Изследване на подобния на естроген механизъм на гликозидите на Cistanche с помощта на метаболомика

Въведение

Естрогените играят важна роля в много процеси на развитие, физиологични и свързани процеси, включително развитието на матката.1–3 Въпреки това, дългосрочната употреба на естроген може да има много странични ефекти, като например увеличаване на риска от рак на гърдата, рак на ендометриума и други гинекологични тумори.4,5 Ето защо изследователите са се ангажирали да търсят заместители на естрогена, които биха могли да избегнат тези странични ефекти, известни като селективни модулатори на естрогенните рецептори, от които фитоестрогените представляват важна категория.6 Фитоестрогенните съединения се срещат естествено в растения с естрогенна активност и могат да се свързват с естрогенните рецептори, за да проявят своята активност. Следователно фитоестрогените могат да стимулират растежа на матката чрез комбиниране с изобилните естрогенни рецептори в матката, което означава, че утеротрофичният анализ може да се използва за предварителен скрининг и оценка на фитоестрогените.

Цистанчеdeserticola (CD), известен като Rou Cong-Rong в Китай, се твърди, че е ефективен за репродукцията, развитието и плодовитостта и се използва като тоник повече от 1800 години.8,9 Наскоро фармакологични проучвания показаха, че това тоникът има широки лечебни функции, като напррегулиране на хормоните, апериентни, имуномодулиращи, антиоксидантни, антиапоптотични, невропротективни, антиноцицептивни, противовъзпалителни, против умора и естрогенни дейности.10 Гликозидите на цистанхе (GCs), извлечени от CD, са сред основните активни компоненти и проявяват различни биологични активности.11 Въпреки че активните съставки на CD са били изяснени преди това,12 естрогеноподобният механизъм на GCs никога не е бил изследван.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРЕДОТВРАТЯВАНЕ НА ОСТЕОПОРОЗА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В това продължаващо проучване ние имахме за цел да потвърдим възможната употреба на GCs като фитоестрогени и да извършим метаболомичен анализ, за ​​да изследваме естрогенния подобен механизъм на GCs. Първо, утеротрофичен анализ и хистологичен анализ бяха използвани за потвърждаване на естрогенната активност на GCs. Най-важното е, че се съсредоточихме върху метаболитните промени в серума и урината на плъх, използвайки UPLC-MS/MS-базиран метаболомичен анализ. Поради недостатъците на нецелевата метаболомика, като повторяемост и сложно влияние на матрицата, беше използван псевдо метод, базиран на MRM режим, за специфично наблюдение на метаболитите и индексите (включително енергиен метаболизъм, оксидативен стрес, липиден метаболизъм и амино метаболизъм) свързани с естрогенни ефекти, растеж и развитие бяха избрани като биомаркери за откриване. Нашите резултати хвърлят светлина върху естрогенния подобен механизъм на GCs, който ще подпомогне развитието и използването на GCs.

Експериментален

Реактиви

L-левцин, L-кинуренин, L-триптофан, 5-HTP, холова киселина, Nфенилацетилглицин, 5-HT, глутатион (GSH) и 2,4-динитрофенилхидразин ($99.{{ 8}}%, HPLC) са закупени от Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, Китай). N-етилмалеимид ($98%, HPLC), L-глутатион окислен (GSSG, $98%, HPLC) и 1,1,3,3-тетраетоксипропан (TEP) са закупени от Sigma (Мадрид, Испания). L-фенилаланин (Ring-D5, 98%, DLM-1258-5) е закупен от изотопни лаборатории в Кеймбридж (МА, САЩ). Метанол и ацетонитрил от клас MS са закупени от ACS (Хюстън, САЩ). Диетилстилбестрол (чистота, $99.0%), мравчена киселина, ледена оцетна киселина и хематоксилин и еозин (H&E) бяха закупени от Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., Сейнт Луис, САЩ). Нарингенин (чистота, $98% (HPLC)) е закупен от Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Шанхай, Китай). GC бяха приготвени в нашата лаборатория и тяхната чистота беше определена като 60% чрез ултравиолетова спектрофотометрия, използвайки актеозид като маркер за определяне.

