Базиран на ЯМР метаболомен анализ за ефектите от добавянето на -кетоглутарат върху C2C12 миобласти в различни енергийни състояния

Щракнете тук, за да получите Cistanche добавки против стареене и облекчаване на умората

1. Въведение

Скелетният мускул е най-големият орган в човешкото тяло и поддържа нормалната жизнена дейност.Продължително физическо натоварванеили патологияl процесите на болестите предизвикват увреждане на мускулитеилинедостатъчно снабдяване на мускулите с енергия, по това време възстановяването на мускулната сила и функция е особено важно. Различни хранителни добавки са използвани за насърчаване на хипертрофията на скелетните мускули и подобряване на спортните постижения [1]. Като пресечна точка на органичния въглероден и азотен метаболизъм и едновременно критичен междинен продукт в цикъла на ТСА, -кетоглутаратът (AKG) показва плейотропни ефекти за подобряване на мускулната ефективност в клинични експерименти и експерименти с животни [2–9]. Например, AKG може да намали увреждането на чревната лигавица [8] и възпалението [9], да смекчиразвитие на колоректален рак[4] и чернодробна фиброза [5], насърчават растежа [6] и намаляват заболеваемостта изабавяне на стареенето[7]. Предишни разработки показаха, че добавката на AKG може да облекчи мускулната загуба чрез парентерално приложение в модел на травма на пациенти, подложени на тотална смяна на тазобедрената става [2], и да насърчи мускулна хипертрофия и протеинов синтез чрез Akt/mTOR сигнални пътища [10,11]. В случай на мускулна дистрофия на Дюшен, добавянето на AKG може да предотврати мускулна атрофия и дисфункция чрез PHD3/ADRB2-медиирания път [12]. Нашата предишна работа също показа, че добавянето на AKG може значително да улесни пролиферацията на C2C12 миобласти и да облекчи атрофията на C2C12 миотуби, култивирани в среда без глюкоза [13]. Като се има предвид, че глюкозата е основният източник на енергия за поддържане на нормални физиологични функции на скелетните мускули, ефектите от добавките на AKG за подобряване на мускулната ефективност са силно зависими от нивото на глюкозата в скелетните мускули. Разликите в индуцираните от AKG ефекти в скелетните мускули между различните енергийни състояния са неясни.

AKG участва в синтеза на аминокиселини, витамини иорганични киселинииенергиен метаболизъмв тялото, което включва превръщането на AKG в глутамат от глутамат дехидрогеназа и последващото амидиране на глутамат с амоняк от глутамин синтетаза. AKG осигурява енергията за клетъчния растеж чрез TCA цикъла и окислителното фосфорилиране и насърчава клетъчния метаболизъм и сигнализиране чрез взаимодействие с неговия рецептор OXGR (G протеин-свързан рецептор) на клетъчната мембрана [14,15]. Освен това, AKG може да регулира митохондриалния окислителен метаболизъм и да насърчи разрешителното епигенетично състояние чрез медииране на ранния преход на състоянието на ембрионалните клетки и развитието на зародишните клетки [16]. Освен това, предизвиканият от упражнения AKG може да стимулира своя рецептор OXGR1 в надбъбречните жлези, за да контролира термогенезата и разграждането на триглицеридите в мастната тъкан и да предизвика благоприятни ефекти върху метаболизма [17].

Въпреки това са проведени малко проучвания за разкриване на индуцирани от AKG метаболитни промени на скелетните мускули в различни енергийни състояния и основните метаболитни механизми. Напоследък беше използван метаболомичен анализ за систематично изясняване на молекулярните механизми, лежащи в основата на благоприятните ефекти на хранителните добавки. Промените на метаболитите, действащи като продукти надолу по веригата на генната транскрипция, могат интуитивно да отразяват цялостните метаболитни промени. Като особено подходящи техники за количествено откриване на промени в метаболитните нива в биофлуиди, тъкани и клетки, 1H ядрено-магнитен резонанс (NMR) спектроскопия с висока разделителна способност се прилага широко в метаболомните анализи. Показателно е, че базираното на ЯМР метаболомно профилиране има няколко предимства като висока възпроизводимост, количествено измерване без предразсъдъци и удобна подготовка на пробите [18,19]. Преди това извършихме метаболомични анализи, базирани на ЯМР, за да изясним както ефектите от добавянето на креатин върху миобластите C2C12 [20], така и ефектите от добавянето на аланил-глутамин върху миобластите, увредени от енергийна депривация [21].

