Спайк и Nsp6 са ключови детерминанти на затихването на SARS-CoV-2 Omicron BA.1

Вариантът SARS-CoV-2 Omicron е по-устойчив на имунитета и по-малко вирулентен от други основни вирусни варианти, които досега са били разпознати1-12. Протеинът Omicron spike (S), който има необичайно голям брой мутации, се счита за основния двигател на тези фенотипове. Тук генерирахме химерен рекомбинантен SARS-CoV-2, кодиращ S гена на Omicron (BA.1 линия) в гръбнака на наследствен SARS-CoV-2 изолат и сравнихме този вирус с естествено циркулиращия Omicron вариант. Вирусът, носещ Omicron S, успя да избяга от индуцирания от ваксината хуморален имунитет, главно поради мутации в рецептор-свързващия мотив; въпреки това, за разлика от естествено срещащия се Омикрон, той ефективно се възпроизвежда в клетъчни линии и първично-подобни дистални белодробни клетки. По подобен начин, при K18-hACE2 мишки, въпреки че носещият вирус Omicron S причинява по-леко заболяване от наследствения вирус, неговата вирулентност не е отслабена до нивото на Omicron. По-нататъшно изследване показа, че мутиращият неструктурен протеин 6 (nsp6) в допълнение към S протеина е достатъчен за рекапитулация на атенюирания фенотип на Omicron. Това показва, че въпреки че избягването на ваксината на Omicron се задвижва от мутации в S, патогенността на Omicron се определя от мутации както във, така и извън S протеина.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Към декември 2022 г. последователните вълни на пандемията от COVID{1}} се движат от пет основни варианта на SARS-CoV-2, известни като тревожни варианти (VOC): Алфа (B.1.1.7) , Бета (B.1.351), Гама (P.1), Делта (B.1.617.2 и AY линии) и Omicron (BA линии)13. Omicron е най-скоро признатият VOC и е документиран за първи път в Южна Африка, Ботсвана и от пътешественик от Южна Африка в Хонг Конг през ноември 2021 г. (GISAID ID: EPI_ISL_7605742)14, 15. Той бързо обхвана света, измествайки предишния доминиращ вариант Делта за седмици и представлявайки повечето нови инфекции със SARS-CoV-2 до януари 2022 г. (реф. 16–18). Досега са идентифицирани най-малко пет линии на Omicron: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4 и BA.5. BA.1 (наричан по-нататък Omicron) показва забележително избягване на хуморален имунитет, индуциран от инфекция и ваксина3,19. Освен това, той е по-малко вирулентен от други ЛОС при хора и in vivo модели на инфекция4,5,7,11,12,20. Omicron се различава от прототипа SARS-CoV-2 изолат, Wuhan-Hu-1, с 59 аминокиселини; 37 от тези промени са в S протеина, което повишава възможността S да е в основата на патогенното и антигенно поведение на Omicron.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

S мутациите засягат репликацията на Omicron в клетъчната култура

Протеинът Omicron S съдържа 30 аминокиселинни замествания, 6 делеции и едно вмъкване на 3 аминокиселини по дължина, в сравнение с Wuhan-Hu-1 (разширени данни Фиг. 1). Двадесет и пет от тези промени са уникални за Omicron в сравнение с други летливи органични съединения, въпреки че някои от тях са докладвани в отпадъчни води и второстепенни варианти на SARS-CoV-221,22. За да тестваме ролята на S протеина във фенотипа на Omicron, ние генерирахме химерен рекомбинантен вирус, съдържащ S гена на Omicron (USA-lh01/2021) и всички други гени на предшественик на SARS-CoV-2 (GISAID EPI{ {16}}ISL_2732373)23 (Разширени данни Фиг. 2а). Този химерен вирус, наречен Omi-S, е направен чрез използване на модифицирана форма на кръгова реакция на удължаване на полимераза (CPER)24 (разширени данни Фиг. 2b), която дава силно концентрирани вирусни запаси, съдържащи 0,5 × 106 –5 × 106 образуващи плака единици (PFU) на ml, от трансфектирани клетки в рамките на два дни след трансфекцията (разширени данни Фиг. 2c, d), премахвайки необходимостта от по-нататъшна вирусна амплификация.

Фиг. 1|Ефект на S върху кинетиката на растеж in vitro на Omicron. схема на вируси. S, шип; N, нуклеокапсид. b–e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 клетки (b,d) и Vero E6 клетки (c,e) бяха инфектирани при MOI от 0.01 и процентът на N-позитивните клетки (n=6 реплики) (b,c) и освобождаването на инфекциозни частици (n=3 реплики) (d,e) бяха определени чрез поточна цитометрия и чрез анализ на плака, съответно. f, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 клетки бяха инфектирани с вирусни смеси в съотношение 1:1, за да се получи крайният MOI от 0.005 за всеки вирус . Клетките се фиксират в посочените времена и се подлагат на поточна цитометрия. Вляво, представителна точкова диаграма; вдясно, процент неинфектирани, инфектирани с Omi-S/mCherry, инфектирани с Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG) и двойно инфектирани клетки. Единично инфектирани клетки бяха използвани за компенсация. Ленти за грешки, средно ± sd (n {{20}} повторения). g, размери на плаките. Вляво, представителни изображения на плаки върху ACE2/TMPRSS2/ Caco-2 клетки. Вдясно, диаметърът на плаките е начертан като средно ± sd от 20 плаки на вирус. h, човешки iAT2 епителни клетки бяха инфектирани при MOI от 2, 5 за 48 часа или 96 часа. Апикалната страна на клетките се промива с 1 × буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) и нивата на инфекциозни вирусни частици се измерват чрез анализ на плака. Ленти за грешки, средно ± sd (n=4 повторения). Експериментите се повтарят два пъти, като всяко експериментално повторение съдържа 3 (b–g) или 4 (h) повторения. Стойностите на P бяха изчислени чрез двустранен, несдвоен t-тест с корекцията на Welch. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; NS, незначително. Стратегията за стробиране за поточна цитометрия е показана на допълнителна фигура 1.

