мезангиални клетки. Експресията на два ключови автокринни просурвивални лиганда, Vegfa и Pdgfb, както и експресията на PDGFB рецептора, Pdgfrb, бяха нарушени (допълнителна таблица S6). Експресията на Vegfa е намалена във всички клъстери на подоцити (средна логаритмична промяна на пъти между 0.034 и 0.149). За разлика от това, експресията на Pdgfb беше увеличена във всички GEC клъстери (средна логаритмична промяна на кратността между 0.031 и 0,140), а рецепторът Pdgfrb беше регулиран нагоре в мезангиалните клетки (средна логаритмична промяна на кратността на 0,155). Този анализ предполага, че увреждането на подоцитите води до намалена експресия на лиганда за просървивал Vegfa, което влияе отрицателно на GEC. За да компенсират, GEC могат да регулират нагоре лиганда за просървивалност Pdgfb, задействайки мезангиалните клетки да регулират нагоре рецептора Pdgfrb.

NicheNet, нов алгоритъм, който прави изводи как взаимодействията на лигандния рецептор, получени от данни за експресия, могат да повлияят на специфични цели чрез интегриране на съществуващи знания за сигнални и регулаторни мрежи, беше използван за по-задълбочено изследване на взаимодействията лиганд-рецептор и техните предполагаеми целеви гени.20 NicheNet беше приложен към модел във взаимодействията между подоцитите и GECs, както и мезангиалните клетки и GECs, които потенциално биха могли да индуцират диференциално експресирани гени (целеви гени) в GECs в условията на увреждане на подоцитите (Фигура 4A). За този анализ всички клъстери от всеки клетъчен тип бяха комбинирани в един клъстер. Най-предсказаните лиганди, експресирани от мезангиални клетки и/или подоцити, са плейотрофин (Ptn), ангиопоетин 2 (Angpt2), Col4a1, адхезионна молекула на васкуларни клетки 1, костен морфогенетичен протеин 4 (Bmp4), Ephrin B1, фактор на растеж на съединителната тъкан и семафоринг 3e (Sema3e) (Фигура 4B). Моделът на експресия на GEC рецептори, чрез които е известно, че действат тези лиганди, е картографиран до анализа на активността на лиганда. В допълнение, предвидените целеви гени, които са диференциално експресирани в iCTCFpod / GECs в сравнение с WT контролите, също са картографирани. Резултатите на Фигура 4B са обобщени като кръгови диаграми на Фигура 4, C и D.

Няколко лиганди, рецептори и целеви гени бяха забележителни от този анализ. Плейотрофинът, лиганд, силно експресиран в мезангиалните клетки (Фигура 4В), е секретиран растежен фактор, който може да свързва и инхибира рецептора на протеин тирозин фосфатаза тип B, стимулирайки миграцията на ендотелни клетки чрез повишени Tek (Tie2)/Angpt137 и Kdr (Vegfr2)/Vegfa38 сигнализация. Съответно, Tek беше значително регулиран нагоре в GECs (Фигура 4B). Angpt2, силно експресиран в мезангиалните клетки, е антагонистичен лиганд на Tek, инхибиращ свързването на Angpt1.39 Тъй като е известно, че сигнализирането на Angpt1 насърчава оцеляването на подоцитите и нарушаването на съотношението Angpt1/Angpt2 допринася за развитието на DKD,40 този лиганд рецепторният анализ изглежда сочи неадаптивното Tek сигнализиране в GECs като едно от най-ранните последствия от увреждане на подоцитите

Това проучване също така установи значителни промени в експресията на колаген тип IV в няколко гломерулни клетки (Фигура 4B). Обикновено произведени от здрави подоцити, хетеротримерите на колаген IV преминават от ɑ1ɑ1ɑ2 към ɑ3ɑ4ɑ5 по време на гломерулното развитие, което е необходимо за правилното формиране и функциониране на GBM.33,34 Регулирането нагоре на Col4a1, заедно с разширяването на мезангиалната матрица, често се наблюдава при DKD.41,42 В настоящия анализ Col4a1 се експресира както от мезангиални клетки, така и от GECs (средна експресия на лигандна топлинна карта) (Фигура 4B) и беше специфично повишено в iCTCFpod / GECs в сравнение с WT контролите. Тези данни предполагат, че GEC регулират нагоре Col4a1 в условията на увреждане на подоцитите, което може да доведе до по-твърд, фиброзен GBM, който допринася за развитието на сегментна склероза.33

