Промитотично действие на Oenothera Biennis върху стареещи човешки дермални фибробласти, част 1
Jul 04, 2023
Резюме: Натрупването на стареещи дермални фибробласти стимулира стареенето на кожата. Реактивирането на пролиферацията е една стратегия за модулиране на клетъчното стареене. Наскоро докладвахме точния химичен състав на хидрофилния екстракт от клетъчни култури на Oenothera biennis (ObHEx) и показахме неговите свойства против стареене на кожата. Тази работа има за цел да оцени неговия биологичен ефект конкретно върху клетъчното стареене. Действието на ObHEx е оценено върху нормални човешки дермални фибробласти, подложени на индуцирано от стрес преждевременно стареене (SIPS) чрез ултра-дълбок протеомен анализ, което води до най-глобалния протеом, свързан със стареенето досега. Данните от масспектрометрията показват, че лечението с ObHEx възстановява нивата на ключови митотични протеини, силно понижени в стареещите клетки. За да потвърдим нашите открития от протеомиката, доказахме, че ObHEx може отчасти да възстанови активността на „свързаната със стареенето ß-галактозидаза“, най-често срещаният отличителен белег на стареещите клетки. Освен това, за да се прецени дали регулирането на нивата на митотичния протеин се превръща в повторно влизане в клетъчния цикъл, бяха проведени FACS експерименти, демонстриращи малко, но значително реактивиране на старееща клетъчна пролиферация от ObHEx. В заключение, свързаното със стареенето глобално профилиране на протеоми, публикувано тук, предоставя панел от стотици протеини, дерегулирани от SIPS, които могат да бъдат използвани от общността за по-нататъшно разбиране на стареенето и ефекта от нови потенциални модулатори. Освен това, протеомичният анализ сочи специфичен промитотичен ефект на ObHEx върху стареещи клетки. Затова предлагаме ObHEx като мощен адювант срещу стареенето, свързано със стареенето на кожата.
Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.
Кликнете върху добавката Cistanche Tubulosa
【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
Ключови думи: Хидрофилен екстракт от Oenothera biennis; стареене; фибробласти; протеомика; масспектрометрия; диаПАСЕФ; митоза; стареене на кожата
1. Въведение
Стареенето е основната причина за стареенето и свързаните с възрастта заболявания. Стареещите клетки претърпяват спиране на пролиферацията като отговор на физиологична ерозия на теломерите (репликативно стареене) или на стресови задействания, включително увреждане на ДНК, оксидативен стрес, разтягане на органели и онкогенно активиране (предизвикано от стрес преждевременно стареене, SIPS) [1]. Въпреки спирането на растежа, индуцирано от реакцията на увреждане на ДНК (DDR), стареещите клетки показват високо метаболитно състояние и лизозомна активност, от решаващо значение за тяхната повишена секреторна активност, известна като секреторен фенотип, свързан със стареенето (SASP) [2,3]. SASP факторите включват няколко семейства разтворими (интерлевкини, хемокини, растежни фактори, секретирани протеази) и неразтворими (секретирани неразтворими протеини и компоненти на извънклетъчния матрикс) протеини, които влияят отрицателно на околната тъкан, генерирайки хронично нискостепенно възпалително състояние.
Натрупването на стареещи фибробласти в дермата води до стареене на кожата, нарушавайки целостта на извънклетъчния матрикс (ECM) и функцията на съседните микроваскуларни ендотелни клетки, епидермални меланоцити и кератиноцити [4–6]. Трите основни стратегии за противодействие на стареенето включват (i) изчистване на стареещите клетки чрез индуциране на апоптоза или имунна активация; (ii) модулирането на SASP и (iii) повторното активиране на клетъчната пролиферация. В действителност, въпреки че първоначално стареенето е описано като необратимо спиране на клетъчния цикъл, настоящите доказателства сочат, че пролиферацията може да бъде възстановена [7–9].
В този сценарий съставките, способни да предотвратят и/или модулират клетъчното стареене, са от голям интерес в козметичната област като ценни оръжия за противодействие на стареенето на кожата. По-специално, екстракти, получени от вида Oenothera biennis (O. biennis, Evening Primrose), принадлежащи към семейство Onagraceae, традиционно се използват за козметични приложения поради тяхната противовъзпалителна и антиоксидантна активност [10]. Метанолните екстракти, приготвени от надземни части и водните екстракти от листа, съдържат главно фенолни киселини и флавоноиди, докато метанолните екстракти, получени от корени, съдържат предимно стероли и тритерпени [11]. Въпреки че биологичната активност на алкохолните и хидроалкохолните екстракти от надземни части е демонстрирана [12–14], най-често използваните екстракти от O. biennis са маслата, получени от семена, които са изключително богати на мастни киселини. Наистина, тъй като високото им съдържание на линолова киселина (LA) и линоленова киселина (GLA), маслата от семена на O. biennis подобряват правилното функциониране на кожата и по-специално са показали благоприятни ефекти при пациенти с хроничен дерматит [11, 15].