Първо сравнихме ефективността на инфекцията на Omi-S с наследствен D614G-съдържащ вирус (GISAID EPI_ISL_2732373; генериран от CPER; по-нататък наричан див тип (WT)) и изолат на Omicron (САЩ-lh01/2021) в клетъчна култура (фиг. 1а). За целта ние заразихме ACE2- и TMPRSS2-експресиращи Caco-2 (наричани по-долу ACE2/TMPRSS2/Caco-2) и Vero E6 клетки с Omi-S, WT и Omicron при множественост на инфекцията (MOI) от 0,01 и проследяване на вирусното размножаване чрез поточна цитометрия и тест за образуване на плака. Вирусът WT и Omi-S се разпространяват бързо в ACE2/TMPRSS2/Caco-2 клетки, давайки съответно 89% и 80% инфектирани клетки на 24 часа след заразяването (HPI) (Фиг. 1b). За разлика от това, Omicron се репликира по-бавно, което води до 48% заразени клетки при 24 hpi. Подобен модел се наблюдава в клетките Vero E6, в които 60% и 41% от клетките са положителни за WT и Omi-S, съответно, при 48 hpi, за разлика от 10% за Omicron (фиг. 1c). Анализът на плаката показа, че въпреки че Omi-S и Omicron произвеждат по-ниски нива на инфекциозни вирусни частици в сравнение с WT, вирусният титър на Omi-S е значително по-висок от този на Omicron. В ACE2/TMPRSS2/Caco-2 клетки Omi-S произвежда 5.1-кратно (P=0.0006) и 5.5-кратно (P {{49} }.0312) по-инфекциозни частици от Omicron съответно при 12 hpi и 24 hpi (фиг. 1d). По същия начин, в клетки Vero E6, инфекциозните вирусни титри на Omi-S бяха 17-кратно (P=0.0080) и 11-кратно (P=0.0078) по-високи от тази на Omicron съответно при 24 hpi и 48 hpi (фиг. 1e). Разликата между вирусите става по-малко очевидна в по-късни времеви точки поради по-високата цитотоксичност, причинена от Omi-S в сравнение с Omicron (Разширени данни Фиг. 3a). Повишената ефективност на репликация на Omi-S в сравнение с Omicron се запазва при тестване при различни MOI (разширени данни Фиг. 3b). Освен това потвърдихме фитнес предимството на Omi-S пред Omicron чрез директен конкурентен анализ. За тази цел първо генерирахме рекомбинантен Omicron (микрон), който в нашите анализи на клетъчни култури имитира кинетиката на репликация на естествения Omicron (Разширени данни Фиг. 4). След това създадохме Omi-S, съдържащ mCherry и Omicron, съдържащ mNeonGreen, и инокулирахме ACE2/TMPRSS2/Caco-2 клетки с тези вируси, смесени в съотношение 1:1. Поточен цитометричен анализ на заразени клетки в различни моменти на инфекция показа, че Omi-S/mCherry е ясно по-добър от Omicron/mNeonGreen по отношение на репликацията (фиг. 1f). И накрая, по-високата инфекциозна ефективност на Omi-S също се отразява в размера на плаката; въпреки че WT вирусът произвежда най-големите плаки (около 4,1 mm), размерът на плаките Omi-S (около 2,2 mm) е два пъти (P <0,0001) по-голям от този на плаките Omicron (около 1,1 mm) (фиг. 1g). Тези резултати показват, че въпреки че мутациите в S протеина влияят на ефективността на инфекцията на Omicron, те не обясняват напълно фенотипа на Omicron.

Няколко доказателства показват, че S протеинът, включен в Omi-S, се държи по същия начин, както в естествения Omicron. Например, както е описано по-рано 20, 25, Omicron S беше слабо разцепен в сравнение с WT S; докато 71% от S в WT вириони е в разцепена форма, само 45% и 47% са разцепени съответно в Omi-S и Omicron (Разширени данни Фиг. 5а). Същият модел на S разцепване беше очевиден в клетки, заразени с вирус (WT, 63% разцепени; Omi-S, 33% разцепени; Omicron, 42% разцепени) (Разширени данни Фиг. 5b). Тези експерименти също разкриха, че Omicron S е неефективно включен във вирусни частици в сравнение с WT S (съотношение S към нуклеокапсид (N): 3,40 за WT вирус, 1,91 за Omi-S и 2,04 за Omicron) (Разширени данни Фиг. 5а). По подобен начин и Omi-S, и Omicron произвеждат по-малък синцитий в сравнение с WT вируса, наблюдение, което преди това е докладвано за Omicron20,26 (Разширени данни Фиг. 5c). И накрая, в съответствие с публикуваната литература25, Omi-S и Omicron показаха предпочитание за медиирано от катепсин навлизане, което се отразява от тяхната по-висока чувствителност към инхибитора на катепсина E64d (Разширени данни Фиг. 6). След това сравнихме кинетиката на репликация на WT, Omi-S и Omicron в белодробни епителни клетки, които образуват основно място за вирусна репликация при пациенти с COVID-19 (реф. 27,28). Съответно, ние използвахме човешки индуцирани плурипотентни стволови (iPS) клетки, получени от белодробни алвеоларни тип 2 епителни клетки (iAT2). AT2 клетките представляват основна клетъчна популация в дисталния белодробен дроб и съставляват една от основните мишени на SARS-CoV-2 инфекцията28,29. Инфектирахме iAT2 клетки, отгледани като култура на интерфейс въздух-течност (ALI), при MOI от 2, 5 и наблюдавахме секрецията на вирусно потомство от апикалната страна на клетките при 48 hpi и 96 hp. В съответствие с резултатите, получени от клетъчни линии, WT вирусът произвежда най-високите нива на инфекциозни вирусни частици (фиг. 1h). Сред Omi-S и Omicron, първият дава около пет пъти (P=0.0008) по-висок инфекциозен вирусен титър при 48 к.с. Вирусните титри за WT и Omi-S намаляват при 96 dpi в сравнение с 48 hp поради цитопатичния ефект (CPE) на инфекцията. Въпреки това не е наблюдаван CPE за Omicron, което води до продължително производство на инфекциозни вириони. Като цяло тези резултати потвърждават заключението, че мутациите в S не отчитат напълно атенюирания репликационен капацитет на Omicron в клетъчната култура.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Минимална роля на S в патогенността на Omicron при мишки

