Общите гликозиди на Cistanche Deserticola насърчават възстановяването на неврологичните функции чрез индуциране на невроваскуларна регенерация чрез Nrf- 2/Keap-1 пътя при MCAO/R плъхове-Ⅱ

TGs насърчават невронно ремоделиране при I/R наранени плъхове

Според множество проучвания неврогенезата след инсулт може значително да подобри функционалното възстановяване. Синаптофизин (SYN), протеини с постсинаптична плътност 95 (PSD-95) и протеин 2, свързан с микротубули (MAP-2) бяха използвани като маркери за изследване на невронната пластичност в исхемичната пенумбра на кората. За да се оценят ефектите от лечението с TGs, PSs и OSs върху неврогенезата при I/R увредени плъхове, бяха извършени имунофлуоресценцията и Western blot за експресии на SYN, PSD95 и MAP-2. Както е показано на фигури 9 и 10, нивата на експресия на SYN, PSD95 и MAP-2 при I/R плъхове след 14 дни реперфузия намаляват в сравнение с NOR плъхове, докато лечението с TGs и PSs може значително да се повиши. регулират нивата на изразяване. Групата на операционните системи няма значителна промяна в сравнение с групата на MOD. Данните показват, че TGs и PSs лекуват драстичнонасърчаване на невронно ремоделиране след I/R нараняване. 

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЗАЩИТА СРЕЩУ ИШЕМИЧЕН ИНСУЛТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TGs променят Nrf-2 и запазват-1 изразите при I/R наранени плъхове

Оксидативният стрес е основният патогенен механизъм при I/R нараняване. Проучванията потвърдиха, че Nrf-2 е главен регулатор на антиоксидантните реакции. За да изследваме Nrf-2 и Keap-1 медиирани оксидативни отговори след I/R нараняване, ние оценихме цитоплазмената

израз, както и ядрена транслокация на Keap-1. Междувременно, експресията на Nrf-2 в I/R увредени мозъчни тъкани на плъхове също беше анализирана (Фигури 10 и 11). Според имунофлуоресцентния анализ беше установено, че Nrf-2 се намира главно в цитоплазмата в NOR групата. В групата на TGs експресията на Nrf-2 в цитоплазмената локализация беше регулирана надолу, но регулирана нагоре в ядрото и също беше наблюдавана намалена експресия на Keap-1. Данните показват, че мозъчната защита на TGs може да бъде свързана с модулацията на Nrf-2 и Keap-1.

TG намаляват оксидативния стрес на мозъчната тъкан при I/R наранени плъхове

За да се потвърдят антиоксидантните ефекти на TGs, активността на SOD, CAT, GSH-Px и MDA беше оценена при I/R увредени плъхове. На Фигура 12 съдържанието на MDA е значително повишено в MOD групата и в същото време активностите на SOD, CAT и GSH-Px са намалени в сравнение с нормалните плъхове. Обратно, лечението с TGs доведе до значително намаляване на съдържанието на MDA и повишаване на активността на SOD, CAT и GSH-Px. Тези резултати допълнително потвърждават антиоксидантната активност на TGs.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ИШЕМИЧЕН ИНСУЛТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ДИСКУСИЯ

Много проучвания предполагат, че TCM C. deserticola има обширни биологични дейности, например повишаване на способността за учене, паметта и имунитета. Въпреки това, активните компоненти на C. deserticola за невропротекция остават неясни. Настоящата работа има за цел да скринира активните компоненти отC. deserticola срещу исхемичен инсултна модела MCAO/R. Три екстракта от C. deserticola (TGs, PSs и OSs) бяха използвани за оценка на техните ефекти върху MCAO/R плъхове, както и възможните механизми.

Инсултът е често срещано остро мозъчно-съдово заболяване. Епидемиологичните проучвания показват, че инсултът е по-чест при мъжете, отколкото при жените. Така в нашия експеримент мъжки плъхове бяха приети за тестовете. Нашите резултати доказаха, че I/R индукцията ускорява оксидативния стрес и обема на инфаркта, нарушавайки ВВВ и водещо до нервно и мозъчно-съдово увреждане. След скрининга беше установено, че TG намаляват обема на инфаркта и насърчават невралното ремоделиране и ангиогенезата. Освен това се наблюдава, че TG поддържат целостта на BBB след I/R нараняване. Напротив, PS и OS не водят до значително облекчаване на I/R нараняване. По този начин, TGs се считат за основната активна фракция на C. deserticola за невропротекция, потенциално чрез насърчаване на невронно ремоделиране, ангиогенеза и интегритет на BBB чрез активиране на пътя Nrf- 2/Keap-1.

