Проучване на ефектите на калцитриол против стареене върху човешки естествени клетки убийци in vitro Ⅱ

3. Резултати

Това проучване се фокусира върху анти-стареещите ефекти на калцитриол върху NK клетките. Резултатите показват, че Calcitriolнамалява експресията на биомаркери, свързани със стареенето, включително CD16, TIM3, PD-1, KIR иповишава експресията на NKG2A на NK клетки. то същоинхибира пролиферацията на NK клеткииарестувайте ги във фаза G1. Калцитриолнамалява освобождаването на възпалителни факторикато IL-5, IL-13, IFN- и TNF- и имаше определениантиоксидантни ефекти, което би могло да допринесе за неговотоефекти против стареене.

Щракнете тук, за да разберете антиоксидантните ефекти на Cistanche и да получите проба

3.1 Калцитриолът обърна експресията на повърхностните маркери за стареене, забави амплификацията на NK клетките и поддържа NK клетките във фаза G1.

Стареещите NK клетки показват висока експресия на биомаркери, свързани със стареенето, като CD16, PD-1, TIM3 и KIR, и ниска експресия на NKG2A. Установихме, че нивата на експресия на свързаните със стареенето биомаркери NKG2A (Фигура 1а) (*P < 0.05) се повишават, докато експресията на CD16 (Фигура 1b), TIM3 (Фигура 1c) ), PD-1 (Фигура 1d) и KIR (Фигура 1e) (*P <0,05) бяха намалени след лечение с калцитриол в продължение на 72 часа. Обратните ефекти са положително корелирани с концентрацията на калцитриол (допълнителна фигура 1).

Разширихме клетки от проби от човешка периферна кръв in vitro. След това изолирахме NK клетките (CD{{0}}CD56 плюс) чрез сортиране на магнитни перли (фигура 1f). След това сортираните NK клетки се култивират с различни концентрации на калцитриол или рапамицин в продължение на 72 часа. Резултатите от оцветяването с CCK8 показват, че скоростта на растеж на третирани с калцитриол NK клетки с висока концентрация (10- [7] M) е по-бавна от тази на отрицателната контролна група (NC) (*P < {{17 }}.05) (Фигура 1g). В допълнение, калцитриолът регулира NK клетъчния цикъл. След третиране с калцитриол в продължение на 48 часа, NK клетките показват високо зависимо от концентрацията на калцитриол изместване към фазата G1 (*P <0.05), докато делът на клетките във фазата G2 (#P <0.05) намалява. Делът на третирани с калцитриол NK клетки в S фазата не показва промяна, независимо от концентрацията на калцитриол (Фигура 1h, Допълнителна фигура 2). След това тествахме дали това спиране на G1 фазата, получено от калцитриол, индуцира апоптоза на NK клетки и открихме, че апоптотичният биомаркер на NK клетките, Т клетъчният имуноглобулин и домейнът на имунорецепторен тирозин-базиран инхибиторен мотив (ITIM) (TIGIT), не показват значителна промяна (P > 0,05 , NS) (Фигура 1i). Тези резултати предполагат, че добавянето на калцитриол намалява скоростта на растеж на NK клетките, намалява тяхната пролиферация и индуцира спиране на G1 фазата на NK клетките, вместо да причинява апоптоза.

3.2 Калцитриолът намалява освобождаването на възпалителни цитокини в NK клетките и инхибира цитотоксичността на NK клетките

Възпалението е хронично нискостепенно възпаление. Той ускорява стареенето на NK клетките, тъй като NK клетките участват в това хронично възпаление. Фигура 2а показва, че нивата на IL-5, IL-13, IFN- и TNF- значително намаляват във всички групи в сравнение с отрицателната контрола (*P < 0.05). IFN- и TNF- са добре известни провъзпалителни цитокини, но някои проучвания също показват провъзпалителните свойства на IL-5. Съобщава се, че IL-13 допринася за различни видове възпаление на лигавицата, като алергична астма, улцерозен колит, еозинофилен езофагит и няколко заболявания, свързани с фиброза.