Подготовка на GC

Брай,цистанче на прах(100 g) се накисва в 75% етанол (1000 mL) за 1 час, след което се екстрахира повторно за 2,5 часа три пъти. Супернатантът се концентрира под вакуум, за да се получиекстракт от цистанче(23,3 g). Екстрактът се разрежда с вода до концентрация 0.5 g mL- 1 (разтворимостта се определя със сурово лекарство). След адсорбция с AB-8 макропореста смола в продължение на 8 часа, колоната се елуира последователно с вода и 85% етанол. Елуентът 85% етанол се концентрира до получаване на етанолов екстракт (8.4 g). Етанолов екстракт (0.02 g) се претегля точно и се разтваря в 50% метанол (10 mL). Аликвотна част от 1 mL от разтвора се разрежда до 100 mL с метанол в обемен съд. Накрая, разреденият разтвор се измерва при 330 nm чрез ултравиолетова спектрофотометрия. Ултравиолетовата абсорбция е 0,341, а линейната зависимост за актеозид от UV е y=24,905X + 0.0426 (R2=0,9982). Когато съдържа 5.04 g GCs, степента на пречистване е 60% (актеозидът се използва като маркер за определяне на GC). Оценката на пръстови отпечатъци на GCs е показана на ESI Фиг. S1.

Експерименти с животни и събиране на проби

Женски SD плъхове със сексуална незрялост (45–60 g) и полова зрялост (320–380 g) бяха предоставени от Центъра за животни на Медицинския университет в Харбин, лиценз за лабораторни животни, SCXK- (Армия): 2013-001. Животните бяха настанени при SPF лабораторни условия и им беше предоставена стандартна лабораторна диета с променена чешмяна вода ad libitum. Всички процедури върху животни са одобрени от Насоките за хуманно отношение към животните и грижа за тях на провинция Хейлундзян и са извършени съгласно указанията на Националния институт по здравеопазване относно принципите за грижа за животните (2004 г.). Всички плъхове, използвани в този експеримент, се аклиматизират към горната среда за една седмица.

Полово незрелите SD плъхове бяха разделени на случаен принцип в три групи от 10 плъхове: празна група, диетилстилбестролова група и GC група. Междувременно 10 SD плъха с полова зрялост бяха избрани като контролна група. Групата на диетилстилбестрол се прилага ig с диетилстилбестрол (0,35 mg kg- 1, 1 mL/100 g), групата на GC се прилага ig с разтвор на GC (30 g kg- 1, 1 mL/100 g ), а празната група и контролната група получават дестилирана вода със същия обем два пъти на ден (сутрин и вечер) в продължение на 3 дни. На третия ден плъховете се настаняват в метаболитни клетки след прилагането и непрекъснато се събират проби от урина в продължение на 24 часа. Плъховете се анестезират с помощта на пентобарбитал и се вземат кръвни проби от коремната аорта и се центрофугират при 3000 х g (15 минути, 4 °С), за да се получи серум. Всички проби бяха съхранени в - 20. В. Освен това, матката се отделя, претегля и изследва с помощта на 10% формалин.

Хистологичен анализ

Серийни тъкани с дебелина 5 mm бяха изрязани от матката. След това тъканните срезове се вграждат в парафин, оцветяват се с H&E, като се използват рутинни методи, и се наблюдават с оптичен микроскоп (BZ-9000; Keyence, Осака, Япония). Височината на епителните клетки на матката се измерва с микрометър под микроскоп.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА НАСЪРЧАВАНЕ НА РАСТЕЖА НА ГЪРДИТЕ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Метаболомика

Приготвяне на серум без активен въглен

Беше приготвен специален празен серум от серум на плъх, който беше лишен от ендогенни материали с помощта на прах от активен въглен. Активен въглен на прах (6 g) се добавя към плъши серум (100 mL), разклаща се в продължение на 2 часа при стайна температура и се центрофугира при 4 °С. C и 13 500 rpm за 20 минути. Супернатантът се променя с помощта на Millipore express PES мембрани (Merck Millipore, Ltd.), прикрепени към 20 mL спринцовка в следната последователност: 5 mm, 1.2 mm и 0.45 mm. С LC-MS/MS бе потвърдено, че "освободеният" серум не съдържа биомаркери.

Приготвяне на стандартни разтвори

L-триптофан (Try), L-кинуренин (Kyn), GSSG, N-фенилацетилглицин (N-Phe), 5- HTP, L-левцин (Leu), 5-HT и холова киселина ( CA) изходни разтвори (1 mg mL- 1 ) се приготвят с помощта на 100% метанол. GSH се приготвя при 0,5 mg mL- 1 в 10 mM NEM PBS буфер и се съхранява при - 40. C в кафяви бутилки. Калибраторите бяха генерирани с помощта на комбинирани L-триптофан, L-кинуренин, GSSG, N-фенилацетилглицин, 5-HTP, L-левцин, 5-HT, холова киселина и GSH-NEM, които бяха серийно разредени с дестилирана вода. IS основният разтвор на L-фенилаланин-d5 (d5-Phe) се приготвя в 100% метанол и се приготвя работният разтвор на d5-Phe (10 ng mL- 1). в 100% метанол и се съхранява при - 40. ° С.

