Спермидинът облекчава индуцираното от вътрематочна хипоксия увреждане на митохондриите на новороденото поколение при плъхове чрез инхибиране на оксидативния стрес и регулиране на контрола на качеството на митохондриите, част 2

4.4. Ефекти на спермидин върху антиоксидантната активност на миокарда и апоптозата при новородени деца, изложени на вътрематочна хипоксия

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Фенилетаноидните гликозиди Cistanche имат силна способност за пречистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху Как да използвате Cistanche Tubulosa

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Измерихме активността на антиоксидантните ензими SOD и CAT в миокарда чрез колориметрия (фигури 4A и B). Установено е, че активността на SOD и CAT в IUH групата е значително по-ниска от тази в контролната група (P < 0.05); В сравнение с групата на IUH, активността на SOD и CAT в групата на SPD се увеличи значително (P < 0.05), а DFMO премахна ефекта на SPD (P < 0). 05). Впоследствие ние оценихме клетъчната апоптоза чрез откриване на TUNEL-позитивни ядра (Фигура 4CandD) и експресията на проапоптозния протеин BAX и антиапоптозния BCl-2 (Фигури 4E и F). Забелязахме, че броят на TUNELпозитивните кардиомиоцити и съотношението на експресия на BAX/BCL2 протеин са значително по-високи в IUH групата от тези в контролната група (P <0,05). Обратно, съотношението на TUNEL-позитивните клетки и съотношението на експресия на BAX/BCL2 протеин са по-ниски в миокарда на SPD-третирани плъхове, отколкото в IUH групата (P <0.05). DFMO елиминира ефекта на SPD (P <0.05). За да обобщим, SPD, даден in utero, може да обърне намаляването на активността на антиоксидантните ензими и увеличаването на клетъчната апоптоза в сърцата на потомството, индуцирана от IUH.

4.5. Ефекти на спермидин върху производството на реактивни кислородни видове, потенциала на митохондриалната мембрана и митофагията в кардиомиоцитите, изложени на хипоксия

Митохондриалната дисфункция се проявява главно като увеличаване на производството на ROS, намаляване на синтеза на АТФ и натрупване на дисфункционални митохондрии. Потенциалът на митохондриалната мембрана (∆Ψm) е ​​протонният електрохимичен градиент (H плюс концентрационен градиент и трансмембранна потенциална разлика) през вътрешната мембрана на митохондриите, който се образува по време на преноса на електрон на митохондриалната окислителна дихателна верига, в която са малък брой ROS произведени. Съответно, нивото на ROS и промените в ∆Ψm са основните индикатори за митохондриалната функция. Прекомерното производство на ROS води до натрупване на дисфункционални митохондрии; увредените митохондриални се отстраняват главно чрез митофагия. За да проучим дали екзогенният SPD може да повлияе на целостта на митохондриалната функция в кардиомиоцитите при условия на хипоксия, първо изследвахме нивата на ROS, използвайки DHE флуоресцентна сонда (Фигура 5А). Ние наблюдавахме, че производството на ROS се увеличава, след като кардиомиоцитите са били изложени на хипоксия в продължение на 24 часа (P < 0.05) и че SPD инхибира производството на ROS, предизвикано от хипоксия (P < 0 .05); въпреки това, DFMO премахва намаляването на производството на ROS, медиирано от SPD, когато DFMO се доставя на кардиомиоцити, третирани от SPD (P < 0.05) (Фигура 5C). Освен това, ∆Ψm беше открит с помощта на TMRE флуоресцентна сонда (Фигура 5B). Колкото по-силен е интензитетът на червена флуоресценция, толкова по-висок е митохондриалният потенциал (P < 0.05). Забелязахме, че интензитетът на червената флуоресценция е значително по-нисък в IUH групата, отколкото в контролната група (P < 0.05). В сравнение с IUH групата, интензитетът на червената флуоресценция беше по-висок при лечението с SPD (P <0.05), а DFMO премахна ефектите на SPD още веднъж (P <0.05) (Фигура 5D). След това оценихме колокализацията на митохондриите (маркирани с MitoTracker зелено) с лизозомите (маркирани с Lyso-Tracker червено), което ни позволи да измерим автофагичното разграждане на митохондриите (Фигура 5E). Както е показано на фигура 5F, в сравнение с контролата, хипоксията намалява колокализацията на Mito-Tracker Green и Lyso-Tracker Red в кардиомиоцитите (P <0,05). Въпреки това, в сравнение с групата с хипоксия, процентът на колокализирани митохондрии и лизозоми е по-висок в групата на лечение с SPD (P <0,05), а DFMO премахва ефекта на SPD (P <0,05). Тези резултати предполагат, че хипоксията увеличава производството на ROS и намалява ∆Ψm и митофагията; SPD може да облекчи митохондриалното увреждане, предизвикано от хипоксия, чрез стимулиране на митофагията и инхибиране на оксидативния стрес.

