Проучване на ефектите на калцитриол против стареене върху човешки естествени клетки убийци in vitro

РЕЗЮМЕ

Широко се смята, че витамин D има регулаторен ефект върху имунната система. Някои клинични изследвания показват, че търсенето навитамин D се увеличава с възрастта. Калцитриолът е биологично активната форма навитамин D. Ефектът му върху човешките естествени клетки убийци (NK) остава неясен. Следователно, в това проучване, ние изследвахме анти-стареенето и имуномодулиращите ефекти на калцитриол върху NK клетките, използвайки серия от имунологични методи, за да изследваме важната му роля във вродения имунитет. Ние открихме, че калцитриолът обръща експресията на свързаните със стареенето биомаркери в NK клетките и инхибира тяхната експанзия чрез поддържане на тези клетки във фаза G1, без никаква апоптоза и изтощение. Калцитриолът потиска освобождаването на цитокини, свързани с възпалението, като интерлевкин-5 (IL-5), интерлевкин-13 (IL-13), интерферон-гама (IFN-), и тумор некрозисфактор-алфа (TNF-). Дегранулацията на NK клетки се регулира надолу от калцитриол, когато тези клетки се култивират съвместно с туморни клетки K562. Установихме също, че калцитриолът регулира нагоре свързания със стареенето сиртуин 1- протеин/киназа R-подобен ендоплазмен ретикулум киназен път (SIRT1/pERK) и експресията на SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) чрез активиране на рецептора на витамин D (VDR). Освен това калцитриолът може да бъде потенциален отрицателен регулатор на NK клеткитеапоптозаимитохондриална инактивациякоето е причинено отоксидативен стрес. По този начин калцитриолът показваефекти против старееневърху човешки NK клетки in vitro чрез активиране на оста SIRT1-PERK иустойчивост на окислително стареене.

Щракнете тук, за да получите Cistanche добавки против стареене

1. Въведение

Много проучвания са установили, че стареенето оказва пряко влияние върху няколко заболявания, като инфекциозни заболявания, сърдечно-съдови заболявания, невродегенеративни заболявания, автоимунни заболявания и рак. Стареенето на организма се съпровожда от имунозагуба. Общите характеристики на стареенето включват главно стареене с възпаление с хронично слабо възпаление [1], нестабилност на генома, дисбаланс на протеиновата експресия, митохондриална инактивация, клетъчно стареене и промени в междуклетъчната комуникация [2]. Като основен компонент на вродения имунитет, NK клетките играят важна роля в антиинфекциозните и антитуморните ефекти, както и в регулирането на имунната система [3]. NK клетките могат да елиминират прицелните клетки директно или чрез антитяло-зависима клетъчна цитотоксичност (ADCC), вместо да показват каквито и да било антиген- или антитяло-специфични отговори [4]. NK клетките също се свързват с реакции на свръхчувствителност и автоимунни заболявания [5]. Когато имунната система остарява, експресията на рецептори за повърхностно активиране, като член D от естествена група убийци 2 (NKG2D) [6], имуноглобулин-подобен рецептор на убиец (KIR), повърхностен маркерен клъстер на диференциация 57 (CD57) [7] , клъстер на диференциация 16 (CD16) [8] се увеличава. Тази молекула може да активира функцията за убиване на NK клетките, което може да доведе до клетъчен дисбаланс и възпаление при възрастните хора. Междувременно, инхибиторните молекули на NK клетки, като член на естествена група убийци 2 A (NKG2A), член на естествена група убийци 2 C (NKG2C) и естествени цитотоксични рецептори (NCR) [6] намаляват. Други свързани със стареенето маркери на NK клетките са Т-клетъчен имуноглобулин и протеин 3, съдържащ домейн на муцин (TIM3) и повишена програмирана клетъчна смърт-1 (PD-1). Повишаването на PD-1 и TIM3 по време на имуносесенценция може да инхибира функциите на NK клетките и да доведе до изчерпване на NK клетки [9].