По време на анализа беше необходима стъпка на дериватизация, за да се избегне разграждането на GSH, което подобри стабилността за откриване и количествено определяне на GSH. GSH беше определен след реакция с NEM.15,16 Според предишния доклад, 50 mM NEM беше избран за GSH.

приготвяне на пробата

За серумни проби, 10 mM NEM (200 mL) се добавя към пробата (200 mL), последвано от метанол (1000 mL, съдържащ IS Phe-d5 при 10 ng mL- 1) и се инкубира за 20 минути при { {9}}. С. След центрофугиране при 4.С и 12 000 rpm за 10 минути, супернатантите (1000 mL) се прехвърлят в 2 mL центритубки и се изпаряват до сухо. Изсушеният остатък се възстановява в дестилирана вода (100 mL) след центрофугиране в продължение на 15 минути при 4 °С. C и 13 500 rpm, и аликвотна част от 10 mL от супернатантата се инжектира за анализ.

За проби от урина, 100 mL проба се поставят в епруветка от 2 mL и към всяка проба от урина се добавя 1 обем PBS (m/v), съдържащ 50 mM NEM. След това се добавя метанол (1000 mL, съдържащ IS при 10 ng mL- 1) и пробата се инкубира при - 20. С за 20 минути и след това се центрофугира при 12 000 rpm за 10 минути при 4°. C. Супернатантата (1000 mL) се изпарява до сухо под слаб поток от азот при стайна температура и след това остатъкът се разтваря в 60 mL подвижна фаза и се разбърква на вортекс за 1 min преди центрофугиране при 13 500 rpm и 4 . C за 15 минути. 10 mL аликвотна супернатанта се инжектира за анализ.

Валидиране на методологията

Валидирането на анализа беше извършено съгласно „Ръководство за промишлеността: Валидиране на биоаналитичен метод“ (Администрация по храните и лекарствата, септември 2013 г.). Калибраторите бяха генерирани с помощта на сурогатна матрица за Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe и CA от стандартни работни разтвори в "отстранения" серум. Всеки калибратор на концентрация беше дублиран. Стандартната крива се изчислява чрез 1/X претеглена линейна регресия на най-малките квадрати на концентрациите на калибратора на стандартната крива и съотношенията на площта на пика за аналита към IS.

Тест за прецизност и точност

Прецизностите на анализа на обединени QC проби и нетретирани QC проби от серум/урина на плъхове бяха оценени с помощта на един в рамките на деня и три междудневни аналитични серии. Пробите за QC с три различни концентрации бяха генерирани чрез добавяне на L-триптофан, L-кинуренин, GSSG, N-фенилацетилглицин, 5-HTP, L-левцин, 5-HT, холова киселина и GSH-NEM стандартни разтвори към "отстранен" серум/PBS, които след това се обработват по същия начин като in vivo пробите. Стандартни изходни разтвори на Try, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu и CA (1 mg mL- 1) бяха приготвени в 10 0% метанол, с изключение на този на GSH, който се приготвя при 0,5 mg mL- 1 в 10 mM NEM PBS буфер. Стандартните криви при осем различни концентрации бяха генерирани по същия начин като QC пробите и анализирани чрез 1/X претеглена линейна регресия на най-малките квадрати. За изследването за валидиране на метода, друг QC метод беше извършен едновременно с използване на обединени серум/урина (50 mL) от всяка проба от контролните или моделни групи, за да се получи QC образец и след това обработен като in vivo проби. Серия от QC проби и стандартни криви бяха пуснати за всеки 50 животински проби.

Матрични ефекти

Вариациите на матрицата, дефинирани като вариациите в точността на анализа за различни партиди матрица, бяха оценени с помощта на шест различни графика на добавен серум/урина на плъх за анализ и оценка на добавеното възстановяване.17 Оценката на целия ефект на матрицата за анализ на ендогенно съединение е предизвикателство . Един от начините да се провери дали даден анализ има някакъв (цялостен) матричен ефект е да се оцени пиковото възстановяване. Тестът за добавено възстановяване включва добавка на аналита в проби преди екстракцията, което е различно от теста с матрични фактори (MF), който включва добавка на аналита в проби след екстракция.18 MF се изчислява като площта на пика на аналита в наличието на биологична матрица в сравнение с липсата на биологична матрица. Използван е IS-нормализиран MF: MF ¼ съотношение площ на пик/IS в присъствието на матрица спрямо съотношение площ на пик/IS в отсъствие на матрица.