4.6. Ефекти на SPD върху миокардната MQC система при новородено потомство, изложено на IUH

Контролът на качеството на митохондриите (MQC), включително процесите на митохондриална автофагия, митохондриална биосинтеза и митохондриално сливане и делене, е от решаващо значение за поддържане на нормалната морфология, количество и функция на митохондриите и осигуряване на нормалната функция и метаболизъм на клетките. Митофагията регулира MQC и медиира екстензивно автофагично разграждане на митохондриите в отговор на пътека и физиологична промяна. Първо оценихме митофагията, като наблюдавахме образуването на митофагозома с ТЕМ (Фигура 6A - C). Според резултатите, някои анормални структури или фрагментирани митохондрии са затворени в двойна мембранна автофагична мембрана, които са митофагозоми, и показват, че митофагията е активна в контролната група. Въпреки това, броят на митофагозомите силно намалява в миокарда на IUH групата. Интересното е, че миокардът на SDP групата показва почти идентични митофагични фенотипове с тези на контролната група, докато DFMO премахва ефектите, предизвикани от SPD. Митохондриите са силно динамични органели, подложени на постоянни събития на делене и сливане, свързани с тяхната функция. След това изследвахме митохондриалната фрагментация, използвайки ТЕМ (Фигура 6А). Ние открихме, че броят на малките и фрагментираните митохондрии значително се увеличава с IUH, в сравнение с контролата (P < 0.05), което показва, че митохондриалното делене е широко повишено. Тази промяна беше ограничена от лечението с SPD и DFMO също премахна ролята на SPD още веднъж (Фигура 6D). Освен това бяха открити DRP1 и MFN2 (регулиращи протеини на митохондриалната динамика) (Фигура 6E - G). MFN2 значително намалява, докато DRP1 се увеличава и се наблюдава в IUH групата в сравнение с контролната група (P < 0.05). Докато DRP1 беше регулиран надолу и MFN2 беше регулиран нагоре с лечението на екзогенен SPD (P < 0.05), DFMO премахна ефектите, предизвикани от SPD. Митохондриалната биосинтеза се координира с митофагията, за да премахне повредените или излишните митохондрии, да генерира нови митохондрии и да поддържа хомеостазата на MQC при стресови условия. И накрая, ние оценихме експресията на протеини, свързани с митохондриалната биосинтеза, включително SIRT-1, PGC-1, NRF-2 и TFAM, чрез имуноблот анализ (Фигура 6H - L). В сравнение с контролната група, експресията на SIRT-1, PGC-1, NRF-2 и TFAM намалява значително в миокарда на IHU групата (P <0,05). В сравнение с групата на IUH, протеиновите експресии на SIRT-1, PGC-1, NRF-2 и TFAM в групата на SPD значително се повишават (P <0,05). DFMO премахва ефекта на SPD (P <0.05). За да обобщим, тези резултати показват, че IUH води до дисфункция на MQC в миокарда на еднодневно потомство и че SPD лечението значително инхибира дисбаланса на MQC системата в неонаталното потомство, изложено на IUH.