За да проверим дали Omi-S проявява по-висока годност in vivo в сравнение с Omicron, ние изследвахме резултата от инфекцията с Omi-S спрямо WT SARS-CoV-2 и Omicron при K18-hACE2 мишки. В съгласие с публикуваната литература4,5, интраназалната инокулация на мишки (на възраст 12–20 седмици) с Omicron (104 PFU на мишка) не причинява значителна загуба на тегло, докато инокулацията с WT вирус предизвиква бързо намаляване на телесното тегло, при всички мишки губят над 20% от първоначалното си телесно тегло до 8 дни след инфекцията (dpi) (фиг. 2а). Трябва да се отбележи, че 80% от мишките, заразени с Omi-S, също са загубили над 20% от телесното си тегло с 9 dpi (фиг. 2а и разширени данни, фиг. 7а). Оценката на клиничните резултати (кумулативна мярка за загуба на тегло, необичайно дишане, необичаен външен вид, намалена реакция и променено поведение) също разкрива подобен модел; докато инфектираните с Omicron мишки показват малко или никакви признаци на клинично заболяване, здравето на тези, заразени с WT и Omi-S, бързо се влошава, като WT вирусът причинява по-тежко заболяване (P=0.0102) (фиг. 2b и Разширени данни Фиг. 7b). Тъй като SARS-CoV-2 причинява фатална инфекция при K18-hACE2 мишки4, сравнихме оцеляването на мишки след вирусна инфекция. В съответствие с резултатите от загубата на телесно тегло и клиничния резултат, WT и Omi-S причиняват смъртност съответно от 100% (6/6) и 80% (8/10). Обратно, всички мишки, заразени с Omicron, оцеляха (фиг. 2c). Тези констатации, които са в съответствие с скорошна публикация30, показват, че S протеинът не е изключителният определящ фактор за патогенността на Omicron при K18-hACE2 мишки.

След това сравнихме размножаването на Omi-S с Omicron и WT SARS-CoV-2 в белите дробове и носните раковини на K18-hACE2 мишки. Мишките (на възраст 12-20 седмици) бяха заразени интраназално с 104 PFU (седем мишки на вирус) и вирусните титри в белите дробове на мишки бяха измерени при 2 и 4 dpi. В съответствие с констатациите in vitro, инфекциозният вирусен титър в белите дробове на WT-инфектирани мишки е по-висок от този, открит при мишки, заразени с другите два вируса (фиг. 2d). Трябва да се отбележи обаче, че заразените с Omi-S мишки произвеждат 30-кратно (P=0.0286) повече инфекциозни вирусни частици в сравнение с мишките, заразени с Omicron при 2 dpi. Титърът намалява с 4 dpi за WT- и Omi-S-инфектирани мишки, но показва нарастваща тенденция за Omicron-инфектирани мишки, сочейки възможността за лека, но персистираща инфекция от Omicron при K18-hACE2 мишки. И трите варианта, възстановени от белите дробове на мишки, поддържат същия фенотип на размера на плаките като оригиналния инокулум, което показва, че репликацията при мишки няма откриваем ефект върху генотиповете на тези вируси (данните не са показани).

За да оценим вирусната патогенност в белите дробове и носните раковини на K18-hACE2 мишки, извършихме хистопатологичен анализ на тези тъкани при 2 dpi. Както беше съобщено по-рано 4, 31, екстензивна почти дифузна имунореактивност на SARS-CoV-2 N протеина беше открита в белодробни алвеоли на мишки, заразени с WT вирус (фиг. 2e). Обратно, инфекцията с Omi-S и Omicron произведе локализирани огнища на алвеоларно оцветяване с по-малко огнища за Omicron в сравнение с Omi-S. Най-изразеният фенотип се наблюдава в бронхиоларен епител, в който Omi-S причинява изразена, рутинна периферна инфекция, като около 10–15% от бронхиолите са положителни за вирусен N протеин при 2 dpi, докато само 3–5% от бронхиолите са N -положителен за Омикрон (фиг. 2f). WT вирусът заразява около 1% от бронхиолите и във всички случаи включва само една изолирана епителна клетка на бронхиола. Освен това, бронхиоларната инфекция е свързана с епителна некроза при Omi-S-инфектирани мишки, както е определено чрез сериен хематоксилин и еозин (H&E) срезов анализ, докато не са наблюдавани хистологични доказателства за увреждане на дихателните пътища при Omicron- или WT-инфектирани мишки (Разширени данни Фиг. 8а, б). Носните носни раковини на мишки, инокулирани с WT и Omi-S вируси, съдържат изобилие от SARS-CoV-2-положителни клетки, които са свързани с явни цитопатични ефекти, докато Omicron произвежда редки, спорадични положителни клетки, без видими признаци на епителни нараняване (Разширени данни Фиг. 8c). Като цяло, тези открития предполагат, че репликацията на Omicron в респираторния тракт на мишките е значително отслабена в сравнение с Omi-S, подкрепяйки нашето заключение, че мутациите в S са само частично отговорни за отслабената патогенност на Omicron.

