Структурни и функционални прозрения в полиморфизма на синуклеиновите фибрили, част 3

4.3. -Syn щамове в проби от човешка синуклеинопатия

Структурните и функционални разлики, наблюдавани в рекомбинантните щамове, могат да бъдат валидирани чрез идентифициране и характеризиране на фибрили директно от проби на пациенти със синуклеинопатия.

Рекомбинантните щамове се отнасят до микробни видове, които са били рекомбинирани на генетично ниво. В тази област беше постигнат огромен напредък, който ни предоставя много възможности. В същото време учените непрекъснато изучават въздействието на рекомбинантните щамове върху хората и околната среда. Резултатите от изследвания през последните години показват, че рекомбинантните щамове имат положително въздействие върху човешката памет.

Проучванията са установили, че рекомбинантните щамове могат да повлияят на човешката когнитивна способност и памет чрез подобряване на метаболитната активност на микроорганизмите в червата и увеличаване на полезната флора в червата. Този комуникационен механизъм на оста черва-мозък се нарича "взаимодействие черва-мозък".

По-конкретно, рекомбинантният щам може да насърчи възстановяването на кръвно-мозъчната бариера чрез увеличаване на полезната флора в червата, като по този начин насърчава нормалното функциониране на мозъка. В допълнение, рекомбинантният щам е в състояние да увеличи освобождаването на допамин и невропептиди, които са критични за дългосрочната памет и ученето.

Затова учените предполагат, че хората трябва да ядат повече храни, богати на пробиотици и пребиотици, като кисело мляко, кафе и пълнозърнести храни. В допълнение, хората могат също да допълват пробиотиците в червата, като консумират някои специфични рекомбинантни щамове, като по този начин допълнително насърчават ефекта от взаимодействието черва-мозък.

В обобщение, има положителна връзка между рекомбинантните щамове и паметта. Хората трябва да предприемат някои ефективни мерки за насърчаване на комуникацията между червата и мозъка, като по този начин подобряват паметта и когнитивните си способности. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. В допълнение, Cistanche deserticola може също да подобри притока на кръв и да насърчи доставянето на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте добавките за подобряване на паметта

Първото доказателство за щам, произхождащ от мозъка, идва от основополагащо проучване на Prusineret al. [270], което демонстрира, че мозъчни екстракти от MSA се предават на трансгенни мишки и клетки, което води до изобилна -Syn патология [270]. За разлика от това, това не се наблюдава при използване на мозъчни екстракти от PD, което предполага, че щамът, получен от PD, може да се различава от MSA [270].

Тогава идва въпросът какво може да накара -Syn да приеме различна конформация в MSA или PD? In vitro, различни условия на разтвора (като наличието или отсъствието на сол) пораждат фибрили с различни структурни и функционални свойства [29]. По подобен начин, -Syn също е изложен на няколко микросреди in vivo, засягащи неговата агрегация [271].

Допаминергичните неврони в PD и олигодендроцитите, засегнати от MSA, принадлежат към различни клетъчни линии и имат различни клетъчни среди. Лий и сътрудници демонстрираха, че различни вътреклетъчни среди на две клетъчни линии придават образуването на щам в MSA и PD [34]. -Syn фибрили, получени от GCI в олигодендроцити (GCI- -Syn) и LBs в неврони (LB- -Syn) на болни мозъци се различават значително и проявяват различни способности за посяване [34].

Щамът GCI- -Syn е високоефективен при засяване - синагрегация в сравнение с LB- -Syn, като по този начин допринася за агресивността на MSA [34]. -Syn агрегати също са открити в биологични течности като цереброспинална течност (CSF) и плазма на пациенти с PD [272,273]. - Агрегацията на Syn започва години преди началото на действителните симптоми на заболяването и по този начин откриването на тези агрегати на ранен етап може да позволи идентифицирането и характеризирането на определен щам в тези течности.

В този контекст наскоро беше разработена амплификация на -Syn агрегати от мозъчни екстракти на пациенти с PD и MSA, използвайки техниката на циклично усилване на неправилно нагъване на протеин (PMCA). Тази техника включва амплификация на неправилно нагънати протеини in vitro, като амплификация на ДНК чрез PCR [274]. Състои се от редуващи се цикли на инкубация и ултразвук, което води до репликация на амилоид.