2. Резултати

2.1. Пролиферация и диференциация на C2C12 миобласти с AKG добавки

C2C12 миобластни клетки, култивирани в нормална растежна среда със и без AKG добавка, бяха групирани като Nor-A и Nor, докато тези в среда с ниско съдържание на глюкоза на растеж с или без AKG добавка бяха групирани като Low-A и Low. В съответствие с предишното проучване [10], Nor-A клетките с добавка на AKG в концентрация от 2 mm показват значително повишена клетъчна жизнеспособност в сравнение с Nor клетките (Фигура S1).

Следователно концентрацията на AKG от 2 mm се използва в експериментите за оценка на предизвиканите от AKG промени в пролиферацията и диференциацията на миобластите. В сравнение с Nor клетките, Low клетките показват дълбоко намалена скорост на пролиферация поради енергиен дефицит (Фигура 1А). Въпреки че добавянето на AKG не причинява значително различна морфология на миобластите в двете енергийни състояния, то не само повишава скоростта на пролиферация на Low клетки, култивирани в среда с ниско съдържание на глюкоза, но също така подобрява тази на Nor клетки, култивирани в нормална среда в съответствие с предишни проучвания [10,12]. Броят на клетките за дадена област се преброява за четирите групи миобласти (n=4 за групата): Nor, 563.8 ± 10.4; Nor-A, 624.0 ± 10.8; Ниска, 493,8 ± 14,5; Ниска A, 547.0 ± 11.7 (Фигура 1B). Струва си да се отбележи, че Low-A клетките не показват статистически различни клетъчни номера от Nor клетките, което показва, че добавката на AKG може да възстанови броя на клетките за миобластите при условия на култура с ниска глюкоза (Фигура 1B).

Фигура 1, Способности за пролиферация и диференциация на C2C12 миобласти при условия на нормална култура и ниска. глюкозна култура. (A) Морфология на миобластите. (B) Номера на клетки, съответстващи на панел A (n=4). (C) Жизнеспособността на клетките по отношение на Nor клетки, анализирана чрез анализ на MTS клетъчна пролиферация (n=5). (D) MyoD1 експресии в миобласти, анализирани чрез Western blot. Анти-GAPDH антитялото се използва за стандартизиране на количеството протеин във всяка лента. (E) Статистически анализ, съответстващ на панелите (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

В допълнение, MTS анализът беше извършен, за да се сравнят количествено скоростите на пролиферация на четирите групи клетки (Фигура 1C). Клетките с ниска концентрация имат значително намалена скорост на пролиферация в сравнение с клетките Nor, което показва, че средата с ниско съдържание на глюкоза не благоприятства пролиферацията на клетките. Значително, добавянето на AKG повишава скоростта на пролиферация на Nor-A и Low-A клетки по отношение съответно на Nor и Low клетки. Обърнете внимание, че Low-A клетките показаха пролиферативна способност по-ниска от Nor клетките, което означава, че добавянето на AKG само частично възстановява пролиферацията на клетки, култивирани в среда с ниско съдържание на глюкоза

Експресията на протеина миогенна диференциация 1 (MyoD1) обикновено се използва за характеризиране на способността за диференциация на клетките. По този начин ние сравнихме количествено експресиите на MyoD1 между четирите групи клетки (Фигура 1D). Ниските клетки показват дълбоко намалена способност за диференциация в сравнение с Nor клетките. Показателно е, че добавянето на AKG повишава способността за диференциация на клетките, култивирани както в нормална среда, така и в среда с ниско съдържание на глюкоза, както е показано от около 30 процента увеличение на MyoD1 експресията в Nor-A и Low-A клетки. Трябва да се отбележи, че Low-A клетките не показват статистически значимо различна експресия на MyoD1 от Nor клетките, което предполага високата ефективност на добавките на AKG за възстановяване на способността за диференциация на клетки, култивирани в среда с ниско съдържание на глюкоза.

Освен това анализирахме способностите за диференциация на миотубите за четирите групи C2C12 миобласти. Миотубите се образуват чрез сливане на миобласти, култивирани в нормална и нискогликозна среда за диференциация със или без AKG добавки (Фигура S3). Морфологиите на миотубите C2C12 показват, че културата с ниско съдържание на глюкоза нарушава способността за диференциация на миотубите на клетките и добавянето на AKG може да насърчи диференциацията на миотубите на миобласти, култивирани както в нормална среда, така и в среда с ниска глюкоза.