Натрупващите се доказателства показват, че установяването на ефективна колатерална циркулация е значително важно за избягване на образуването на инфаркт и исхемична полусянка и е критично лечение в ранен стадий на исхемичен инсулт. Пролиферацията на съдови ендотелни клетки и гладкомускулни клетки след исхемичен инфаркт определя установяването на колатерална циркулация. Въпреки това, моделите на исхемия имат общ феномен - това е, че оксидативният стрес съществува широко в мозъчната микроваскулатура. Данните от проучване показват, че голям брой антиоксиданти могат да нарушат функцията на BBB и свойствата на ангиогенезата. CD31 и a-SMA са маркерите на съдовите ендотелни клетки, както и съответно на гладкомускулните клетки. За да изследваме ефекта от гореспоменатата клетъчна пролиферация на екстрактите от C. deserticola, ние изследвахме експресиите на CD31 и a-SMA в хомогената на церебралната исхемична пенумбра. Нашите данни показват, че TGs поразително подобряват експресията на CD31 и a-SMA. Въпреки това, няма значителни разлики между групите PS и OS. Следователно, ние заключихме, че TGs могат да намалят увреждането на мозъка чрез насърчаване на ангиогенезата чрез увеличаване на експресиите на CD31 и a-SMA, докато PSs и OSs не предоставят такава защита от увреждане на мозъка. Тези резултати допълнително потвърждават, че само TG могат да предотвратят мозъчно I/R увреждане.

Исхемичният инсулт може да се разглежда като резултат от церебрална исхемия, причинена от увреждане на пластичността на невроните или ремоделиране на мозъчни области. По-голямата част от пациентите с инсулт страдат от неврологичен дефицит. Активирането на неврогенезата е обещаваща стратегия за пациенти с инсулт за подобряване на техните неврологични функции. Неврогенезата участва директно във възстановяването на неврологичните функции след I/R увреждане на мозъка. Предишни изследвания показват, че TGs могат да подобрят степента на оцеляване на хипокампалните пирамидални клетки и да индуцират неврогенеза. Оксидативният стрес причинява загуба на неврони по време на много заболявания, като болестта на Паркинсон, инсулт и т.н. Nrf-2 транскрибира много гени, свързани с неврозащита в техния промоторен регион, главно включително SOD, MDA, CAT и g-глутамил цистеин лигази и др. SYN, PSD-95 и MAP{{ 4}} протеини, които са тясно свързани със синаптичното образуване и невротрансмисия, могат да се считат за маркери за изследователска невронна пластичност в областта на исхемичната полусянка. След проучване открихме, че лечението с TGs може значително да повиши експресията на PSD95, SYN и MAP-2, което показва, че церебралната защита на TGs е свързана с повишена пластичност на невроните по време на I/R. Жалко е обаче, че няма очевидна разлика между PS, както и групите OS. Тези резултати показват, че TG могат да подобрят невропластичността след церебрално I/R увреждане.

Образните изследвания при пациенти с инсулт показаха, че дисфункцията на BBB може да се разглежда като поразителен атрибут на периисхемичния мозък (Bang et al., 2007). TJs, които са съставени от цитоплазмени протеини, трансмембранни протеини и свързващи адхезионни молекули между капилярни ендотелни клетки, са много важни за поддържане на целостта на BBB (Ye et al., 2019). Сред тях ZO-1, клаудин-5 и оклудин са най-важните протеини в TJs. Натрупващите се доказателства показват, че повишената пропускливост на ВВВ, предизвикана от исхемия, обикновено корелира с промените на ZO-1, клаудин-5 и оклудин (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu и др., 2017 г.; Liu и др., 2018 г.). В тази работа резултатите показват, че въпреки че TGs могат значително да увеличат експресията на ZO-1, claudin-5 и оклудин протеини в MCAO-индуцирани мозъчни тъкани, нито PSs, нито OSs го правят. BBB се състои от церебрални ендотелни клетки и е тясно свързан с перицитите (Nyul-Toth et al., 2016). Перицитите са жизненоважни за целостта на BBB (Bell et al., 2010). Исхемичният инсулт задейства перицитна смърт и отделяне от мозъчни ендотелни клетки в острата фаза, като по този начин дестабилизира микроваскулатурата и променя свойствата на BBB (Zechariah et al., 2013). Нашите данни показват, че TG могат да увеличат покритието на перицитите върху капилярите и да увеличат нивата на експресия на ZO-1, клаудин-5 и оклудин. Тези явления доказаха, че TG могат ефективно да защитят целостта на BBB след церебрално I/R увреждане. В обобщение, TGs могат да намалят мозъчното увреждане по множество начини, като насърчаване на ангиогенезата, подобряване на пластичността на невроните и поддържане на целостта на BBB.