Първо, следите от амилоид се инкубират с излишък от нативен протеин, за да се индуцира полимерен растеж. След това сместа от пробата се подлага на обработка с ултразвук, която ще разруши фибрилите, което ще доведе до няколко ядра.

Всяко новообразувано ядро ​​след това ще действа като семе в следващия цикъл и допълнително ще индуцира растежа на фибрилите. По този начин, след всеки цикъл, броят на семената ще се увеличи експоненциално и ще позволи откриването на малкото количество неправилно нагънати агрегати, налични в началото [274]. Soto и колеги използваха PMCA за усилване на -Syn агрегатите от CSF на пациентите, диагностицирани с PD и MSA [52].

Те откриха, че получените от PD и MSA фибрили проявяват различни биофизични и биохимични свойства и съответстват на различни конформационни щамове на -Syn [52]. Дори агрегати -Syn, амплифицирани от мозъчни хомогенати на PD и MSA, са показали, че проявяват променлива токсичност и невродегенерация в човешки допаминергични неврони, отразявайки различната тежест на заболяването, наблюдавана при пациенти с PD и MSA поради различни щамове на -Syn [275].

Тези открития убедително предполагат, че синуклеинопатиите могат да бъдат разграничени въз основа на вида на -Syn щама, присъстващ в мозъка. Въпреки това, сложността при откриването на агрегати възниква, когато се наблюдава хетерогенност от пациент към пациент при едно и също заболяване. Тази хетерогенност в -Syn агрегатите, амплифицирани от мозъчни екстракти на пациенти с PD, е по-голяма, отколкото в мозъчни екстракти на MSA [276].

Strohaker и др. съобщава, че фибрилите, получени от PD и MSA, не проявяват подчертано различни структурни свойства [276], за разлика от констатациите, докладвани от Soto и сътрудници [52].

Възможната причина за контрастиращите наблюдения може да са разликите в PMCA протоколите, използвани от двете групи [277]. Освен това Strohaker et al. използва много по-малък размер на извадката от групата на Сото [52,276]. Други фактори, като генетичния произход на пациентите, възрастта на избраните пациенти, натоварването на -Syn агрегати при различни пациенти, наличието на други компоненти в екстрактите и областта на мозъка, откъдето е извършена екстракцията, също могат да бъдат отговорни за тези различия [276].

Подобни противоречия съществуват и в областта на патологията на AD. Скорошни открития върху проби от тау, получени от мозъка, предполагат, че хетерогенността между пациентите в конформациите на тау фибрилите съществува в рамките на същото заболяване, AD [278]. Въпреки това, Goedert и колеги наблюдават същия тип oftau конформация във всички случаи на AD, анализирани досега, което предполага, че тау фибрилите от едно заболяване (като AD или болестта на Pick) приемат обща структурна гънка [218,219].

Въпреки че причините и факторите, които движат тази структурна специфичност при тауопатиите, са неясни, това може да се дължи на множество изоформи на тау, PTMs, взаимодействия с други протеинови молекули, кофактори и т.н.

Наскоро Scheres и Godert представиха йерархична класификация на тауфибрили от различни тауопатии въз основа на гънките на техните нишки [279]. Остава да се определи дали съществува подобна класификация за -Syn фибрили, изолирани от проби от синуклеинопатия. Напоследък бяха положени големи усилия за разкриване на структурата на -Synder, извлечена от човешкия мозък от Schweighauser et al., използвайки Cryo-EM [280].

Групата установи, че -Syn нишките от мозъка на пациенти с DLB не се усукват и са по-тънки от тези, получени от мозъка на пациенти с MSA [280], в съответствие с предишните констатации [3]. Липсата на усуквания във фибрилите, получени от DLB, изключва определянето на 3D структура чрез cryo-EM и разликите в -Syn фибрилите, получени от пациенти с MSA и DLB, са начертани въз основа на двуизмерно класово осредняване [280].

Въпреки че се нуждаем от повече структури с висока разделителна способност, получени от пациенти със синуклеинопатия, за да стигнем до определено заключение, настоящите доклади със сигурност укрепват твърденията за съществуването на различни видове фибрили на -Syn.

Освен това, структурите на -Syn филаменти от случаи на PD все още не са налични, но разрешаването им в бъдеще може значително да помогне за разбирането на механизма на заболяването и генерирането на терапевтични подходи срещу синуклеинопатии.