Мутациите в S и nsp6 определят затихването на Omicron

В допълнение към S протеина, Omicron има аминокиселинни промени в неструктурен протеин 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, обвивка (E), мембрана (M) и N протеини, в сравнение с WT вируса (Разширени данни Фиг. 9а). За да идентифицираме протеини без шипове, които участват в затихването на Omicron, ние генерирахме голям панел от флуоресцентно белязани химерни вируси, всеки от които съдържа Omicron S в комбинация с един протеин без шипове на Omicron, като останалите протеини идват от WT вирус (Разширени данни Фиг. 9b). Когато комбинирахме Omicron S с Omicron nsp6 (Omi-S/nsp6), наблюдавахме силно намаляване на вирусната репликация, като кинетиката на инфекцията имитира тази на Omicron в клетъчната култура (фиг. 3a–d); не се наблюдава такова намаление за други химерни вируси. Слабата ефективност на репликация на Omi-S/nsp6 също беше потвърдена от нашето откритие, че както Omi-S/nsp6, така и Omicron са отнели почти пет до шест дни за възстановяване от CPER, докато всички други варианти са възстановени за два дни (данните не са показани). И накрая, подобно на Omicron, Omi-S/nsp6 беше ясно изпреварен от Omi-S в тест за директна конкуренция (фиг. 3e).

Фиг. 2|Роля на S в патогенността на Omicron. a–c, Мъжки и женски K18-hACE2 мишки (на възраст 12–20 седмици) бяха интраназално инокулирани с 1 × 104 PFU от WT (n=6 мишки), вирус Omi-S (n=10 мишки) или Omicron (n {{1{{40}}}} мишки). В този експеримент бяха използвани два независимо генерирани вирусни запаса. Телесното тегло (a), клиничният резултат (b) и преживяемостта (c) се наблюдават ежедневно в продължение на 14 дни. Мишки, които са загубили 20% от първоначалното си телесно тегло, са евтаназирани. d,e, K18-hACE2 мишки бяха интраназално инокулирани с 1 × 104 PFU от WT (n=14 мишки), Omi-S (n=14 мишки) и Omicron (n {{ 20}} мишки). Белодробни проби от заразените мишки бяха събрани при 2 или 4 dpi за определяне на вирусния титър (n=4 мишки) (d) или за имунохистохимично (IHC) откриване на N протеин (n=3 мишки) (д). В e са представени представителни IHC изображения, показващи SARS-CoV-2 N (кафяв цвят) в алвеоли (стрелки) и бронхиоли (върхове на стрелки) в белите дробове на мишки при 2 dpi. Скала, 100 µm. f, Процент на N-положителни бронхиоли в белите дробове на заразени мишки (n=3 мишки) при 2 dpi. Всяка точка представлява заразена мишка. Статистическата значимост се определя с помощта на двустранен, несдвоен t-тест с корекция на Welch (a, b, d, f) и log-rank (Mantel-Cox) тест (c). *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; NS, незначително.

В белите дробове на K18-hACE2 мишки, докато Omi-S причинява обширна бронхиоларна инфекция и нараняване, както Omicron, така и Omi-S/nsp6 показват намалена инфекция без доказателства за епително увреждане (фиг. 3f). В съответствие с тези констатации белите дробове на инфектирани с Omi-S/nsp6-мишки произвеждат вирусни титри, еквивалентни на тези, наблюдавани за rOmicron и Omicron изолат (фиг. 3g). И накрая, 71% от мишките, заразени с Omi-S/nsp6, оцеляват (Фигура 3h) - за разлика от нивата на преживяемост от само 20%, които се наблюдават при мишки, заразени с Omi-S (Фигура 2с). Като цяло тези резултати показват, че мутациите в S и nsp6 са достатъчни, за да се определи атенюираната вирулентност на Omicron. Тези наблюдения подкрепят и допълнително разширяват констатациите от предишно проучване, което показва, че мутациите в областта 5′-UTR–nsp12, в която се намира nsp6, допринасят за отслабването на Omicron в K18-hACE2 мишки30.

Фиг. 3|Мутациите в S и nsp6 водят до патогенност на Omicron.a–d, Кинетиката на репликация на посочени mNeonGreen репортерни вируси в ACE2/TMPRSS2/Caco-2 клетки (MOI=0.01), определена от потока цитометрия (n=3 повторения) (a,c) и анализ на плаки (n=3 повторения) (b,d). Експериментите бяха повторени два пъти. e, клетките ACE2/TMPRSS2/Caco-2 бяха инфектирани с вирусни смеси в съотношение 1:1, за да се получи крайната MOI от 0.005 за всеки вирус . Клетките се фиксират в посочените времена и се анализират чрез поточна цитометрия. Показан е процентът на неинфектираните, единично инфектираните и двойно инфектираните клетки. Единично инфектирани клетки бяха използвани за компенсация. Индивидуалните точки от данни се нанасят заедно със средната стойност ± sd (n=3 повторения). Експериментът се повтаря два пъти. f–h, K18-hACE2 мишки бяха интраназално инокулирани с 1 × 104 PFU от вируси. Белодробни проби от заразени мишки бяха събрани при 2 dpi за IHC откриване на N протеин (n=3 мишки) (f) или за определяне на вирусни титри (n=4 мишки) (g). В f, представителни изображения на H&E оцветяване на N-позитивни бронхиоли са показани във вмъквания. Некрозата на бронхиоларния епител е показана със стрелки. Не са наблюдавани доказателства за некроза в бронхиолите на мишки, заразени с Omicron или Omi-S/nsp6. Скала, 100 µm. Дясната графика в f показва процента на N-положителни бронхиоли в белите дробове на заразени мишки. Всяка точка представлява заразена мишка. h, Преживяемостта на заразените мишки се наблюдава ежедневно в продължение на 14 дни. Мишки, които са загубили 20% от първоначалното си телесно тегло, са евтаназирани. Статистическата значимост беше определена с помощта на двустранен, несдвоен t-тест с корекция на Welch (a–g) и log-rank (Mantel-Cox) тест (h). *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; NS, незначително.