Въпреки това, цитотоксичността на NK клетките включва главно освобождаване на възпалителни цитокини и дегранулация на клетките. Ние маркирахме K562 клетки с DIO и съвместно култивирахме DIO-K562 клетките с третирани с калцитриол NK клетки в продължение на 4 часа. Процентът на DIO плюс PI плюс клетките е по-нисък във всички групи със съотношение ефектор (E)/мишена (T), отколкото в отрицателната контрола (*P < 0.05) (Фигура 2b, ° С). Изведената експресия на клъстер на диференциация 107 (CD107) показва по-ниска дегранулация (*P <0.05) (Фигура 2d). Тези резултати показват инхибирането на NK-убиващата функция от калцитриол.

3.3 Калцитриол активира експресията на SIRT1- ∆Exon8 и свързания със стареенето SIRT1/pERK път

За да изследваме анти-стареещите ефекти на калцитриола върху NK клетките, открихме свързаните със стареенето сигнални пътища чрез имуноблотинг. Беше извършен Western blotting анализ за оценка на нивата на експресия на VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 и PERK в третирани с калцитриол NK клетки. Статистическият анализ показа, че калцитриолът активира VDR/SIRT1/pERK оста при високи концентрации. Междувременно калцитриолът активира експресията на SIRT1-∆Exon8 (*P < 0.05). (Фигура 3а).

Фигура 1. Свързан със стареенето фенотип, клетъчна експанзия и анализ на клетъчния цикъл на NK клетки. (ae) Човешките NK клетки, третирани с калцитриол или рапамицин в продължение на 72 часа, показват следните клетъчни биомаркери: член А на естествена група убийци 2 (NKG2A), клъстер на диференциация 16 (CD16), Т клетъчен имуноглобулин и протеин 3, съдържащ домейн на муцин ( TIM3) програмирана клетъчна смърт-1 (PD-1) и рецептор, подобен на имуноглобулин убиец (KIR), които са свързани със стареенето. 50 nM рапамицин (RAPA) се използва като положителна контрола. n=3 за всяка група. *P < 0.05 и **P < 0.01 бяха сравнени с групата на отрицателната контрола (NC). (f) NK клетки (вдясно), изолирани от човешки периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMCs, вляво) чрез сортиране на магнитни перли. (g) Анализ на клетъчна пролиферация, измерен чрез комплект за броене на клетки 8 (CCK8). (h) Ефект на калцитриол или рапамицин върху клетъчния цикъл в сортирани nk клетки след третиране в продължение на 72 часа, wp 0.0, 0.05 и fp <0.05 показват значимото разлики във фазите G1, S и G2, съответно. Всички групи бяха сравнени съответно с NC. n=3. ) Процентът на T cellimmunoa глобулин и имунорецепторен тирозин-базиран инхибиторен мотив (M) домейн (TGI)-позитивни NK клетки след лечение с калцитриол или рапамицин за 72 часа*p <0,05 и **p <0,01 бяха сравнени с NC. n=3.

3.4 Калцитриолът устоява на стареенето на NK клетките, предизвикано от оксидативен стрес in vitro

Широко прието е, че стареенето е причинено от натрупване на окислително увреждане поради голямото количество доказателства, открити през годините [31]. Ние култивирахме NK клетките с различни концентрации на H2O2 в продължение на 24 часа и установихме, че 1{{1{{20}}}0 μM е най-близката концентрация до средната летална доза (LD50) (Фигура 3b) . Експресията на TIM3 в NK клетъчната популация се увеличава чрез добавяне на H2O2, докато експресията намалява след третиране с калцитриол (*P <0.05) (Фигура 3c). В допълнение, стареещите NK клетки бяха оцветени в синьо в присъствието на -галактозидаза. Този син цвят на клетките е специфичен отличителен белег на стареещите клетки. Статистическият анализ показва, че нетретираните NK клетки имат по-слаба клетъчна -галактозидазна активност, докато NK клетките, изложени на H2O2, показват повишена -галактозидазна активност. Калцитриолът намалява -галактозидаза-позитивната популация, което показва наличието на по-малко стареещи клетки (*P <0,05) (Фигура 3d). Намален потенциал на митохондриалната мембрана също се наблюдава в различни стареещи клетки от няколко вида бозайници. Ние оценихме потенциала на митохондриалната мембрана на NK клетките в това изследване. Статистическите резултати показват, че H2O2 значително намалява клетъчната активност на NK клетките в сравнение с тази на нетретираните клетки, докато калцитриолът увеличава увреждането, причинено от H2O2 (*P <0.05) (Фигура 3e).