Съвсем наскоро беше предложено, че екстракти, получени от клетъчни култури на O. biennis, напълно заместват екстракти от спонтанни растения, тъй като те са биоустойчиви, свободни от замърсители и стандартизирани смеси от вторични метаболити [16]. Именно комбинацията от съединенията с техния синергичен ефект е отговорна за цялостната активност на растителните екстракти [17].
Тук се съсредоточихме върху хидрофилния екстракт от клетъчни култури на O. biennis (ObHEx), богат на лигнани и тритерпени, тъй като той показа свойства против стареене на кожата при тестване в in vitro и ex vivo модели [18]. Химическата характеристика на този екстракт, базирана на масспектрометрия, разкрива, че той съдържа няколко класа интересни вторични метаболити. Те принадлежат към лигнани (салвадоразид и лириодендрон) и тритерпени (муриатична киселина, аржунолова киселина, аспарагинова киселина и хедерагенин), някои от които преди това са били свързвани с производството на проколаген I в човешки фибробласти [19,20]. По-специално, преди това доказахме, че ObHEx насърчава свиването на матричния колаген, полимеризацията на актин и производството на ECM протеини, като по този начин подобрява твърдостта и еластичността на кожата, чрез увеличаване на експресията на гена на миозин леката верига киназа (MYLK).
Към днешна дата молекулярните механизми на ефектите на ObHEx върху стареенето на кожата и по-специално клетъчното стареене не са изследвани. Тази работа има за цел да изследва активността на ObHEx върху стареещи човешки дермални фибробласти. Използвахме независим от данните масспектрометричен ултра-дълбок протеомичен подход, за да получим намеци за механизма на действие и био-ортогонални методи, за да го валидираме и изследваме (Фигура 1).
2. Резултати
Индуцираното от стрес преждевременно стареене (SIPS) се извършва в нормални човешки дермални фибробласти (NHDF) чрез третиране с водороден пероксид (H2O2). Стареещите клетки, предизвикани от окислителен стрес, са отличен in vitro модел за изследване на стареенето и H2O2 се използва широко за постигането му [21,22].
За да разберем биологичните пътища, променени от ObHEx върху стареещи NHDF клетки, използвахме ултра-дълбок протеомичен подход. SIPS и контролните клетки бяха третирани или не в продължение на 48 часа с екстракта при 0.01 процента (p/v), тъй като от МТТ анализа, докладван в [18], това води до най-високата концентрация, която не причинява всякаква клетъчна токсичност след 48 часа инкубация.
След това клетъчните лизати се подлагат на триптично смилане и нано-UPLC MS/MS анализ. За да се постигне оптимална дълбочина на протеома, масспектрометричните данни бяха получени в режим на независимо събиране на данни (DIA), което позволи стабилно количествено определяне на 9650 протеина (Таблица S1), с пълнота на данните от 98 процента. Нашето проучване отчита най-пълния протеомен анализ на стареещи клетки до момента.
2.1. Оценка на предизвиканото от стрес преждевременно стареене (SIPS).
На първо място, проверихме дали индукцията на стареене в NHDF е била успешна, анализирайки глобалния протеом на третирания с H2O2-NHDF чрез масова спектрометрия (MS) и изследвайки тяхната морфология чрез поточна цитометрия.
2.1.1. SIPS оценка чрез масспектрометрия (MS)
За да оценим индукцията на SIPS, сравнихме общия протеом на H2O2-третирани NHDF клетки спрямо нетретирани. Сред 3256 протеина, които са били дерегулирани, е установено, че няколко биомаркера на стареене са значително променени (Фигура 2A, B). Първо, наблюдавахме повишаване на регулацията на най-широко използвания биомаркер на стареещи клетки, „свързаната със стареенето ß-галактозидаза“ (SA- -gal, GLB1). Повишените нива на лизозомните ензими GLB1 и тъканната алфа-L-фукозидаза (FUCA1), за които също е установено, че са регулирани нагоре от MS, отразяват характерното нарастване на лизозомното съдържание на стареещите клетки [23,24]. Наистина, лизозомите благоприятстват катаболните процеси, които осигуряват енергия и суровини, необходими за секрецията, свързана със стареенето [25].
Второ, нивото на протеин на серин/треонин-протеин киназа ATR и серин-протеин киназа ATM, и двете участващи в DDR сигнализирането, също беше установено, че е повишено [26]. DDR се активира от увреждане на ядрената ДНК, обикновено свързано с установяването на клетъчно стареене, и се слива в активирането на туморен супресор р53. В допълнение към това, регулирането нагоре на хистоновите 2A варианти MACROH2A1 и MACRO2A2 също е наблюдавано. Тези протеини участват в ATR-зависимото образуване на асоциирани със стареенето хетерохроматинови фокуси (SAHFs), плътни и репресивни хроматинови структури, характерни за стареещите клетки [1,2,27].