S протеинът RBM движи бягството на ваксината Omicron

Голяма част от литературата предоставя доказателства за обширното избягване на Omicron от индуцирания от ваксината хуморален имунитет14,19. За да дефинираме S региони, които са свързани с фенотипа на имунно избягване на Omicron, първо сравнихме in vitro неутрализационната активност на серуми от ваксинирани индивиди срещу WT SARS-CoV-2 (USA-WA1/20 20), Omi-S и Omicron. Включени са серуми, събрани в рамките на два месеца след втората доза иРНК-1273 (Moderna иРНК ваксина; n=12) или BNT162b2 (Pfizer-BioNTech иРНК ваксина; n=12) ваксина (Разширени данни Маса 1). Извършихме многоцикличен неутрализационен анализ, като използвахме настройка, в която вирусът и неутрализиращите серуми присъстваха през цялото време, имитирайки ситуацията при серопозитивни индивиди. Всички серуми слабо неутрализират Omicron, с 111-кратно (диапазон: 4.4-кратно до 81.2-кратно; P < 0,0001) по-ниско полумаксимално неутрализиращо разреждане (ND50) за Omicron в сравнение с WA1 (фиг. 4a, b). Всъщност около 80% от пробите не са неутрализирали напълно Omicron при най-високата тествана концентрация (Разширени данни Фиг. 10). Трябва да се отбележи, че Omi-S показва идентични стойности на ND50 с Omicron (11.5-пъти по-ниски от тези на WA1; P <0,0001) (Фиг. 4a,b), което предполага, че протеинът Omicron S, когато е включен в WT вирус, се държи по същия начин, както при Omicron.

Фиг. 4|Роля на S в имунната резистентност на Omicron. Стойности на ND50 за WA1, Omi-S и Omicron в серуми от лица, които са получили две ваксини на Moderna (донори 1–12) или Pfizer (донори 13–24) (допълнителни подробности за серуми са предоставени в Разширено Таблица с данни 1; отделните криви са показани на Разширени данни Фиг. 10). b, траектории на стойностите на ND50 спрямо WA1, Omi-S и Omicron (данните от a са нанесени). Показана е кратната промяна в стойностите на ND50 (n=24 серумни проби). c–f, Схема на химерните (вляво; c,d) и мутантните (вляво; e,f) вируси. Аминокиселинното номериране за WA1 мутанти в e се основава на WA1 S последователността, докато номерирането за Omicron мутанти в f се основава на Omicron S последователността. Бяха тествани шест от 24-те серума (3 от Moderna и 3 от Pfizer). Всяка серумна проба е представена от точка със специфичен цвят. Данните са изобразени като промяна на пъти на родителския вирус. Статистическата значимост се определя с помощта на двустранен, несдвоен t-тест с корекцията на Welch. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 и ****P <0,0001; NS, незначително.

SARS-CoV-2 S протеинът се състои от два домена: S1 домейн, който взаимодейства с ACE2 рецептора, и S2 домейн, който е отговорен за мембранното сливане32. В рамките на S1 домейна се намират N-терминален домен (NTD) и рецептор-свързващ домен (RBD), който съдържа рецептор-свързващ мотив (RBM), който осъществява директен контакт с ACE2 рецептора33. NTD на Omicron S има 11 аминокиселинни промени, включително 6 делеции и едно вмъкване с дължина 3-аминокиселина, докато RBD съдържа 15 мутации, 10 от които са концентрирани в RBM (разширен Данни Фиг. 1). Както NTD, така и RBD приемат неутрализиращи епитопи34–37, но RBD е имунодоминантен и представлява основната цел на неутрализиращата активност, която присъства в SARS-CoV-2 имунните серуми37,38. За да определим дали фенотипът на резистентност към неутрализация на Omicron е причинен от мутации в определен домейн на S протеина, ние генерирахме две групи химерни вируси. Първата група се състои от вируса WA1, носещ NTD, RBD или RBM на Omicron (фиг. 4c), а втората група се състои от вируса Omi-S, носещ NTD, RBD или RBM на WA1 (фиг. 4d). Неутрализационният анализ показа, че мутациите в RBM са основната причина за резистентността на Omicron към предизвикания от ваксината хуморален имунитет: замяната на RBM на WA1 с този на Omicron намалява ND50 с 54-пъти (P <0,0001), и, обратно, заместването на RBM на Omi-S с това на WA1 увеличи ND50 с 56-кратно (P=0.0003) (фиг. 4c,d). Фактът, че нито един от RBM-swap вирусите не е постигнал разлика от около 11-кратно, наблюдавана между WA1 и Omi-S, предполага, че мутациите в други части на S също допринасят за резистентност към ваксина.