Фигура 2. Ефекти на калцитриол върху функциите на NK клетките. ( а ) Анализ на цитокина, освободен от третирани с калцитриол NK клетки за 48 часа. b) Резултатите от флуоресцентно-активирано клетъчно сортиране (FACS) показват мъртви K562 клетки, маркирани с 3,3 -октадецил-оксакарбоцианинD1O) и пропидиев йодид (P). K562 клетките се култивират съвместно с различни съотношения на третирани с калцитриол Nk клетки за 4 часа. (C) FACS-анализ на мъртви K562 клетки в анализи за убиване. ( d ) Ефектите на дегранулация на третирани Nk клетки при анализи за убиване. n=3 за eaciyroup. *p < 0.05 и **p < 0,01 бяха сравнени с NC

3.5 Калцитриолът е устоял на апоптозата на NK клетките, предизвикана от оксидативен стрес in vitro

След това измерихме броя на апоптотичните клетки. Резултатите от поточната цитометрия показват, че лечението с 100 μM H2O2 за 24 часа води до значителна апоптоза на NK клетките. Въпреки това, лечението с калцитриол намалява апоптотичното съотношение (*P <0,05) (Фигура 4а). Всички горепосочени резултати показват устойчивостта на калцитриол срещу оксидативен стрес, причинен от H2O2. Въпреки това, ние открихме апоптотични протеини в NK клетки при оксидативен стрес. Преди третиране с H2O2, 10- [7] М калцитриол се добавя към NK клетките за 24 часа. Нивата на протеини, свързани с апоптозата, каспаза-3 p17 и каспаза-3 p20, се повишават значително след третиране с H2O2. Калцитриолът намалява апоптозата, получена от H2O2-, и понижава експресията на каспаза-3, p17 и каспаза-3 p20 (*P <0,05) (Фигура 4b). Тези резултати показват, че калцитриолът е устоял на апоптоза, предизвикана от H2O2.

Фигура 3. Theефекти против стареенена калцитриол върху NK клетки. (a) Експресията на рецептора на витамин D (VDR), сиртуин 1 (SIRT1), SIRT1- ∆Exon8 и протеин киназа R-подобна ендоплазмена ретикулум киназа (pERK) в NK клетки беше открита чрез Western blotting анализ след лечение с калцитриол за 48 часа. Глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) се използва като контрола на натоварването. Стълбова диаграма, илюстрираща резултатите от Western blotting (n=3). *P < 0.{{10}}5 и **P < 0.01 бяха сравнени с NC (n=3). ( b ) Крива на смъртност при дозиране на NK клетки след третиране с водороден пероксид (H2O2) за 24 часа. ( c ) Процент на TIM3 клетки, проявяващи висока експресия след третиране със 100 μM H2O2 за 24 часа. (d) Свързаното със стареенето -галактозидаза оцветяване и резултати от анализа. Стареещите клетки бяха оцветени в синьо и обозначени с червени стрелки. Скала, 50 μm. ( e ) NK клетките бяха оцветени с Hoechst и Chloromethyl-X-Rosamine (CMXRos), за да се определи местоположението на клетката и потенциала на митохондриалната мембрана. Стареещите и апоптотичните клетки бяха Hoechst плюс CMXRos− и обозначени с бели стрелки. Скала, 50 μm. Статистическият анализ показва относителна интензивност на флуоресценция. *P <0,05 и **P <0,01 бяха сравнени с групата H2O2 на фигури C, D и E (n=3).