UPLC-MS/MS анализ

MS оборудване, оборудвано с Waters X BridgeTM BEH C18 аналитична колона XP (2,5 mm, 3.0 × 100 mm; Waters, Torrance, CA) беше използвано за LC-MS /MS анализ. Подвижната фаза с Q линеен градиент, съставена от 0.1% вода с мравчена киселина (разтворител А) и метанол (разтворител В), се използва съгласно следната градиентна програма: 0–3.0 min (0–1% B); 3.0–10.0 мин (1–3% B); 10.0–14.0 мин (3–50% B); 14.0–18,0 минути (50–95% B); 18,0–22,0 минути (95–0% B), времето за спиране е 25 минути. Обемът на инжектиране беше 10 mL и скоростта беше 0,6 mL min- 1. Крайният метод използва следните параметри: тип сканиране, MRM; йонен режим, електроспрей йонизация (ESI) в режим на положителни и отрицателни йони; напрежение на йонно пръскане, ± 4500 V; газова завеса, 20; температура 450°С; газ източник на йони 1, 40; йонен източник на газ 2, 40. Всички данни от UPLC-MS са получени с помощта на софтуера AB Analyst (версия 1.6.2) и m/z 171.1–125.2 за вътрешен стандарт d5-Phe (DP, 63 V; CE , 8 V; CXP, 21 V; EP, 24 V) и подробни условия на MS са показани в таблица S1.

Статистически анализ

Всички стойности бяха изразени като средно ± SD. Значимостта на разликите между групите беше сравнена чрез еднопосочен ANOVA тест, последван от теста на Dunnett, използвайки програмата Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Чикаго, Илинойс, САЩ). Прагът на значимост беше определен на p <0.05 в този тест.

Резултати и дискусия

Ефект на GC върху матката

Теглото на матката и хистологичният анализ бяха използвани за оценка на ефекта на GC върху матката. Теглото на матката е значително увеличено в диетилстилбестрол, GC и контролните групи в сравнение с празната група (P < {{0}}.01). В празната група ендометриалният епител е нисък колонен с малки жлези, жлезист епител с кубична форма и без интерстициални възпалителни клетки. В групата на диетилстилбестрол, жлезистият епител и ендометриумът са високо колоновидни и показват хиперплазия, с много интерстициални възпалителни клетки. В групата с GC, жлезистият епител и ендометриумът са силно колоновидно назъбени и показват хиперплазия с много интерстициални възпалителни клетки и удебеляване на интимата. В контролната група ендометриумът беше високо колонен, а жлезистият епител беше ниско колонен, с малко интерстициални възпалителни клетки. В сравнение с празната група, височината на епителните клетки на матката е значително увеличена в другите групи (P <0,01) (Фиг. 1).

Валидиране на метода на открит биомаркер чрез UPLC-MS/MS

Линейност и диапазон на калибриране

За всяко измерване беше построена линейна калибровъчна крива с тегловен коефициент 1/X в изследваната матрица. Калибрационните криви за анализи в серума бяха анализирани в различни дни. Диапазоните на калибриране за анализите бяха разпределени по седем точки на калибриране, както е показано в таблица 1.

Точност и прецизност. Доказано е, че методът е подходящ по отношение на точност и прецизност, както в рамките на деня, така и в рамките на деня, за всички изследвани проби. Стойностите на тези параметри бяха по-малко от 5% при зададените концентрации за GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, холова киселина, 5-HT и N-фенилацетилглицин, с три повторения от всяка анализирана концентрация. Данните, съответстващи на междудневните и вътрешнодневните стойности на точност и прецизност, са показани в таблица S2 на ESI.