И накрая, дерегулираните нива на циклин-зависим киназен инхибитор 1A или p21 (CDK1NA) и пролиферационен маркерен протеин Ki-67 (MKI67) отразяват спирането на стареещия клетъчен цикъл във фазата G2 [28,29]. Наистина, p21 повишава нивата, насърчавани от индуцирана от увреждане на ДНК p53 пътека, и инхибира CDK2-циклин Е комплекса. Това причинява дефосфорилиране на ретинобластомния протеин (RB), който в своето хипофосфорилирано състояние отделя E2F, транскрипционен фактор, който благоприятства прогресията на клетъчния цикъл [2].
Отвъд тези вече известни маркери на стареене, по-широк анализ на обогатяване на пътя на най-регулираните протеини в третирани с H2O2 спрямо контролни клетки сочи към активиране на пътя p53/p21, индуцирано от увреждане на ДНК (Фигура 2C, Таблица S2). Вместо това, протеините, свързани с пролиферацията и митозата, се регулират надолу, което сочи към последващото спиране на пролиферацията (Фигура 2D, Таблица S3).
2.1.2. SIPS оценка чрез поточна цитометрия
SIPS също е потвърден чрез анализ на поточна цитометрия. Наблюдавахме увеличаване на цитоплазмената грануларност на клетките, третирани с H2O2- (Фигура S1A, B), поради увеличаването на броя и размера на лизозомите в стареещите клетки. Това е резултат от баланса между постепенното натрупване на дисфункционални лизозоми и производството на нови [25]. Нещо повече, ние също открихме интра-лизозомно натрупване на липофусцинови агресоми: този растеж, свързан с увеличаване на автофлуоресценцията в 525/50 nm лентовия канал на поточния цитометър, е друг маркер за стареене, свързан с лизозомна неизправност (Фигура S1C, Г) [30].
2.2. ObHEx частично възстановени митотични протеини, регулирани надолу в стареещи NHDF клетки
Лечението с ObHEx успя частично да възстанови нивата на 71 протеина, дерегулирани в състояние на стареене (двупосочен ANOVA тест q-стойност < 0.05). По-точно, 46 протеина бяха регулирани надолу от екстракта и 25 бяха регулирани нагоре (Фигура 3A, Таблици S4 и S5).
Анализът на обогатяване на реактома на 46 протеина, чиито нива са намалени от ObHEx, предполага, че екстрактът може да намали активирането на пътя на p53 и да повлияе на метаболизма на фосфатидилинозитола и Hedgehog сигнализирането, чиито промени са открити при стареене [31,32] (Фигура 3B, Таблица S6).
По отношение на 25-те регулирани нагоре протеини, анализът на обогатяването сочи към реактивиране на пътя на митотичния клетъчен цикъл и по-специално до размотаване и репликация на ДНК, хромозомна кондензация и разделяне на сестрински хроматиди (Фигура 3C, Таблица S7).
Един задълбочен анализ показва, че 18 от 25-те възстановени протеини се групират силно заедно (Фигура 4А). В този клъстер е възможно да се различат CDK1, всички субединици на комплекса кондензин I (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH и NCAPG), три протеина, свързани с кинетохора (KNTC1, NUF2 и TRIP13), всичките шест субединици на репликативния минихромозомен поддържащ комплекс (MCM) (MCM2-7) заедно с IQGAP3, PBK и DHFR.
Способността на ObHEx да възстановява частично нивата на тези протеини е показана добре в профилните диаграми на Фигура 4B: нивата на протеинова експресия са предимно непроменени в пролифериращите клетки, третирани или не с екстракта, намалени в стареещите клетки и частично повишени след Лечение с ObHEx.
2.3. Биологичните анализи потвърждават Promitotic Механизъм на действие на ObHEx
Най-често срещаният отличителен белег на стареещите клетки е повишената активност на SA{{0}}gal, която може да бъде оценена чрез тест за оцветяване. Нашите резултати показват, че лечението с H2O2 предизвиква значително увеличение на броя на SA- -gal положителни клетки (сини), от 4,7 процента до 22,9 процента (Фигура 5A, B). Инкубацията на ObHEx значително намалява активността на SA- -gal с намаление от 38,4 процента (p <0,01).
Освен това, за да се прецени дали възстановяването на експресията на митотичен протеин от ObHEx се превръща в реактивиране на клетъчния цикъл, контролните и стареещите клетки бяха третирани или не с екстракта за 72 часа и бяха проведени експерименти за флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS). Резултатите от стареещите клетки показват блок във фазите G2/M на клетъчния цикъл (36,8 процента), докато само много по-ниска част от контролните клетки (7,2 процента) са били в тези фази, откакто са достигнали сливане, според литературата [ 33] (Фигура 5C, D). Третирането на стареещи клетки с ObHEx успя да намали популацията G2/M с 4,3 процента (p < 0.05). Трябва да се отбележи, че когато се свърже с частта на стареещите клетки след SIPS (22,9 процента), изходът от G2/M може да се оцени на 18,9 процента. Проведено е същото третиране с ObHEx за 48 часа, но резултатите не са статистически значими.
【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