За да проучим дали специфични мутации в Omicron RBM водят до избягване на ваксината, ние генерирахме два допълнителни панела от рекомбинантни вируси, единият с WA1 S, носещ Omicron RBM мутации, поотделно или в комбинация (фиг. 4e), а другият с Omicron S без същото набор от мутации (фиг. 4f). Два WA1 мутанта - мутант 3 (със заместване на E484A) и мутант 4 (носещ група от пет замествания Q493R, G496S, Q498R, N501Y и Y505H) - показват умерено, но статистически значимо намаление от 1.4-кратно ( P=0.0002) и 1.8- пъти (P=0.0003) в стойностите на ND50, съответно, в сравнение с WA1 (фиг. 4e). Обратното се наблюдава, когато тези мутации бяха премахнати от Omicron S; мутантът на Omicron 3 (без заместването на E484A) и мутантът 4 (без Q493R, G496S, Q498R, N501Y и Y505H) имаха 19-кратно (P=0.0082) и 3.{{38 }}кратно (P=0.0025) по-високи стойности на ND50 в сравнение с Omicron (фиг. 4f). Тъй като нито един от мутантите не е уловил общия фенотип на Omicron, ние приемаме, че избягването на ваксината е кумулативен ефект от мутации, разпределени по дължината на S протеина. Възможно е мутациите да променят конформацията на Omicron S по такъв начин, че повечето от имунодоминантните неутрализиращи епитопи да се разрушат и да станат недостъпни за неутрализация.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Дискусия

Това проучване предоставя ключова информация за вирусните протеини, които допринасят за патогенността на SARS-CoV-2. Показваме, че S, най-мутиралият протеин в Omicron, има непълна роля в затихването на Omicron. При анализи на клетъчно-базирани инфекции вирусът Omi-S проявява междинна ефективност на репликация между наследствения вирус и Omicron. По подобен начин, при K18-hACE2 мишки, Omi-S контрастира с нефаталния Omicron и води до 80% смъртност; наследственият вирус причинява 100% смъртност при тези мишки. По-специално, когато комбинирахме S мутации с мутации в nsp6, вирусът показа атенюиран фенотип, до голяма степен наподобяващ този на Omicron, което показва, че тези два протеина са основни детерминанти на патогенността на Omicron. Бъдещите проучвания ще дешифрират механизма(ите), чрез който мутациите на nsp6 влияят на вирусната репликация.

Едно потенциално ограничение на нашето изследване е използването на K18-hACE2 мишки за проучвания на патогенезата вместо модели на примати, които имат повече прилики с хората39. Трябва обаче да се отбележи, че мишките K18-hACE2 са добре установен модел за изследване на леталния фенотип на SARS-CoV-24,31. Въпреки че тези мишки развиват белодробна патология след SARS-CoV-2 инфекция, смъртността е свързана с участието на централната нервна система поради вирусна невроинвазия и разпространение31,40. Фактът, че инфекцията на K18-hACE2 мишки с Omi-S, но не и с Omicron, предизвиква неврологични признаци (например прегърбена поза и липса на реакция) предполага, че свойството за невроинвазия е запазено в Omi-S, вероятно в резултат на неговата по-висока ефективност на репликация и че детерминантите на това свойство се намират извън S протеина. Тези констатации са в съответствие с предишно проучване, което показва, че хамстерите, заразени с Omi-S, отделят значително повече вирус и са загубили повече тегло от тези, заразени с Omicron, което предполага, че мутациите извън S допринасят за отслабената патогенност на Omicron41.

Установихме, че въпреки че наследственият вирус се репликира основно в белодробните алвеоли и причинява само рядка инфекция на бронхиолите при K18-hACE2 мишки, както Omi-S, така и Omicron проявяват повишена склонност към репликация в бронхиоларния епител, което показва, че S протеинът е отговорен за променения тропизъм. Механизмът зад това превключване е неизвестен, но е възможно Omicron S да е по-ефективен от WT S при използването на катепсин B или катепсин L (реф. 25,42,43), които образуват активен вирусен път на навлизане в бронхиолите и други дихателни пътища клетки41. За разлика от това, навлизането на SARS-CoV-2 в алвеоларните епителни клетки се задвижва главно от TMPRSS2 (реф. 28,44), чието оползотворяване на Omicron S е недостатъчно25,45, което води до лоша инфекция на тези клетки4,5 ,25,43. Тези открития могат да обяснят отслабената белодробна патология, причинена от Омикрон.

Cistanche ползи - укрепва имунната система

Omicron nsp6 има две променени места по отношение на прототипа SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1 изолат: три-аминокиселинна делеция (LSG, позиции 105–107) и I189V заместване (Разширени данни Фиг. 9). Описани са няколко функции на nsp6 в репликацията на коронавирус; главният сред тях е биогенезата на двумембранни везикули (DMV), които представляват мястото на синтеза на вирусна РНК46-50. Предишно проучване показа, че SARS-CoV-2 DMV се генерират главно от съгласуваното действие на три вирусни протеина: nsp3, nsp4 и nsp6; въпреки че nsp3 и nsp4 са достатъчни за образуването на DMV, nsp6 свързва тези DMV с ендоплазмения ретикулум и канализира основната комуникация между тези структури46. Дали съзвездието от мутации в Omicron nsp6 засяга образуването или функциите на DMV се нуждае от допълнително изследване. Nsp6 също активира NLR3-зависимото производство на цитокини и пироптозата в белите дробове на пациенти с COVID-19, служейки като ключов вирулентен фактор47. Трябва да се отбележи, че вариант на nsp6, който е свързан с асимптоматичен COVID-19, показва намалена способност да индуцира пироптоза47, което подтиква спекулации, че мутациите в Omicron nsp6 също могат да повлияят на пироптозата. Ще са необходими подробни механистични проучвания, за да се анализира ефектът от мутациите на Omicron върху функциите на nsp6.