Матрични ефекти

Както е показано в таблица S3 на ESI,† пиковите възстановявания са 92,5–118,1% при добавяне на 1000 ng mL- 1 GSH, 2000 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu , 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL- 1 5-HTP, 400 ng mL- 1 холева киселина , 8 ng mL- 1 5-HT и 2500 ng mL- 1 N-фенилацетилглицин в три различни участъка от серум на плъх и при добавяне на 100 ng mL- 1 от GSH, 200 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu, 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL{ {37}} 5-HTP, 400 ng mL- 1 холова киселина, 8 ng mL- 1 5-HT, 2500 ng mL- 1 N -фенилацетилглицин в три различни графики на урина на плъх с различни базови нива. CV на измерените концентрации на Trp и Kyn от тези партиди бяха #10% (n=5). Тези резултати показват, че различните матрици не са повлияли значително на анализа.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРЕДОТВРАТЯВАНЕ НА РАК НА МАТКАТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Анализ на метаболитно профилиране чрез псевдоцелеви метод

Псевдоцелевият метод беше използван за изследване на серумния и уринния метаболит MRM proling на четири групи (празна, диетилстилбестрол, контрола и GC).

Първо, PCA моделът е създаден, за да покаже метаболитното разграничение на четирите групи. От мултивариантния анализ имаше очевидни метаболитни разлики между GC групите (включително диетилстилбестрол и контролните групи) и празната група. Пробите за QC се групират плътно в диаграмата на резултата на PCA, което показва, че стабилността на системата е подходяща за това метаболомично изследване (фиг. 2).

След това критичната P-стойност беше зададена на 0.05 за значително различни метаболити в това изследване. Съответно, както е показано в таблица 2, диференциалните метаболити в сравнение с празната група са условно идентифицирани, както следва: 17 в серумни проби и

12 в проби от урина за GC групата, 15 в проби от серум и 9 в проби от урина за групата с диетилстилбестрол, 12 в проби от серум и 11 в проби от урина за контролната група и 11 в проби от серум и 7 в проби от урина, които са били едновременно присъства в GC, диетилстилбестрол и контролни групи. За по-нататъшно разбиране на метаболитните разлики между различните групи, беше генерирана клъстерна топлинна карта за всички диференциални метаболити, демонстрирайки относителното увеличение (червено) или намаление (зелено) (фиг. 3).

Осемнадесет различни метаболита, присъстващи едновременно в GC, диетилстилбестрол и контролните групи, са описани като

следва: глюкоза, лимонена киселина, пролин, бетаин, орнитин, N-фенилацетилглицин, фенил пирогроздена киселина, инозин, C16:0LPC, креатинин и ксантозин в серума и бензен ацетил глицин, пироглутаминова киселина, ацетилкарнитин и Наблюдава се, че N6-ацетил лизинът в урината е значително намален (P < 0.05); докато тауринът, орнитинът, a-кетоглутаровата киселина и спермидинът в урината са значително повишени (P < 0.05). Освен това тауринът (серум) е значително повишен, докато а-кетоглутаровата киселина (серум), C18:0LPC (серум) и бетаин (урина) са значително намалени в диетилстилбестрол и GC групите (P < {{ 19}}.05); L-кинуренин (серум) се регулира нагоре в групата на диетилстилбестрол, но се регулира надолу в групата на GC (P <0,05); пироглутаминовата киселина (серум) и пролинът (урина) бяха понижени, а лимонената киселина (урина) и никотинамидът (урина) бяха значително повишени в контролната и GC групата (P <0,05); и фенилаланинът се регулира надолу в групата на GC (P <0.05).

В това проучване са изследвани ефектите на GCs върху матката на незрели плъхове. Матката е най-чувствителният орган за изследване на ER-зависимите ефекти на химикалите.Herba Cistanchesсе съобщава, че индуцира увеличаване на теглото на матката чрез засилване на освобождаващата лутропин функция на хипоталамо-хипофизния яйчник,20 което също се наблюдава за GCs в това проучване. Това показва, че GC имат естрогенна активност. Напоследък докладите се фокусират главно върху преобладаващия механизъм, чрез който естрогенните ефекти се изразяват чрез свързване с ERs, 21–23, но метаболитният механизъм не е проучен в дълбочина. В това проучване е използван псевдометаболомичен метод за изследване на естрогенния подобен механизъм на GCs.