Фигура 4. Антиапоптозните ефекти на калцитриол върху NK клетки. (a) Антиапоптотични ефекти на калцитриол при H2O2-индуцирано увреждане. FACS анализът показа процента на апоптотичните NK клетки след третиране с 100 μM H2O2 за 24 часа. ( b ) Нивата на експресия на каспаза -3 p20 и каспаза -3 p17 в NK клетки бяха открити чрез Western blotting анализ след третиране със 100 μM H2O2 за 24 часа. GAPDH се използва като контрола на натоварването. Стълбова диаграма, илюстрираща резултатите от Western blotting (n=3). *P <0,05 беше сравнено с H2O2 групата.

4. Дискусия

Дългосрочното взаимодействие между възпалението и оксидативния стрес е важен фактор за стареенето. В допълнение, възпалението и оксидативният стрес са синергични [32]. Излишните ROS, генерирани от оксидативния стрес, атакуват клетките на тялото. По време на този процес възпалителните фактори се освобождават от активираната имунна система, за да убият анормалните клетки, което води до по-нататъшно генериране на ROS. Липсата на калцитриол може да причини автоимунни заболявания, хронични метаболитни заболявания и тумори. Въпреки това, малко се знае за анти-стареещите ефекти на калцитриола върху имунната система, особено върху NK клетките.

В това проучване изследвахме анти-стареещите ефекти на калцитриола върху NK клетките. Открихме, че калцитриолът повишава експресията на NKG2A, като същевременно намалява експресията на KIR in vitro. CD56-CD16 плюс субпопулацията на NK клетки, за която е известно, че е свързана с хронично възпаление, е значително увеличена при възрастните хора [33]. Следователно, намаляването на експресията на CD16, предизвикано от калцитриол, може да се отдаде на неговия противовъзпалителен ефект. Съобщава се, че TIM-3 и PD-1 са инхибиторни и изчерпващи рецептори на NK клетките. Нашето проучване показа, че cal citriol понижава нивата на експресия на TIM-3 и PD-1 и предотвратява апоптозата на NK клетките.

В допълнение, калцитриолът инхибира експанзията на NK клетки и поддържа NK клетъчната популация в G1 фаза in vitro. Клетките в S-фаза обаче не са засегнати. TIGIT, който е известен като фактор на контролна точка на NK клетки, остава непроменен. Тези резултати показват, че Фигура 4. Антиапоптозните ефекти на калцитриол върху NK клетки. (a) Антиапоптотични ефекти на калцитриол при H2O2-индуцирано увреждане. FACS анализът показа процента на апоптотичните NK клетки след третиране с 100 μM H2O2 за 24 часа. ( b ) Нивата на експресия на каспаза -3 p20 и каспаза -3 p17 в NK клетки бяха открити чрез Western blotting анализ след третиране със 100 μM H2O2 за 24 часа. GAPDH се използва като контрола на натоварването. Стълбова диаграма, илюстрираща резултатите от Western blotting (n=3). *P <0,05 беше сравнено с H2O2 групата. БИОИНЖЕНЕРЕН 6851калцитриол не води до смъртта на NK клетките, но само забавя скоростта на разширяване на NK клетките.

Добре известно е, че възпалението води до имунодефицит [34,35]. Освен това открихме, че калцитриолът намалява нивата на IL-5, IL-13, IFN- и TNF- в NK клетките. Цитотоксичността на NK клетките е частично медиирана от освобождаването на възпалителни фактори [36]. Освен това, има намаление на смъртността на туморни клетки K562 и дегранулация на NK клетки. Тези резултати бяха в съответствие с нашите очаквания. Рапамицин е добре известно лекарство, което намалява скоростта на метаболизма, за да предотврати стареенето [37], което се използва като положителна контрола в това проучване. Това води до имуносупресия и увеличава потенциалния риск от тумор и туморно натоварване. Това бреме е потвърдено при миши модели на рак на гърдата [38]. Остава неизвестно дали калцитриолът проявява подобни ефекти като рапамицин. Трябва да се извършат повече проучвания върху животни и клинични изследвания, за да се проверят техните ефекти върху човешкото тяло.