5. Дискусия

Сърдечните заболявания са голямо предизвикателство за здравето в световен мащаб. Доказано е, че хроничната фетална хипоксия може да предизвика сърдечна дисфункция от фетален произход и да програмира повишен риск от сърдечни заболявания при възрастното потомство. Сърцето има висока скорост на метаболизма и зависимостта му от митохондриалната функция за производство на енергия е критична за нормалната сърдечна функция. Въпреки това, ефектът на IUH върху сърдечната митохондриална функция и свързаният с нея механизъм и фокусът на превантивната стратегия за сърдечна защита върху митохондриите в новороденото потомство все още са неизвестни. В настоящото проучване ние открихме, че еднодневните плъхове, които не са излетели, изложени на IUH, проявяват значителни аномалии в растежа и развитието, съзряването на кардиомиоцитите, особено в структурата и функцията на миокарда на митохондриите, и екзогенната добавка на SPD in utero може да облекчи този индуциран от IUH промяна чрез инхибиране на миокардния оксидативен стрес и намаляване на апоптозата. Важно е, че забелязахме, че пренаталното SPD лечение може значително да обърне аномалиите на митофагията и биогенезата и митохондриалната фрагментация в миокарда на новородени плъхове, предизвикани от IUH. Доколкото ни е известно, това изследване е първият доклад за защитния ефект на SPD върху сърдечните увреждания на новородени, предизвикани от IUH чрез регулиране на механизма MQC и след това подобряване на митохондриалната функция.

Достатъчно доказателства сочат, че вътрематочното ограничаване на растежа пречи на траекторията на развитие на феталните системи, което може да навреди на сърдечната функция по-късно в живота (5, 7, 37). В нашето проучване IUH причинява забавяне на растежа и увреждане на сърцето при новородени плъхове, тъй като еднодневните новородени плъхове, изложени на IUH, показват значително намаляване на BW и HW и увеличение на съотношението HW/BW. Освен това, подреждането на миокардните влакна е нарушено, миофиламентите са счупени, възпалителната клетъчна инфилтрация е забелязана сред миофиламентите и отлагането на колаген в миокарда е повишено. Тези констатации са в съответствие с констатациите, докладвани от Ducsay et al. (2) и Thompson et al. (7). В няколко животински модела сърцата на плода, изложени на хронична хипоксия, показват намалено съзряване и пролиферация на кардиомиоцити и намалено натрупване на кардиомиоцити (38, 39). По същия начин, нашето изследване също показа, че делът на двуядрените кардиомиоцити се е увеличил и експресията на Ki67 е намаляла в IUH групата. Времето, в което кардиомиоцитите стават дву/многоядрени, съвпада с времето, когато бозайниците губят своя регенеративен потенциал (40). Съзряването на сърцето на плода е важно за здравето на сърцето на потомството. Съответно IUH кара кардиомиоцитите да се оттеглят от клетъчния цикъл преди време, а нарушението на узряването на кардиомиоцитите води до нарушена пластичност на постнаталния сърдечен растеж.

Излишно е да отбелязваме, че митохондриите са основните клетъчни органели, участващи в производството на ROS; дисфункционалните митохондрии не се произвеждат само в отговор на намаленото производство на АТФ, но също и на повишен оксидативен стрес и апоптоза (41). В това проучване IUH значително намалява активността на антиоксидантните ензими SOD и CAT, намалява митохондриалната дихателна функция и нивата на АТФ, повишава експресията на BAX/BCL2 и нарушава митохондриалната структура в миокарда на еднодневни новородени плъхове. Тези констатации са подкрепени от други изследователи (11), които документираха, че излагането на хронична хипоксия на майката по време на бременност може да намали активността на митохондриалния комплекс IV и да предизвика апоптоза в сърцата на плъхове в близко бъдеще. Ние твърдяхме, че митохондриалният компромис може да е в основата на оксидативния стрес и енергийната недостатъчност по време на феталното развитие, което завършва с перинатално сърдечно увреждане. Това може да бъде основната причина за повишен сърдечно-съдов риск при потомството на бременност, усложнена от хронична фетална хипоксия. Съответно, възможно е митохондриалните да се приемат като цел на терапевтична интервенция за защита на сърдечната функция в потомството. Aljunaidy и др. съобщават, че лечението на майката с митохондриален антиоксидант MitoQ предотвратява плацентния оксидативен стрес, спасява растежа на плода и подобрява сърдечната функция при потомство, изложено на IUH (42).