Метаболитните междинни продукти на последователна поредица от реакции се променят по по-изразен начин от ензимната кинетика или индивидуализация.24 Седемнадесет метаболита в серума, включително глюкоза, лимонена киселина, таурин, пролин, бетаин, орнитин, пироглутаминова киселина, a-кетоглутарова киселина, N- фенилацетилглицин, фенилпируватна киселина, инозин, C18:0LPC, C16:0LPC,

креатинин, фенилаланин, L-кинуренин и ксантозин и 12 метаболита в урината, включително бензен ацетил глицин, бетаин, таурин, лимонена киселина, орнитин, пироглутаминова киселина, ацетилкарнитин, N6-ацетил лизин, никотинамид, а-кетоглутарова киселина, спермидин и пролин, е установено, че участват в естрогенния подобен механизъм на GCs. Няколко променени метаболита са от особен интерес, тъй като присъстват както в серума, така и в урината. Например, лимонената киселина, образувана от кондензацията на ацетил коензим А и оксалооцетната киселина и играеща важна роля в цикъла на лимонената киселина, свързан с енергийния метаболизъм,25 беше регулирана надолу в серума на групата GC, но регулирана нагоре в урината . Освен това, а-кетоглутаровата киселина с глутаминова въглеродна рамка, която може да поддържа общия азотен баланс и да насърчава протеиновия синтез и е централният материал на цикъла на лимонената киселина, беше регулирана надолу в серума на групата GC, но регулирана нагоре в урината.26 Цикълът на лимонената киселина е не само крайният метаболитен път на три основни хранителни вещества (въглехидрати, липиди и аминокиселини), но и връзката между метаболизма на захарите, липидите и аминокиселините и основният начин за получаване на енергия за тялото. 27, 28 Това показа, че подобният на естроген механизъм на GC е свързан с енергийния метаболизъм, който е същият като диетилстилбестрола. Следователно, има ясна връзка между цикъла на лимонената киселина и увеличаването на теглото на матката при незрели плъхове, третирани с GC. Като важен донор на метил, бетаинът играе важна роля в растежа и развитието на плода, което показва, че бетаинът участва в увеличаването на теглото на матката.29 Интересното е, че тауринът е повишен както в серума, така и в урината, което може да насърчи храносмилането и усвояването на липидите и клетъчното усвояване и използване на глюкоза чрез насърчаване на глюкозния метаболизъм. Съобщава се също, че дефицитът на таурин води до загуба на тегло при млади животни, което предполага, че тауринът играе важна роля в растежа и развитието.30 Освен това, регулиращият ефект на бетаин и таурин от GC следва същата тенденция при използване на диетилстилбестрол, но с подобрено ефект в сравнение с диетилстилбестрол.

Освен това много аминокиселини са значително променени. Нашите резултати предполагат, че GC причиняват метаболитни аномалии в аминокиселините. Метаболизмът на аминокиселините може да се използва за синтеза на специфични протеини, пептиди и други азотни съединения или декарбоксилиране чрез деаминиране, трансаминиране, комбинирано с разлагане на амоняк, или за освобождаване на енергия чрез цикъла на лимонената киселина.31,32 Следователно, промените в тези съединения могат да участват във важните сигнални събития, които задействат увеличаването на теглото на матката.

Освен това, за подробен анализ на пътя, диференциалните метаболити бяха категоризирани в няколко основни пътя, включително цитратния цикъл (TCA цикъл), метаболизма на глутатиона,

метаболизъм на аргинин и пролин, метаболизъм на D-глутамин и D-глутамат, биосинтеза на фенилаланин, тирозин и триптофан, метаболизъм на фенилаланин и други пътища с помощта на Pathway Analysis на софтуер MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca), както е показано на фиг. 4. Пътят, свързан с енергийния метаболизъм, включително TCA цикъла и метаболизма на глутатиона (както в серума, така и в урината), е една от основните цели на естрогенните ефекти. Критичната роля на естрогенните химикали в енергийния метаболизъм е потвърдена от ERs, регулиращи гените, необходими за митохондриалната функция, TCA цикъла и други, според предишни проучвания.33,34 Може да се заключи, че естрогеноподобният механизъм на GCs е подобен към този на диетилстилбестрола, като и двата са свързани до известна степен с цикъла на ТСА и метаболизма на глутатиона, но с GCs, работещи по-добре от диетилстилбестрола.

Въпреки че възможните механизми не могат да бъдат изяснени в това проучване, бяха избрани някои метаболити, които биха могли да бъдат използвани за изследване на други естрогенни механизми на GCs в матката в бъдеще. Следователно, за по-добро изследване на механизма, други технологии, като протеомика, ще бъдат приложени в бъдещи изследвания.

Изводи

За да обобщим, метод за серум и урина псевдонасочен метаболомичен метод, базиран на UPLC-QTRAP MS, беше създаден за изследване на подобни на естроген механизми на GCs, което осигури стабилни и надеждни резултати. Използвайки установения псевдоцелеви подход, беше разкрит холистичен поглед върху промените в метаболомиката на серума и урината на естрогеноподобния механизъм (GCs).

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%