Bmp4 е силно експресиран мезангиален лиганд, идентифициран чрез NicheNet анализ (Фигура 4, BD). BMPs играят ключова роля в развитието на бъбреците и заболяването.43 Bmp4 се регулира нагоре в условията на диабетна нефропатия при плъхове,42 и лечението на мишки с диабет с анти-BMP4 антитяло предотвратява повишената регулация на Col4a1 и експанзията на мезангиалната матрица .44 От особен интерес е установено, че мезангиалният Bmp4 предизвиква експресия на GEC Smad6 (Фигура 4B). Експресията на Smad6 се индуцира от BMPs и в отрицателна обратна връзка, Smad6 специфично инхибира BMPs, включително BMP4.45 Smad6 беше регулиран надолу в iCTCFpod / GECs в сравнение с WT контролите, което предполага повишено BMP сигнализиране в ендотелните клетки в условията на увреждане на подоцитите .

Един от приоритетните лиганди, идентифицирани в подоцитите, беше Sema3e (Фигура 4, BD). Семафорините от клас 3 са секретирани протеини, които функционират в различни биологични процеси, включително ангиогенеза, лимфангиогенеза и заболяване.46 Sema3a се регулира нагоре в човешката DKD,47 и Sema3g наскоро беше идентифициран като подоцит-специфичен ген, който предпазва подоцитите от възпаление in vivo. 48 Ролята на Sema3e в подоцита остава неясна. Настоящият анализ разкрива неразпозната преди това двойка рецептор-лиганд, при която подоцит Sema3e взаимодейства с plexinD1 върху GECs, за да задейства няколко генни мишени надолу по веригата в условията на увреждане на подоцитите (Фигура 4, C и D).

Сред няколко новооткрити GEC целеви гена, Hes1 и Cx3cl1 също бяха открити в програмите за ген на адхезия, обогатени с GEC -1 (Фигура 4, BD; Допълнителна фигура S6). Hes1 е мишена на Notch сигнализиране, което играе важна роля в развиващия се бъбрек, но повторното активиране може да доведе до фиброза.49 Cx3cl1 е хемокин, произвеждан главно от гломерулен ендотел, който действа като хемоатрактант и адхезионна молекула за своя рецептор, Cx3cr1, който е повсеместно експресиран върху мононуклеарни и циркулиращи лимфни левкоцити.50 Cx3cl1 е замесен вразнообразие от бъбречни заболявания, включителноDKD, IgA нефропатия и гломерулонефрит.50 Hes1 и Cx3cl1 бяха повишени в iCTCFpod / GEC в сравнение с WT контролите, което предполага, че GEC реагират на увреждане на подоцитите чрез регулиране нагоре на провъзпалителни и профиброзни програми.

И накрая, тъй като много от лигандите и мишените, идентифицирани в анализа на NicheNet, са замесени в DKD, както при модели на гризачи, така и при хора, наборът от данни беше сравнен с набор от транскриптомни данни от едно ядро ​​на ранен човешки DKD.10 Специфичен беше направено сравнение на диференциално експресирани гени между човешки и миши клетъчни клъстери. От 138 диференциално експресирани гена в човешки DKD GECs, 25 гена също бяха идентифицирани в миши iCTCFpod / ендотелни клетки, включително Col4a1 (допълнителна фигура S7; допълнителна таблица S11). Заедно тези резултати предполагат, че програмите на ендотелните клетки, които често се нарушават при DKD при хора, могат да бъдат частично рекапитулирани в миши модел на ранно гломерулно увреждане чрез селективна аблация на подоцити. В допълнение, тези резултати предполагат, че в допълнение към подоцитите може да има потенциални ендотелиални специфични цели и терапевтични стратегии за спиране или забавяне на прогресията на сложни и силнопреобладаващи бъбречни заболявания, като напрDKD.