Спермидинът е полиамин с различни биологични функции. Както споменахме, SPD може да инхибира индуцираното от H2O2- натрупване на ROS и да предотврати намаляването на потенциала на митохондриалната мембрана (MMP) и нивата на ATP в култивирани кардиомиоцити на новородени плъхове и H9C2 клетки. Освен това, SPD може да стимулира митохондриалната биогенеза и да подобри митохондриалната функция в стареещото сърце (43). Полиамините спермин и спермидин могат да повлияят на динамичния митохондриален протеом, като по този начин предотвратяват свързаните с възрастта промени в сърдечните функции и стареенето на сърцето (36). Други проучвания също показват, че добавката на SPD забавя стареенето на сърцето чрез засилване на митофагията и насърчаване на митохондриалното дишане при мишки (44). ODC е ключов ензим за синтеза на полиамини и се съобщава, че in vivo нокдаунът на ODC или прилагането на DFMO, необратим инхибитор на ODC води до нарушено развитие на концепцията и забавяне на растежа на плода поради недостатъчната наличност на полиамини (45, 46). Настоящото ни проучване показва, че лечението с 5 mg/kg/d SPD при плъхове, изложени на IUH, предотвратява забавянето на растежа и промяната на сърдечната морфологична структура и съзряване при новородени потомци. Освен това, индуцираното от IUH усилване на сърдечния оксидативен стрес, увеличаване на апоптозата и митохондриален респираторен спад в неонаталното потомство също бяха предотвратени от SPD, докато DFMO, даден на майката, премахна SPD-медиираната защита за неонаталното сърце. Добре документирано е, че полиамините участват в плацентната ангиогенеза и ембриогенеза, както и в ембрионалния и фетален растеж и развитие (47). Zhu и др. съобщава, че нивата на полиамин са по-ниски в плазмата на пъпната вена от фетуси на свине с вътрематочно ограничаване на растежа (IUGR) и допълнителният SPD към майката може да предотврати IUGR (48). Спермидинът е съединение с разумна безопасност и по-ниска токсичност (49). Нарастващият брой предклинични и клинични проучвания показват, че хранителният SPD има ефекти върху здравето, като спиране на стареенето, защита на сърдечно-съдовата система, невромодулация и противовъзпалителни функции, като например интраперитонеалното инжектиране на SPD (50 mg/kg) при мишки предпазва от индуцирани от колаген артрит чрез инхибиране на поляризацията на М1 макрофагите в синовиалната тъкан (50). Добавянето на 10 mg/kg/ден SPD обръща свързаното с възрастта сърдечно влошаване при плъхове (36). По-важното е, че майката е била интервенция с 5 mg/kg/ден SPD по време на късна бременност за подобряване на индуцираното от IUH когнитивно и нервно увреждане (51) и увреждане на сърцето от оксидативен стрес при потомството на плъх (32). Съответно използвахме същата доза SPD (5 mg/kg/d) за бременни плъхове, изложени на IUH, както в нашето предишно проучване. Подозирахме, че добавянето на SPD от майката по време на хипоксична бременност може да повиши нивата на SPD в кръвообращението на плода, което може да е свързано със защита срещу оксидативен стрес, водещ до плацентата, която ще защити митохондриите в развиващото се сърце от програмирането от IUH, действието на SPD може да се постигне чрез неговия мощен антиоксидантен, антиапоптозен и насърчаващ пролиферацията механизъм.