Друг фактор, водещ до имуносесенция, е имунното възпаление [10]. Съобщава се, че високите нива на възпалителни цитокини, освободени от NK клетки, причиняват увреждане на ДНК, оксидативен стрес и клетъчно стареене. Освен това, клетъчният дисбаланс на NK клетките и статусът на възпаление може да доведе до автоимунно заболяване [11]. Нивата на интерлевкин-1 (IL-1), интерлевкин-4 (IL-4), интерлевкин-6 (IL-6), интерлевкин -10 (IL-10) и тумор некротизиращ фактор-алфа (TNF-) са по-високи при възрастните хора [12]. Въпреки че общият брой на имунните клетки намалява със стареенето, NK клетъчната популация значително се увеличава, което може да се дължи на инфилтрацията на възпалителни клетки [13].

Витамин D съществува в две активни форми в човешкото тяло като витамин D2 (ергокалциферол) и витамин D3 (калцитриол). Основната функция на витамин D е да насърчава усвояването на калция и фосфора. Витамин D също регулира имунните функции [14]. Въпреки че много доклади се фокусират върху неговите противоинфекциозни и противотуморни функции [15], калцитриолът проявява и противовъзпалителни ефекти [16]. Рецепторът на витамин D (VDR) се експресира върху различни имунни клетки [17]. Намаляването на производството на възпалителни цитокини допринася за намаляване на възпалителните реакции. Известно е, че калцитриолът потиска производството на TNF-, интерлевкин-1 (IL-1), интерлевкин-2 (IL-2), интерферон-гама (IFN-) и други възпалителни цитокини в В и Т клетки. Той може също така да освобождава противовъзпалителни цитокини като IL-4 и IL-10 [18] и да регулира аутофагията срещу възпалителна клетъчна инфилтрация [19].

Антиоксидантните свойства на калцитриола са докладвани при депресия, мастно чернодробно заболяване [20], сърдечно-съдови заболявания и други заболявания, свързани с възпаление. Свободните радикали и реактивните кислородни видове (ROS) също се натрупват в клетките и тъканите по време на стареенето. Публикуваните данни показват, че оксидативният стрес засяга различни сигнални пътища в клетките [21], включително SIRT1, митоген-активирана протеин киназа (MAPK) и пътища на ядрен фактор-κB (NF-κB). Генът SIRT1 се счита за ген за дълголетие и потискането на този ген води до нарушения, свързани с експресията на протеини, клетъчния цикъл и метаболизма [22]. SIRT1-ΔExon8 е нова изоформа на SIRT1, която съществува при бозайници чрез алтернативно снаждане. SIRT1-ΔExon8 също се счита за корегулаторен фактор на SIRT1 с пълна дължина [23].

Досега много малко проучвания се фокусират върху ефектите от стареенето и окислителното стареене върху NK клетките. Ефектите на калцитриол върху SIRT1-ΔExon8 също не са докладвани. Ето защо, това проучване имаше за цел да изследва ефектите на калцитриол върху стареенето и окислителното стареене на NK клетките, тъй като тези клетки заемат централна позиция в човешката вродена имунна система.

2. Материали и методи

2.1 Клетъчна култура и реактиви

Три човешки периферни кръвни проби са получени от донори, които не са имали активно автоимунно заболяване, остро или хронично възпалително заболяване, рак или други имуно-свързани заболявания. Възрастта на донорите е от 48 до 65 години. Мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs) бяха изолирани с помощта на Lymphoprep Ficoll. NK клетките се разширяват и поддържат с помощта на комплект за клетъчна култура на NK (MoreCell, Шенжен, Китай) при 37 градуса /5 процента CO2.

2.2 Поточен цитометричен анализ

След третиране с калцитриол в продължение на 72 часа, NK клетките се оцветяват с античовешки FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 и PE-KIR (BioLegend, Калифорния, САЩ). Всички FACS анализи бяха извършени с помощта на DxFLEX Flow Cytometer (Beckman, Калифорния, САЩ).

2.3 Измерване на клетъчната експанзия, освобождаване на цитокини и анализ на клетъчния цикъл

Клетъчната експанзия се определя с помощта на комплект за броене на клетки-8 [24] (CCK8; Beyotime, Шанхай, Китай). NK клетките бяха третирани с калцитриол в продължение на 48 часа и супернатантата беше събрана за цитокин-освобождаващ анализ. Нивата на цитокини бяха изследвани с помощта на LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, Калифорния, САЩ). Първо, гранулите за улавяне на цитокини се инкубират със стандартите или пробите и след това допълнително се инкубират с биотинилирани антитела за откриване. Впоследствие беше добавен биотинилираният разтвор за свързване на антитела за откриване, стрептавидин (SA)-PE, за осигуряване на флуоресцентен сигнал [25]. След това тези сигнали бяха анализирани с помощта на FACS анализ.