След това изследвахме сигналния път, за да изследваме механизма, който е в основата на мозъчната защита на TG. Процесът на I/R увреждане е многофакторен и по този начин в патогенезата участват многобройни механизми. Оксидативният стрес е основен рисков фактор, допринасящ за I/R-индуцирано мозъчно увреждане, като увреждане на BBB структурата, васкуларна ендотелна дисфункция и влошаване на исхемично невронно увреждане. По този начин оксидативният стрес се превърна в привлекателна терапевтична цел при I / R-индуцирано мозъчно увреждане. Ензимите от фаза 2, които се медиират от ядрен фактор E2-свързан фактор-2 (Nrf-2), се считат за важно средство, чрез което невроните се защитават срещу оксидативен стрес. Все повече доказателства показват, че активирането на Nrf-2 по време на I/R е потенциална терапевтична цел за невропротекция. Nrf-2, като важен регулатор на ендогенната антиоксидантна защита, медиира нивото на хемоксигеназа 1 (HO-1) и други антиоксидантни ензими, като NAD(P)H хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH и MDA. Освен това Nrf-2 играе важна регулаторна роля в ангиогенезата. Настоящото проучване показва, че Nrf-2 може да бъде значително подобрен и активиран в процеса на съдово развитие.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА АНТИИШЕМИЧЕН ИНСУЛТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Както беше описано по-горе, TGs съдържат много биоактивни съединения, например ехинакозид, тубулозид А, актеозид, изоактеозид и 2'-ацетилактеозид, и някои от тях показаха невропротективни функции след церебрално I/R увреждане. Ехинакозидът има много фармакологични ефекти, като антиоксидант, анти-стареене, невропротекция, противовъзпалителни, насърчаване на цикатризация, хепатопротекция, насърчаване на образуването на кости и антитуморни дейности. Наскоро ехинакозидът е идентифициран като мощен антиоксидант в централната нервна система. Ехинакозидът може да намали съдържанието на MDA и да подобри активността на SOD и GSH-Px при исхемично мозъчно увреждане, а молекулярният докинг анализ показа, че ехинакозидът може да се свърже с Keap-1, което води до Nrf-2 ядрена транслокация. Проучването на Xia показа, че актеозидът може да намали инфарктния обем и съдържанието на мозъчна вода, за да подобри неврологичните дефицити при MCAO/R плъхове чрез смекчаване на оксидативния стрес. Други проучвания показват, че изоактеозидът може да увеличи активността на клетъчните антиоксидантни ензими, SOD и CAT в H2O2-третирани V79-4 клетки. Въз основа на горните доклади за активните съединения, съдържащи се в TG, е възможно да се заключи, че TG могатпредпазват от исхемичен инсулт чрез антиоксидантните пътища.

Li докладва за невропротективните ефекти на фенилетаноидните гликозиди (PhGs) върху H2O2-индуцирана апоптоза на PC12 клетки чрез пътя Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Тези PhG бяха значително потиснати чрез задействане на Nrf2 ядрена транслокация и увеличаване на експресиите на HO-1, NQO1, глутамат цистеин лигаза-каталитична субединица (GCLC) и глутамат-цистеин лигаза модификатор субединица (GCLM) (Li et al., 2018 ; Гонг и др., 2019 г.). Следователно тези открития предполагат, че пътят на Nrf-2/ARE играе решаваща роля в медиираните от PhGs защитни ефекти върху невронните клетки. По същия начин, в това проучване открихме, че TG могат да намалят нивото на MDA и да повишат нивата на SOD, CAT и GSH-Px в I/R плъхове. Междувременно TG могат да регулират нагоре експресията на Nrf2 в ядрото, да регулират надолу съответната експресия в цитоплазмата и значително да намалят експресията на Keap-1. Следователно, пътят на Nrf-2/Keap-1 може да бъде включен в медиирани от TGs невропротективни ефекти. По-нататъшно валидиране на този път ще бъде извършено in vitro клетъчна култура с модели на увреждане на лишаване от кислород-глюкоза/реоксигенация в бъдеще. Освен това, екстракти от C. deserticola бяха прилагани в нашето проучване в продължение на 14 дни непрекъснато. Тъй като неврогенезата при възрастни би повлияла на интерпретацията на невропротективните ефекти по време на 14 дни реперфузия, неврогенезата не може да бъде изключена от настоящия ни експериментален дизайн при изследване на невропротективния ефект на CT. Това е ограничението на нашето изследване.

В заключение, триглицеридите от C. deserticola могатзасилват ангиогенезата и неврогенезатакакто и поддържа целостта на BBB при I/R наранени плъхове, но не и PSs и OSs. Ефектите могат да бъдат медиирани от активирането на пътя Nrf-2/Keap-1.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ИШЕМИЧЕН ИНСУЛТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%