Механизмите за контрол на качеството на митохондриите са от съществено значение за поддържане на нормалната морфология, брой и функция на митохондриите и осигуряване на нормалната функция и метаболизъм на клетките (16). Последните доказателства разкриха, че механизмите на MQC играят решаваща роля в перинаталното съзряване на миокарда на митохондриите и развитието на сърцето (14). Гонг и др. първи съобщава, че незрелите митохондрии, подобни на плода, се разграждат директно от медиирана от Паркин митофагия по време на ранния постнатален период (19). Междувременно митохондриалната биогенеза се увеличава драстично (52), а факторите на митохондриалното сливане и делене се транскрипционно регулират нагоре в сърцето след раждането (20, 21). Въпреки това, много по-малко се знае за ефекта на IUH върху MCQ в миокарда на новороденото потомство. В това проучване първо наблюдавахме, че броят на митофагозомите намалява значително в миокарда на IUH групата, което показва, че IUH нарушава миокардната митофагия на новородени плъхове. След това наблюдавахме значително намалена експресия на PGC-1 (ключов регулатор на митохондриалната биогенеза) и експресията на неговите сигнални молекули нагоре и надолу по веригата, включително SIRT-1, TFAM и NRF{{10} } в миокарда от IUH групата. Освен това открихме, че експозицията на IUH прави по-малки или фрагментирани митохондрии и експресията на DRP1 се увеличава; обаче, експресията на MFN2 намалява в миокарда на новородено потомство на плъх, което предполага, че митохондриалното делене е регулирано нагоре и сливането е регулирано надолу. Тези констатации отразяват причинно-следствената връзка между дисбаланса на механизма на MQC и индуцираното от IUH увреждане на миокарда при новородено потомство. Тези сложни MQC процеси функционират съвместно един с друг, за да елиминират дисфункционалните митохондрии по специфичен и целенасочен начин и да координират биогенезата на нови органели, което е от съществено значение за сърдечно-съдовата хомеостаза. Много вътреклетъчни и извънклетъчни сигнали могат да регулират MQC събитията, включително оксидативен стрес, потенциален колапс на мембраната, апоптоза и други. Тук дисбалансът на митохондриалния MQC може да се отдаде на засилен оксидативен стрес и повишена апоптоза в сърцето на плъхове потомство, изложени на IUH. Съответно, от съществено значение е да се поддържа подходящ MQC механизъм, за да се осигури здрава митохондриална мрежа в сърцето на новороденото потомство, изложено на IUH.

Като се има предвид, че плацентарните нива на SPD са силно свързани с ограничаване на растежа на плода (53), SPD може да регулира MQC в различен животински модел. Например, SPD е мощен и специфичен индуктор на автофагия за разширяване на продължителността на живота, което може да защити процеса на стареене на няколко тъкани, включително сърцето, мозъка и скелетните мускули (44, 54, 55). Спермидинът може да облекчи стареенето на сърцето чрез подобряване на митохондриалната биогенеза (43). В това проучване ние приложихме SPD към мишки майки и открихме, че SPD може да нормализира дисбаланса на миокардния MQC в потомството, изложено на IUH. Въпреки това, лечението на майката с ODC инхибитор DFMO премахва ефектите на SPD, което показва, че интервенцията на SPD може да предотврати анормалния MQC в миокарда на еднодневни плъхове, изложени на IUH. За да обобщим, отличната работа на MQC в миокарда на новородено потомство може да подобри структурата, функцията и съзряването на митохондриите, като по този начин реализира трансформацията от вътрематочен капацитет за гликолиза към енергийно снабдяване на постнатално окисление на мастни киселини и посреща нарастващото сърдечно натоварване след раждането . Освен това, нашият експеримент върху кардиомиоцити предполага, че SPD може да инхибира увеличаването на производството на ROS, предизвикано от хипоксия, намаляването на ∆Ψm и нарушеното автофагично разграждане на митохондриите. Ние заключихме, че благоприятните ефекти на SPD могат да се дължат на повишените нива на SPD в плацентата и кръвообращението чрез прилагане на SPD на майката, като по този начин защитава миокардните митохондриални потомци от програмиране на развитие от IUH.

5.1. Заключение

Настоящото проучване подчертава, че SPD терапията in utero може да защити миокарда на един ден - сърцето на потомството от неблагоприятните ефекти на пренаталната хипоксия. Тези постнатални промени, причинени от SPD, могат да бъдат постигнати чрез антиоксидант и антиапоптоза и чрез регулиране на MQC пътищата, като по този начин се намалява митохондриалното развитие, програмирано в сърцето, изложено на IUH. Има някои ограничения за това проучване. Не сме извършили фармакокинетични експерименти върху SPD и по този начин не можем да определим точните нива на SPD в кръвообращението на плода, когато на майката е приложен SPD. В нашите бъдещи проучвания ще проучим допълнително ефективната концентрация на SPD в кръвта, използвайки плацентата на плода. Настоящите констатации предоставят нова рамка за бъдещи проучвания за определяне на ролите на SPD в предотвратяването на миокардните митохондрии на IUH новородено потомство.

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】