5. Структурни модели с висока разделителна способност на съществуващи -Syn фибрилни щамове

Досега са използвани различни биофизични техники, като ssNMR, микроелектронна дифракция, EPR, кръгов дихроизъм (CD), обменен NMR на водород/деутерий (HDXNMR) и cryo-EM, за определяне на структурата на -Syn фибрилите при различни разделителни способности.

Тези техники са поставили основата на полиморфизма на молекулярно ниво във фибрилите. Листовата структура на фибрилното ядро, използвайки ssNMR, разкрива две фибрили, форма А и форма В, чрез последователно присвояване на 48 остатъка от ядрото [56].

Проучването изясни наличието на два фибрилни полиморфа, които може да са се образували поради различни механизми за фибрилация [56]. По същия начин, двете контрастни фибрилни структури, „ленти“ и „фибрили“, генерирани in vitro, показват разлики в дължината, разпределението и броя на листовите елементи в тяхната фибрилна структура, анализирана чрез ssNMR [29].

Въпреки това, въпреки няколко опита, как -Syn фибрилните полиморфи се различават в атомната структура остава до голяма степен неизвестно. Революцията в структурния полиморфизъм настъпи, след като структурата на -Syn фибрила беше разрешена с помощта на крио-ЕМ на разделителна способност на атомно ниво. Stahlberg и групата разкриха, че -Syn фибрилите (остатъци 1–121) се състоят от два идентични протофиламента [61].

Листовете от всеки протофиламент взаимодействат и стабилизират структурата чрез хидрофобна геометрия на ципа [61]. Трябва да се отбележи, че остатъците 50–57, разположени на интерфейса на протофиламента, също са мястото на фамилни PD мутанти (A53T/V/E), H50Q и G51D [61]. В това отношение беше предвидено, че тези мутации могат да променят фибриларната структура, което води до различни типове фибрили.

Последващите крио-ЕМ изследвания на структурата на -Syn с пълна дължина показват разлика в хиралността и спиралното усукване [281] в сравнение със С-терминалната пресечена -Syn фибрилна структура (остатъци 1–121) [61]. Смята се, че тези разлики в структурите на фибрилите с пълна дължина (1–140) и С-терминално скъсените фибрили могат да се дължат на полиморфизъм на фибрилите.

Прякото доказателство за тези теории беше получено от скорошни семенни изследвания, които използваха cryo-EM за очертаване на моделите на -Syn фибрилни полиморфи. Li et al. идентифицира два фибрилни полиморфа, „пръчка“ и „туистър“, с обща структура на протофиламентното ядро, но различни интерфейси между протофиламентите [57]. Twister полиморфите показват подреден извит - -архмотив, докато пръчковидни полиморфи набират някои допълнителни остатъци, за да образуват мотив „гръцки ключ“, както се съобщава и от други групи [55,61,281].

Съществуването на полиморфи в пръчковидни и twister форми предполага, че разликите в опаковането на една и съща структура на ядрото могат да доведат до полиморфизъм. Подобни наблюдения са направени и за други амилоидни протеини, като -амилоид и тау, където протофиламентите с една и съща структура на ядрото, но различно опаковане водят до полиморфни структури [40,282].

Освен това, двете нови полиморфни форми на -Syn фибрили, генерирани in vitro, наречени съответно полиморфи 2а и 2b, са различни от докладваните по-рано полиморфи 1а и 1b [57,61,281]. В полиморф 1а [61], взаимодействията между остатъците при интерфейсът на протофиламентите се медиира от образуването на хидрофобна геометрия на пространствен цип, докато в полиморфи 2а и 2b, те се медиират от солни мостове [41,61].

По-внимателното изследване на структурните разлики между полиморфи 1a/1b и нови полиморфи 2a/2b разкрива допълнителни разлики в подреждането на мотивите на дъгата, които променят интерфейса на протофиламентите между полиморфи 1 и 2 [41].

Тези изследвания укрепват хипотезата, че един и същ прекурсорен протеин -Syn може да се сглоби в множество полиморфни фибрили in vitro, които коренно се различават един от друг по отношение на атомната разделителна способност. Goedert и колегите му наскоро проучиха cryo-EM структури на тау фибрили, получени от болестта на Алцхаймер и Пик мозъка на пациентите [40,218,219].

Те откриха различни гънки на тау филаменти и при двете заболявания, което показва, че различни конформери на тау съществуват при различни тауопатии. Същата група съобщава за два типа -Syn филаменти, тип I и тип II, от мозъците на индивиди, страдащи от MSA [280]. Те откриха, че всяка нишка е съставена от два неидентични протофиламента.