И накрая, проучихме ефектите на калцитриола върху антиоксидантното стареене. Ресвератролът, добре известно лекарство против стареене, може да регулира надолу NF-κB пътя чрез активиране на оста SIRT1/PERK. Доказано е също, че това понижено регулиране е полезно при невродегенеративни разстройства и сърдечно-съдови заболявания [39]. Деацетилирането на SIRT1 е свързано с метаболитен контрол и митохондриална биогенеза. При този тип регулация повишените нива на SIRT1 могат да насърчат натрупването на активиран от пероксизомен пролифератор рецептор гама коактиватор-1 алфа (PGC-1) в ядрото, което води до транскрипция на гени, които са необходими за митохондриална функция [40]. Освен това, SIRT1 потиска мишената на бозайниците на сигналния път на рапамицин (mTOR), който може да защити нервите и да устои на стареенето на мозъка при мишки [41]. В това проучване ние идентифицирахме подобен регулаторен път за калцитриол. Калцитриолът активира SIRT1 чрез VDR и повдига оста SIRT1/pERK.

Освен това открихме, че калцитриолът повишава експресията на SIRT1-∆Exon8. Напреженията са известни като фактор за повишаване на регулацията на SIRT1-∆Exon8. Въпреки че самият SIRT1-∆Exon8 показва намалена активност на деацетилиране на p53, той упражнява допълнителен ефект на деацетилиране върху p53, когато се експресира заедно със SIRT1 в пълна дължина [42]. Този ефект показва антиапоптотичната функция на калцитриол върху NK клетки. Въпреки това, ролята на SIRT1-∆Exon8 в свързаните с възрастта пътища остава да бъде по-добре разбрана. Тъй като спадът на SIRT1 може да се дължи на окислително увреждане [43], ние установихме модел на остро стареене на NK клетки in vitro, използвайки H2O2. Окислителното стареене, предизвикано от H2O2, повишава експресията на TIM3, както и активността на -галактозидазата в NK клетките. Ние открихме, че калцитриолът устоява на окислително увреждане и поддържа митохондриалната активност и клетъчната жизнеспособност на NK клетките, като същевременно предотвратява клетъчната апоптоза. Калцитриолът обаче все още не е идентифициран като лекарство против стареене в клиничната медицина, тъй като са необходими повече доказателства относно ефектите на това лекарство против стареене in vivo. В обобщение, ние предоставихме предварителни доказателства за замесване на анти-стареещите ефекти на калцитриол върху NK клетки in vitro. Вярваме, че ефектите от това лекарство трябва да бъдат допълнително проучени в бъдещи проучвания върху животни и клинични проучвания.

5. Заключение

В това проучване ние демонстрирахмеефекти против стареенена калцитриол върху NK клетки. Калцитриолът обърна израза набиомаркери за старееневърху NK клетки. Той забави усилването на NK и ги задържа във фаза G1. В допълнение, калцитриолът инхибира освобождаването на възпалителни цитокини и понижава дегранулацията на NK клетките. Активирането на SIRT1-∆Exon8 и оста VDR/SIRT1/pERK от калцитриол може да бъде основният механизъм на ефекта на калцитриол против стареене въз основа на всичко по-горе. И накрая, калцитриолът устоява на окислителното стареене на NK клетки in vitro. По-нататъшните проучвания трябва да се съсредоточат върху животни и клинични изследвания.

Акценти

(1) Калцитриолът намалява експресията на биомаркери, свързани със стареенето, включително CD16, TIM3, PD-1, KIR, и повишава експресията на NKG2A на NK клетки. (2) Калцитриолът е в състояние да инхибира пролиферацията на NK клетки и да ги спре в G1 фаза. (3) Калцитриолът намалява освобождаването на основни възпалителни фактори като IL-5, IL-13, IFN- и TNF- на NK клетките. (4) Ефектът против стареене на калцитриола върху NK клетките може да се постигне чрез пътя на сигнала Sirt1- pERK.

Благодарности Бихме искали да благодарим на всички членове на персонала в нашата група за тяхната подкрепа и на Комитета за наука и технологични иновации в Шенжен за тяхната финансова подкрепа за това проучване.