Клетъчният цикъл се измерва с помощта на комплект за откриване на клетъчен цикъл (Beyotime, Шанхай, Китай). NK клетките се третират с калцитриол в продължение на 72 часа. Тези клетки бяха фиксирани в 70 процента леденостуден етанол и след това боядисани с рибонуклеаза А (RNase A) и пропидиев йодид (PI) (Beyotime, Шанхай, Китай) [26].

2.4 Тест за убиване на NK клетки

Човешките еритролевкемични клетки, К562 клетки (ATCC, Вирджиния, САЩ), се инкубират с 10 uM 3,3 -диоктадецил-оксакарбоцианин (DIOBeyotime, Шанхай, Китай) за 15 минути и след това се добавят към третирани с калцитриол NK клетки при различни съотношения (E/T'=1:1, 5:1 и 10:1) за 4 часа, съответно (27).

2.5 Индуциране на окислително стареене и анализ на оцветяване с X-gal

Моделът на стареене на in vitro NK клетки с помощта на водороден пероксид (H2O2). За да се определи антиокислителният ефект на калцитриол, NK клетките първо се третират с калцитриол и след това се излагат на 100 μM H2O2 за 24 часа. Активността на -галактозидазата се измерва с помощта на 5-бромо-4-хлоро-3-индолил- -D-галактопиранозид (X-gal) оцветяване. Третираните клетки се фиксират в 4 процента параформалдехид и се оцветяват с оцветяващ разтвор на галактозидаза (Beyotime, Шанхай, Китай) за една нощ при 37 градуса [28]. След това оцветените клетки се суспендират в PBS и изображенията на тези клетки се получават с помощта на Leica флуоресцентна инверсионна микроскопска система. Три микроскопични изображения бяха събрани на случаен принцип от различни позиции при 40 × увеличение за всяка група. Процентът на оцветените с X-gal клетки беше изчислен и използван за оценка на стареенето на клетките с помощта на софтуера ImageJ V.1.45S.

2.6 Оцветяване и анализ на потенциала на митохондриалната мембрана

Хлорометил-Х-Розамин (CMXRos) и Hoechst (Beyotime, Шанхай, Китай) се използват за оценка на потенциала на митохондриалната мембрана. Клетъчните ядра (сини) бяха локализирани чрез оцветяване на Hoechst, докато потенциалът на митохондриалната мембрана беше определен от митохондриалната специфичност, обозначаваща флуоресцентно багрило, CMXRos. Hoechst плюс CMXRos-клетките (маркирани с бели стрелки) показват ниска активност. Относителното ниво на флуоресценция се изчислява чрез разделяне на броя на Hoechst-позитивните клетки на CMXRos-позитивните клетки [29]. Клетките се инкубират с 200 nM CMXRos и Hoechst (30 минути, 37 градуса) и се откриват с помощта на обърнат микроскоп Leica при дължини на вълните на възбуждане от 579 nm и 350 nm. Процентът на клетките Hoechst плюс CMXRos плюс се изчислява, както е описано в раздел 2.5.

2.7 Уестърн блотинг

Клетките бяха лизирани с помощта на лизисен буфер за радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) (Beyotime, Шанхай, Китай) с фосфатазен инхибитор PhosSTOP (Roche, Базел, Швейцария) и 1 μM фенилметилсулфонил флуорид (PMSF) (Beyotime, Шанхай, Китай). Общият протеин се определя количествено с помощта на комплекта за анализ на протеин на Bradford (TAKARA, Токио, Япония). Протеиновите проби се разделят чрез електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и се прехвърлят в 0.22 μm мембрани от поливинилиден флуорид (PVDF) (Immobilon-P мембрана; Millipore, Масачузетс, САЩ). След блокиране, мембраните се изследват с първични антитела и се инкубират с вторичните антитела [30]. Мембраните бяха открити с помощта на системата Odyssey (LI-COR, Небраска, САЩ).

2.8 Статистически анализ

Данните бяха анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с помощта на GraphPad Prism и представени като средно ± стандартно отклонение (SD). 6846 W. LI ET AL. Разликите се считат за статистически значими при P < 0.05. Резултатите също бяха анализирани с помощта на софтуера GraphPad.

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950