Кухината, образувана от плътното опаковане на протофиламентите, включва допълнителни молекули, които все още предстои да бъдат определени [280]. Осредняването на 2D клас също разкри различни фибрили от пациенти с MSA и DLB, което предполага съществуването на различни конформери, свързани със синуклеинопатията.

Освен това, би било интересно да се попита дали фибрилите, получени от пациента, показват някакво ниво на сходство с фибрилите, генерирани in vitro. Характеризирането на молекулярно ниво и сравнението на проби от фибрили, получени от мозъка, с фибрили, генерирани in vitro, разкриват, че тези две са структурно различни [276,280]. Основната разлика между получените от MSA и синтетичните филаменти е размерът и опаковката на протофиламентите в MSA фибрилите [280].

Нещо повече, изследователите използват тежки условия за генериране и изолиране на синтетични фибрили като разбъркване, концентрация на сол и т.н., които влияят върху опаковането и подреждането на листа на нишките [10,283–285]. В резултат на това става трудно да се съпоставят in vitro резултатите с in vivo сценариите.

От друга страна, човек може да получи само предварително формирани фибрили от проби, извлечени от болест, но може да не разбере как са възникнали и какви фактори са управлявали образуването на различни фибрили в различни мозъчни проби. Предизвикателство е да се изолират преходните токсични видове или междинни продукти от мозъчните проби, за да се разбере патогенезата на заболяването.

Следователно, трябва да разчитаме на in vitro проби, за да очертаем механизмите на образуване на фибри, пътищата и кинетичния анализ. По същия начин, ние трябва да тестваме същото, като използваме получени от мозъка фибрили, за да разработим по-обширна база от знания. Като цяло, структурите с висока разделителна способност на -Syn полиморфите могат да помогнат на изследователите в търсенето на потенциални терапевтични цели.

Необходимо е обаче задълбочено изследване, за да се разбере въздействието на клетъчните състояния, мутациите, PTM, наличието на кофактори и т.н., върху структурата на -Syn фибрила и връзката на различни полиморфи на фибрила с клиничната вариабилност, наблюдавана при PD.

6. Фамилни мутации на -Syn формират различни фибрилни конформации

- Син олигомеризацията и агрегацията са свързани с патогенезата на PD. Досега са открити седем фамилни миссенс мутации в гена SNCA, свързани с ранно и късно начало на PD [83–90].

Сред тези PD-асоциирани мутации E46K, H50Q, A53T и новооткритите A53V мутанти ускоряват скоростта на агрегацията на -Syn, докато A30P, G51D и A53E мутациите забавят кинетиката на агрегация in vitro [91,93,96]. Въпреки това, връзката между скоростта на агрегация (in vitro) и възрастта на началото на заболяването (in vivo) не е ясна [103].

Въпреки че олигомерите, образувани по време на ранните етапи на кинетиката на агрегация, са потенциално токсични [286], само A30P показва по-бърза олигомеризация и забавено превръщане на олигомерите във фибрили [102]. G51D, от друга страна, проявява бавна олигомеризация и бавно образуване на фибрили [287,288], но въпреки това се свързва с ранното начало на заболяването.

Поради тази сложност в поведението на фамилните мутанти е предизвикателство да се създаде обединяващ механизъм, чрез който те причиняват болестта. Предишни доклади предполагат, че -Syn приема спирална структура при свързване с мембраните in vivo [289,290].

Всяка отделна аминокиселинна промяна в N-крайния домейн на -Syn може да промени мембранно-свързващата способност и да увеличи цитозолната концентрация на протеина чрез насърчаване на по-бърза агрегация [291,292]. Данните за мембранно свързване на фамилни -Syn мутанти от нашата лаборатория [92] и други [110,288,292,293] показват, че H50Q, A53T и E46K мутанти показват повишено мембранно свързване, докато A53E, G51D и A30P мутанти показват намалено мембранно свързване.

Това предполага, че подобно на агрегацията, способността за свързване на мембраната не корелира с повишените склонности към заболяване от фамилни -Syn мутации. Следователно, липсва корелация между агрегацията и мембранно-свързващата способност с действителната патогенеза на заболяването, причинена от фамилните мутанти на -Syn.