Понастоящем не е известно дали мутациите в S и nsp6 работят съвместно една с друга, за да стимулират отслабването на Omicron. Като се има предвид, че Omicron S показва по-голяма склонност към бронхиолите, възможно е S да е отговорен за променения вирусен тропизъм, докато мутациите без шипове – включително тези в nsp6-са просто адаптации към променената тъканна среда. Струва си да се спомене, че въпреки че nsp6 изглежда основният протеин без шипове зад отслабването на Omicron, приносът на други вирусни протеини не може да бъде напълно изключен. Всички експерименти in vitro, изследващи ролята на нешиповите мутации, бяха проведени в клетки ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Използването на други, по-компетентни за имунната система типове клетки може да разкрие ефекта и на други мутации без шипове. В допълнение, нашите химерни вируси съдържаха Omicron S, съчетан само с един нешипов протеин наведнъж, което ограничаваше епистатични взаимодействия на дълги разстояния между мутации в множество вирусни протеини.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Нашето проучване показва, че мутациите в RBM на Omicron S са основните детерминанти за избягването на Omicron от неутрализиращи антитела, въпреки че мутациите в други региони на S също допринасят. В рамките на RBM ние идентифицираме две горещи точки на мутации, които дават на Omicron S способността да устои на неутрализацията: едната носи замяната E484A, а другата съдържа група от пет замени – Q493R, G496S, Q498R, N501Y и Y505H. Показано е, че заместването на E484A избягва неутрализация от реконвалесцентни серуми51. Освен това, структурното моделиране предполага, че някои терапевтични моноклонални антитела установяват високо стабилни солеви мостове с остатъка E484, като напълно губят своето свързване, когато този остатък се промени на A или след Q493K и Y505H промени52. По подобен начин, картографирането на RBM остатъци, които директно взаимодействат с 49 известни неутрализиращи антитела, разкри N440, G446, S477 и T478 като нискочестотни интерактори, N501, Y505 и Q498 като средночестотни интерактори и E484 и Q493 като високочестотни интерактори53 , в съответствие с резултатите от нашия анализ за неутрализация. Трябва да се отбележи, че въпреки че потенциалът за свързване на антителата на Omicron S е нарушен54, неговият капацитет за свързване с рецептори е непокътнат. Всъщност Omicron RBD има по-висок афинитет към ACE2 в сравнение с Wuhan-Hu-1 и Delta RBDs25. Това показва, че мутациите в Omicron S са се развили по такъв начин, че възпрепятстват свързването на антитялото, но запазват ангажирането на рецептора. Това отваря възможността за насочване към запазените и структурно ограничени региони на S, които участват в разпознаването на ACE2, за проектиране на широкоспектърни ваксини за контрол на пандемията от COVID-19.

препратки

1. Liu, L. et al. Поразително укриване на антитела, проявено от варианта Omicron на SARS-CoV-2. Nature 602, 676–681 (2022).

2. Planas, D. et al. Значително избягване на SARS-CoV-2 Omicron до неутрализиране на антитела. Nature 602, 671–675 (2022).

3. Schmidt, F. et al. Плазмена неутрализация на варианта на SARS-CoV-2 Omicron. Н. англ. J. Med. 386, 599–601 (2022).

4. Shuai, H. et al. Атенюирана репликация и патогенност на SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Nature 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ et al. SARS-CoV-2 Вирусът Omicron причинява атенюирано заболяване при мишки и хамстери. Nature 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA et al. Клинични резултати, свързани с вариант на SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) и инфекция с подвариант BA.1/BA.1.1 или BA.2 в Южна Калифорния. Нац. Med. 28, 1933–1943 (2022).

7. Wolter, N. et al. Ранна оценка на клиничната тежест на варианта на SARS-CoV-2 omicron в Южна Африка: проучване за свързване на данни. Lancet 399, 437–446 (2022).

8. Ulloa, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA Оценки на тежестта на варианта на SARS-CoV-2 Omicron в Онтарио, Канада. J. Am. Med. ст.н.с. 327, 1286–1288 (2022).

9. Uraki, R. et al. Характеризиране на изолатите на SARS-CoV-2 Omicron BA.4 и BA.5 при гризачи. Nature 612, 540–545 (2022).

10. Ураки, Р. и др. Характеризиране и антивирусна чувствителност на SARS-CoV-2 Omicron BA.2. Nature 607, 119–127 (2022).

11. Дайър, О. Ковид-19: Омикрон причинява повече инфекции, но по-малко хоспитализирани от Делта, показват данните за Южна Африка. бр. Med. J. 375, n3104 (2021).

12. Сигал, А. По-леко заболяване с Омикрон: вирусът ли е или съществуващият имунитет? Нац. Rev. Immunol. 22, 69–71 (2022).

13. КОЙ. Проследяване на вариантите на SARS-CoV-2 https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022 г.).

14. Cele, S. et al. Omicron масово, но не напълно избягва неутрализацията на Pfizer BNT162b2. Nature 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. et al. Вероятно предаване на SARS-CoV-2 омикрон вариант в карантинен хотел, Хонконг, Китай, ноември 2021 г. Извънредна ситуация. заразявам. дис. 28, 460–462 (2022).

16. Юлиано, AD и др. Тенденции в тежестта на заболяването и използването на здравни грижи през периода на ранния вариант на Omicron в сравнение с предишни периоди на високо предаване на SARS-CoV-2 – САЩ, декември 2020 г. – януари 2022 г. Morb. Смъртен. Wkly Rep. 71, 146–152 (2022).

17. CDC. Проследяване на данни за COVID https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Тейлър, Л. Ковид-19: Omicron води до седмичен рекорд в глобалните инфекции. бр. Med. J. 376, o66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. et al. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 води до широко разпространено избягване на реакциите на неутрализиращи антитела. Клетка 185, 467–484 (2022).

20. Suzuki, R. et al. Отслабена фузогенност и патогенност на варианта на SARS-CoV-2 Omicron. Nature 603, 700–705 (2022).

21. Smyth, DS et al. Проследяване на загадъчни линии на SARS-CoV-2, открити в отпадъчните води на Ню Йорк. Нац. Общ. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE et al. Бележки от терена: ранни доказателства за варианта на SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) в обществени отпадъчни води – САЩ, ноември–декември 2021 г. Morb. Смъртен. Wkly Rep. 71, 103–105 (2022).