2.2. NMR спектри на водни екстракти от C2C12 миобласти

Типичните 850 MHz 1H NMR спектри са записани на водни екстракти, получени от групите Nor, Nor-A, Low и Low-A на C2C12 миобласти (Фигура 2A). Общо 34 метаболита бяха определени и обобщени в таблица S1. Резонансните присвоявания на метаболитите бяха потвърдени чрез използване на 2D 1H-13C HSOC и 1H-H TOCSY спектри (фигури S4 и S5). Визуалната проверка на NMR спектрите показва, че култивирането на миобласти с AKG добавки води до значително натрупване на вътреклетъчен AKG в Nor-A и Low-A клетки (Фигура 2B).

Фигура 2, Средни 850 MHz lH спектри на ядрено-магнитен резонанс (NMR), записани върху водни екстракти, получени от групите Nor, Nor-A, Low и Low-A на C2C12 миобласти. (A) Сравнение на средните NMR спектри на четирите групи. Вертикалните мащаби се поддържат постоянни във всички lH NMR спектри. Водната област (4.7-5.2 ppm) беше премахната (B) Локални усилени области на пикове на а-кетоглутарат (AKG). Синя/зелена/жълта/червена линия: спектрални области от групите Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, а-кетоглутарат; PC, О-фосфохолин; GPC, sn-глицеро-3-фосфохолинUDP-глюкоза, уридин дифосфат глюкоза: CTP, sn-глицеро-3-фосфохолин; NAD плюс, никотинамид аденин динуклеотид AXP аденин моно/ди/трифосфат.

2.3. Многовариантен анализ на данни за изследване на клетъчни метаболитни профили

Освен това проведохме многовариантен анализ на данните върху NMR спектралните данни за метаболитно профилиране на четирите групи C2C12 миобласти. Първо създадохме три неконтролирани PCA модела с първите два компонента (PC1, PC2), за да прегледаме тенденциите на групиране и да разкрием метаболитни разлики между групите миобласти. Резултатните графики на ThePCA показват, че метаболитният профил на клетките, култивирани в среда с ниско съдържание на глюкоза, е ясно разграничен от този, култивиран в нормална среда (Фигура 3А), а добавката на AKC значително променя метаболитните модели на клетките, култивирани както в нормална среда, така и в среда с ниско съдържание на глюкоза (Фигура 3B,C). Въпреки това, метаболитната разлика между групите Nor-A и Nor е по-голяма от тази между групите Low-A и Low, което предполага, че ефектите от добавянето на AKG върху метаболитния профил на миобластите са силно зависими от енергийното състояние на клетките.

Фигура 3. Многовариантни анализи за 'HNMR спектрите са записани върху водни екстракти, получени от C2C12 миобласти от групите Nor, Nor-A, Low и Low-A. (AC) PCA точкови графики на групите Low и Nor, групите Low-A и Low, групите Nor-A и Nor; (DF) OPIS-DA оценява графиките на групите Low и Nor (R2: 0.999, 02: 0.996), групите Low-A и Low (R2: 0.918: 02: 0.761), групите Nor-A и Nor (R2: 0,927: 02: 0,838). Елипсите показват границата на достоверност от 95 процента.

Освен това, ние създадохме три контролирани OPLS-DA модела, за да илюстрираме метаболитни разделяния между четирите групи миобласти (Фигура 3D-F). Както се очакваше, моделите OPLSDA максимизираха метаболитните разлики между четирите групи чрез запазване на информацията за корелирана ортогонална променлива и филтриране на информация за некорелирана ортогонална променлива. Освен това проведохме тестове за произволна пермутация (n=200), за да оценим надеждността на моделите OPLS-DA (Фигура S6), които показват валидността на установените модели OPLS-DA.