Това повдига въпроса как точковата мутация в естествено неструктуриран протеин показва драстични разлики в началото и прогресията на заболяването. Вярваме, че е възможно различни -Syn мутанти да произвеждат различни типове и количества олигомери и също така да променят уникално капацитета на засяване на протеин от див тип [103].

Ето защо мутантите засягат не само общата скорост на агрегиране на протеина, но също и микроскопичните стъпки, включени в образуването на амилоид, т.е. инициирането и усилването на -Syn чрез вторичния процес на нуклеация [294]. Интересно, Lazaro et al. установиха, че въпреки идентичната склонност към олигомеризация в култивирани клетки, A30P, E46K, H50Q, G51D и A53T проявяват различни способности за образуване на включвания [295]. A30P показва намалена склонност към образуване на включвания в клетките, докато мутантите E46K и G51D показват противоположен ефект [295].

Отново, образуването на включване в клетките [295] не корелира със склонността към агрегация на мутанти in vitro [12,91–93,102]. По този начин, разглеждането на тези въпроси за това как див тип -Syn и неговите мутанти допринасят за ранното и късното начало на PD става важно за разбирането на диференциалната патогенеза на синуклеинопатиите.

Образуването на фибрил е силно чувствително към промени в локалната и/или глобалната микросреда на протеина. Това предполага, че една единствена аминокиселинна промяна може да доведе до полиморфизъм поради различна конформационна динамика, специфична за мястото, както е показано за дивия тип и фибрилите на E46K, A30P и A53T [296]. В този контекст Ноулс и колеги наскоро проучиха систематичното сравнение на -Syn и свързаните с болестта му мутанти, използвайки биофизични техники [297]. PD мутанти генерират фибрилни полиморфи с различна морфология и вторични структури в сравнение с протеина от див тип [297].

Наистина, няколко доклада независимо потвърждават, че различни -Syn мутанти образуват фибрили с характерна морфология, разкрита чрез изследвания с трансмисионна електронна микроскопия (TEM) и атомно-силова микроскопия (AFM), уникални модели на рентгенова дифракция (XRD) и разлики във вторичните структурни елементи (Фигура 4A, B).

Освен това интерфейсът на двата протофиламента в структурата на -Syn фибрила се формира от остатъци 50–57, които също съдържат три фамилни мутации [61]. Това предполага, че дори една точкова мутация може да промени динамиката и опаковането на протофиламентите.

По-внимателно изследване на фибрилите, образувани от мутанти чрез cryo-EM [298–300], разкрива пластичността на такива фибрили по отношение на усукванията, броя на взаимодействащите протофиламенти, подредбата на опаковката, вторичните структурни елементи и кватернерната форма и т.н. (Фигура 4C, D).Boyer и неговата група изследваха H50Q мутанти и откриха тесни (1c) и широки фибрили (1d) с един или два протофиламента, съответно [300].

Въпреки споделянето на същата запазена структура на ядрото, както беше докладвано по-рано за див тип -Syn, мутантните фибрили показват ново подреждане на протофиламент и мрежи от водородни връзки [300]. Освен това, А53 се намира в центъра на интерфейса на взаимодействащите протофиламенти в див тип -Syn [61] и също е гореща точка за много точкови мутации [16,89,90].

Cryo-EM изследвания с N-терминално ацетилиран A53T мутант не показват промяна в гънката на дивия тип -Syn [299]. Въпреки това, мутацията нарушава остатъчните взаимодействия и пренарежда ориентацията на протофиламентния интерфейс, като по този начин води до различен вид фибрили [299]. Това може да бъде и случаят с другите две A53 мутации, т.е. A53E и A53V, но тази възможност предстои да бъде открита.

Cryo-EM моделирането на фибрили, образувани от E46K мутация, също подкрепи преобладаващата хипотеза. Той разкрива образуването на фибрилни полиморфи с различно опаковане на протофиламенти и интерфейси в сравнение с див тип -Syn [298,301]. Освен това, той формира по-стабилен и патогенен вариант на див тип -Syn [298]. Като цяло, тези проучвания предполагат, че опаковката на протофиламентите и интерфейсът са критични при определяне на структурата на фибрилите.

Всяка фамилна мутация може да се държи като щам на -Syn, уникално променяйки структурата и динамиката на получените фибрили. Тези разлики във фибрилната структура могат да доведат до различни клинични и патологични резултати, като по този начин допринасят за хетерогенност на заболяването при синуклеинопатии.

For more information:1950477648nn@gmail.com