23. Herrmann, A. et al. Клониране на геном на SARS-CoV-2 без преминаване и мутагенеза с помощта на червена рекомбинация. Вътр. J. Mol. Sci. 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU Оптимизиран метод, базиран на реакция на удължаване на кръгова полимераза, за функционален анализ на SARS-CoV-2. Предпечат на https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. et al. Промененото използване на TMPRSS2 от SARS-CoV-2 Omicron влияе върху тропизма и фузогенността. Nature 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ et al. SARS-CoV-2 Omicron е вариант на имунно бягство с променен път на навлизане в клетката. Нац. Microbiol. 7, 1161–1179 (2022).

27. Martines, RB et al. Патология и патогенеза на SARS-CoV-2, свързана с фатална коронавирусна болест, Съединени щати. Emerg. заразявам. дис. 26, 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. et al. Инфекцията със SARS-CoV-2 на произхождащи от плурипотентни стволови клетки човешки белодробни алвеоларни клетки тип 2 предизвиква бърз епителен присъщ възпалителен отговор. Клетъчни стволови клетки 27, 962–973 (2020).

29. Mulay, A. et al. SARS-CoV-2 инфекция на първичен човешки белодробен епител за моделиране на COVID-19 и откриване на лекарства. Cell Rep. 35, 109055 (2021).

30. Liu, S., Selvaraj, P., Sangare, K., Luan, B. & Wang, TT Spike протеин-независимо отслабване на SARS-CoV-2 Omicron вариант в лабораторни мишки. Cell Rep. 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. et al. Фаталната невродисеминация и тропизмът на SARS-CoV-2 при K18-hACE2 мишки зависят само частично от експресията на hACE2. Вируси 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. & Liu, SW Структурни и функционални свойства на шиповия протеин на SARS CoV-2: потенциално разработване на антивирусни лекарства за COVID-19 . Acta Pharmacol. грях. 41, 1141–1149 (2020).

33. Lan, J. et al. Структура на SARS-CoV-2 спайк рецептор-свързващ домейн, свързан с ACE2 рецептора. Nature 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. et al. Неутрализиращо човешко антитяло се свързва с N-терминалния домен на Spike протеина на SARS-CoV-2. Science 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN и др. Разпространено, защитно и конвергентно разпознаване на IgG на SARS-CoV-2 не-RBD пикови епитопи. Наука 372, 1108–1112 (2021).

36. Премкумар, Л. и др. Рецепторният свързващ домейн на протеина на вирусния шип е имунодоминантна и силно специфична цел на антителата при пациенти със SARS-CoV-2. Sci. Immunol. 5, eabc8413 (2020).

37. Ju, B. et al. Човешки неутрализиращи антитела, предизвикани от SARS-CoV-2 инфекция. Nature 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. et al. Картографиране на неутрализиращи и имунодоминантни места в SARS-CoV-2 спайк рецептор-свързващ домейн чрез структурно ръководена серология с висока разделителна способност. Клетка 183, 1024–1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Модели на нечовекоподобни примати за изследване на SARS-CoV-2: обмислете алтернативи на макаците. Lab Anim. 50, 113–114 (2021).

40. Кумари, П. и др. Невроинвазия и енцефалит след интраназална инокулация на SARS CoV-2 в K18-hACE2 мишки. Вируси 13, 132 (2021).

41. Peacock, TP et al. Промененият път на влизане и антигенното разстояние на варианта на SARS-CoV-2 Omicron се картографират към отделни домейни на шипов протеин. Предпечат на https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Padmanabhan, P. & Dixit, NM Моделиране как промененото използване на пътищата за навлизане в клетките от варианта на SARS-CoV-2 Omicron може да повлияе на ефикасността и синергията на TMPRSS2 и инхибиторите на катепсин B/L. Предпечат на https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY и др. Репликация на вариант на SARS-CoV-2 Omicron в човешки бронх и бял дроб ex vivo. Nature 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. et al. Оценка на навлизането на SARS-CoV-2, възпаление и нови терапевтични средства в клетките на човешката белодробна тъкан. PLoS Pathog. 18, e1010171 (2022).

45. Zhao, H. et al. Вариантът на SARS-CoV-2 Omicron показва по-малко ефективна активност на репликация и сливане в сравнение с варианта Delta в TMPRSS2-експресирани клетки. Emerg. Микробите заразяват. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. et al. Ролята на NSP6 в биогенезата на репликационния органел на SARS-CoV-2. Nature 606, 761–768 (2022).

47. Sun, X. et al. SARS-CoV-2 неструктурен протеин 6 задейства NLRP3-зависима пироптоза чрез насочване към ATP6AP1. Клетъчна смърт Разл. 29, 1240–1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T. Коронавирус NSP6 ограничава автофагозомната експанзия. Автофагия 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. et al. Еволюционен анализ на SARS-CoV-2: как мутацията на неструктурен протеин 6 (NSP6) може да повлияе на вирусната автофагия. J. Инфектирайте. 81, e24–e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC Репликацията на РНК на вируса на миши хепатит се извършва в везикули с двойна мембрана. J. Virol 76, 3697–3708 (2002).

51. Liu, Z. et al. Идентифициране на пикови мутации на SARS-CoV-2, които намаляват неутрализирането на моноклонални и серумни антитела. Микроб клетъчен гостоприемник 29, 477–488 (2021).

52. Shah, M. & Woo, HG Omicron: силно мутирал вариант на SARS-CoV-2 проявява по-силно свързване с ACE2 и мощно избягва одобрените терапевтични антитела срещу COVID-19. Преден. Immunol. 12, 830527 (2021).

53. Ye, G., Liu, B. & Li, F. Cryo-EM структура на SARS-CoV-2 omicron spike protein ectodomain. Нац. Общ. 13, 1214 (2022).

54. Carreno, JM et al. Активност на реконвалесцентен и ваксинален серум срещу SARS-CoV-2 Omicron. Nature 602, 682–688 (2022).