2.4. Идентификации на диференциални и важни метаболити

За количествено сравняване на метаболитните нива между четирите групи C2C12 миобласти, ние изчислихме относителните нива на идентифицираните метаболити въз основа на техните относителни интеграли (Таблица S2). Драстично добавянето на AKG повишава вътреклетъчните нива на AKG в групите Nor-A и Low-A, но не променя значително тези в групата Nor и Low. Ние проведохме t-теста на Student, за да идентифицираме диференциални метаболити с критерий p < 0.05 (Фигура 4). Сравнението на Nor срещу Low идентифицира 29 различни метаболита (Фигура 4A), включително 18 подобрени метаболита (левцин, изолевцин, валин, ацетат, глутамат, глутамин, метионин, аспартат, лизин, креатин, PC (О-фосфохолин)таурин, тирозин , фенилаланин, хистидин, NAD плюс, формиат, AXP), а 11 са отказали Metabo. лити (глутатион, пироглутамат, фосфокреатин, бета-аланин, GPC, глюкоза, глицин, ацетат, треонин, GTP, UDP-глюкоза). Сравнението на диференциални метаболити с нисък A срещу ниско идентифицирани (Фигура 4B), включително 7 повишени метаболита (етанол, AKGбета-аланин, PC, таурин, глицин и GTP) и 3 понижени метаболита (глутамин, лизин и миоинозитол). Сравнението на Nor-A срещу Nor идентифицира 18 различни метаболита (Фигура 4C), включително 6 метаболита с повишена регулация (AKG, пироглутамат, глутамин, лизин, глюкоза, лактат) и 12 метаболита с понижена регулация (аланин, ацетат, глутатион метионин, фосфокреатин, PC, миоинозитол, глицин, треонин, GTP, UDP-глюкоза и AXP).

Фигура 4. Относителните интензитети на диференциалните метаболити бяха идентифицирани от сравнения по двойки между четирите групи C2C12 миобласти. (A) Ниска срещу Ниска; (B) Ниска-A срещу Ниска; (C) Nor-A срещу Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} за всяка група.

Освен това използвахме моделите OPLS-DA за идентифициране на важни метаболити с критерий VIP> 1 (Фигура 5). Общо 12, 10 и 10 важни метаболита бяха идентифицирани от OPLS-DA моделите на Nor-A срещу Nor, Nor срещу Low, Low-A срещу Low.

Фигура 5. VIP резултати на важни метаболити бяха идентифицирани от сравнения по двойки между четирите групи C2C12 миобласти. (A) Ниска срещу Ниска; (B) Ниска-A срещу Ниска; (C) Nor-A срещу Nor. Червен/син шрифт означава повишени/намалени нива на метаболита.

Комбинацията от идентифицираните важни метаболити и диференциалните метаболити дава характерни метаболити (Таблица 1). Сравненията по двойки на Low срещу Nor, Low-A срещу Low и Nor-A срещу Nor идентифицират съответно 10, 6 и 10 характерни метаболита, което показва, че ефектите от добавките на AKG върху миобластите са тясно свързани с енергията състояние на клетките.

2.5. Идентифициране на значително променен метаболитен

Пътища Извършихме анализ на метаболитния път, за да идентифицираме значително променени метаболитни пътища (значими пътища) въз основа на нивата на метаболитите, идентифицирани от сравненията по двойки между четирите групи C1C12 миобласти (Фигура S7; Таблица 2 и Таблица S3). Анализът на Nor срещу Low идентифицира 11 значими пътя: (1) метаболизъм на аланин, аспартат и глутамат; (2) Метаболизъм на глицин, серин и треонин; (3) Метаболизъм на глутатион; (4) метаболизъм на D-глутамин и D-глутамат; (5) Метаболизъм на нишесте и захароза; (6) метаболизъм на бета-аланин; (7) Метаболизъм на таурин и хипотаурин; (8) Метаболизъм на фенилаланин; (9) Биосинтеза на фенилаланин, тирозин и триптофан; (10) Метаболизъм на никотин и никотинамид; (11) Метаболизъм на хистидин. Този важен път е свързан с енергийния метаболизъм, оксидативния стрес и анаплеротичния поток от цикъла на TCA.

Анализът на Nor-A срещу Nor идентифицира само първите пет значими пътя 1–5, като изключи останалите шест пътя 6–11. За разлика от това, анализът на Low-A срещу Low идентифицира само шест значими пътя: първите четири пътя 1–4, споделени от сравненията на Low-A срещу Nor, Nor-A срещу Nor; две пътеки 6–7, споделени от сравнението на Ниско срещу Нор. Имайте предвид, че добавянето на AKG не променя значително път 5 (метаболизъм на нишесте и захароза) в клетки, култивирани в среда с ниско съдържание на глюкоза, но пречи на два други пътя (метаболизъм на бета-аланин и метаболизъм на таурин и хипотаурин). За да визуализираме индуцираните от AKG промени в характерните метаболити, ние проектирахме тези метаболити върху метаболитна карта, базирана на базата данни на Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG) (Фигура 6). KEGG се използва широко като един от основните източници на данни за реконструиране на метаболитни мрежи и подчертава значими метаболитни пътища. Както променените характерни метаболити, така и значително променените метаболитни пътища предоставят нови прозрения за молекулярните механизми, лежащи в основата на ефектите от добавките на AKG върху C2C12 миобластите.