Финансиране Тази работа беше подкрепена финансово от Комитета за наука и технологични иновации в Шенжен (JCYJ20170412155231633), Фонд за изграждане на ключова медицинска дисциплина в Шенжен (№ SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech и Медицинския проект Sanming в Шенжен (№ SZSM202011010); Комитет за иновации в областта на науката и технологиите в Шенжен [JCYJ20170412155231633]; Фонд за изграждане на ключова медицинска дисциплина в Шенжен [No. SZXK062]; Медицински проект Sanming в Шенжен [No. SZSM202011010].

Етично одобрение Всички процедури са одобрени от Комитета по етика на Shenzhen Luohu People's Hospital (ZLNK 12/2019, Шенжен, Китай). Беше получено информирано съгласие за експериментиране с човешки проби.

Декларация за разкриване Всички автори одобриха изпращането на този ръкопис. Авторите декларират, че нямат известни конкурентни финансови интереси или лични взаимоотношения, които биха могли да повлияят на работата, докладвана в този документ.

Препратки

[1] Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, et al. Нарушеното имунно наблюдение ускорява натрупването на стареещи клетки и стареенето. Nat Commun. 2018; 9 (1): 5435.

[2] López-Otín C, Blasco MA, Partridge L, et al. Отличителните белези на стареенето. клетка. 2013; 153: 1194–1217.

[3] Hodgins JJ, Khan ST, Park MM, et al. Killers 2.0: Терапиите с NK клетки в челните редици на контрола на рака. J Clin Invest. 2019; 129 (9): 3499–3510.

[4] Zhu H, Blum RH, Bjordahl R, et al. Плурипотентни NK клетки, получени от стволови клетки с висок афинитет, неразцепващ се CD16a, медиират подобрена антитуморна активност. Кръв. 2020; 135 (6): 399–410.

[5] Mandal A, Viswanathan C. Естествени клетки убийци: в здраве и болест. Hematol Oncol стволови клетки Ther. 2015; 8 (2): 47–55.

[6] Le Garff-Tavernier M, et al. Човешките NK клетки показват големи фенотипни и функционални промени през целия живот. Старееща клетка. 2010; 9 (4): 527–535.

[7] Le Garff-Tavernier M, Béziat V, Decocq J, et al. Моделите на експресия на NKG2A, KIR и CD57 определят процес на CD56dim NK-клетъчна диференциация, отделена от NK-клетъчно образование. Кръв. 2010; 116 (19): 3853–3864.

[8] Manser AR, Uhrberg M. Свързани с възрастта промени в репертоара на естествените клетки убийци: въздействие върху функцията на NK клетките и имунното наблюдение. Рак Immunol Immunother. 2016; 65 (4): 417–426. [9] Bi J, Tian Z. NK Клетъчно изчерпване. Преден имунол. 2017; 8: 760.

[10] Furman D, Campisi J, Verdin E, et al. Хроничното възпаление в етиологията на заболяването през целия живот. Nat Med. 2019; 25 (12): 1822–1832.

[11] Liu Y, et al. Цитомегаловирусно пептид-специфично антитяло променя естествената хомеостаза на клетките убийци и се споделя при няколко автоимунни заболявания. Микроб клетъчен гостоприемник. 2016; 19 (3): 400–408.

[12] Campus X, Pera A, Solana R, et al. NK клетки при здравословно стареене и заболявания, свързани с възрастта. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:195956.

[13] Liu Y, Mu R, Gao YP, et al. Ефект на стареенето върху nk клетъчната популация и тяхната пролиферация при условия на ex vivo култура. Анален клетъчен патол (Amst). 2018; 2018: 7871814.

[14] Синтов AC, Yarmolinsky L, Dahan A, et al. Фармакологични ефекти на витамин D и неговите аналози: последните разработки. Drug Discov днес. 2014; 19 (11): 1769–1774. [15] Halicka HD, Zhao H, Li J, et al. Отслабване на сигнала за конститутивно увреждане на ДНК чрез

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950