Общите гликозиди на Cistanche Deserticola насърчават възстановяването на неврологичните функции чрез индуциране на невроваскуларна регенерация чрез Nrf- 2/Keap-1 пътя при MCAO/R плъхове-Ⅰ

ВЪВЕДЕНИЕ

Инсултите се считат за основна причина за смърт и инвалидност в света. Близо 87% от всички случаи на инсулт са предизвикани от исхемичен инсулт. В момента най-ефективният агент и единственото лекарство, одобрено от FDA, използвано залечение на исхемичен инсулте рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор. Голяма част от пациентите с инсулт обаче не реагират на това лекарство поради тесния му терапевтичен времеви прозорец и сериозния риск от хеморагични усложнения. Основно предизвикателство на тромболитичното лечение е исхемично/реперфузионно (I/R) увреждане, което се счита за основна причина за мозъчно увреждане и разрушаване на функцията. Реперфузията след церебрална исхемия увеличава риска от мозъчен кръвоизлив, като същевременно води до невроваскуларно увреждане и произвежда прекомерни реактивни кислородни видове (ROS), които увреждат кръвно-мозъчната бариера. Няколко проучвания потвърждават, че разрушаването на BBB е основна причина за патогенезата на исхемичния инсулт.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ИШЕМИЧЕН ИНСУЛТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

BBB се състои главно от ендотелни клетки, перицити, астроцити, неврони и базални мембрани. Основните компоненти на BBB са церебрални микроваскуларни ендотелни клетки, които са свързани чрез плътни връзки, като по този начин ограничават екзогенните молекули в мозъка. Патологичните изменения на тесните връзки - особено оклудин, клаудин-5 и zonula occludens-1 (ZO-1) - значително влияят върху функцията на BBB по време на исхемичен инсулт, особено бариерната пропускливост. По време на I/R периодите прекомерната ROS е един от основните фактори, водещи до директно увреждане на мозъчните неврони. Свръхпроизводството на ROS води до разграждане на определени връзки и разрушаване на BBB, което води до навлизане на екзогенни молекули в мозъка през BBB, което води до влошаване на увреждането на мозъка. Следователно, защитата на BBB чрез антиоксиданти се счита за потенциален начин за предотвратяване на реперфузионно увреждане.

Освен разпадането на BBB, I/R може да доведе до невроваскуларно увреждане и невронална смърт. По време на инсулт повишената смърт на невронни клетки може да е резултат от оксидативен стрес и множество проучвания показват, че ROS влошава тежестта на инсулта и неврологичните увреждания. Въпреки че клиничните изпитвания не са получили задоволителни резултати, невропротекция все още е обещаваща стратегия за лечение на остър исхемичен инсулт. По този начин намирането на ефективни лекарства за неврозащита за лечение на инсулти е от полза за пациентите с инсулт.

Традиционната китайска медицина (ТКМ) предприема мерки за намеса срещу вътрешния дисбаланс на тялото. Поради сложната патогенеза на исхемичните инсулти, многофакторният ефект на TCM и неговите активни съставки играят критична роля при лечението на инсулти.Цистанчеdeserticola YC Ma, широко разпространена в сухите или полусухите райони в цяла Монголия и Северозападен Китай, е широко използвана билка от TCM за лечение на различни заболявания като забравяне и депресия повече от 1 000 години в Китай. Съвременни фармакологични изследвания показват, че суровите екстракти от C. deserticola показват множество фармакологични активности, като напр.подобряване на функцията за учене и памет, неврозащита, имунитет, антиоксидантни ефекти, против стареене и умора. Химическият анализ на C. deserticola показа, че основните му съставки включватфенилетаноидни гликозиди, иридоидни гликозиди, полизахариди и олигозахариди. Въпреки това, активните компоненти на C. deserticola за защита на мозъка не са много ясни.

Невропротективното свойство на C. deserticola предполага неговия терапевтичен потенциал при когнитивни заболявания като инсулт и депресия, както и болестта на Алцхаймер. Въпреки това, изследванията за въздействието на C. deserticola върху инсултите, включително неговите активни компоненти и механизми на действие, са много ограничени. В настоящата работа изследвахме защитния ефект на три екстракта от C. deserticola, общи гликозиди (TGs, фенилетаноидни гликозиди и други гликозиди), полизахариди (PSs) и олигозахариди (OSs) върху церебрални I/R увреждания. Нашите открития могат да допринесат за точното клинично приложение на C. deserticola и да осигурят кандидат агент затерапия на исхемичен инсулт.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Химикали и реактиви

Стъблата на Cistanche deserticola са закупени от Алашан, Вътрешна Монголия и идентифицирани от един от авторите (P.-F. Tu). TG, PS и OS бяха подготвени съгласно нашия докладван по-рано метод. Количественият анализ на TGs се извършва чрез високоефективна течна хроматография (HPLC), както е описано по-горе, и неговата хроматограма е показана на Фигура 1. Основните компоненти на TGs са ехинакозид, тубулозид А, актеозид, изоактеозид и 2'-ацетилактеозид; съдържанието им е съответно 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g и 12,045 mg/g. Съдържанието на PSs и OSs е съответно 69,42% и 65,24%, както е определено чрез HPLC и съответно анализ на фенол-сярна киселина.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ИШЕМИЧЕН ИНСУЛТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Стандартните референции на ехинакозид (A0282), тубулозид A (A0942), актеозид (A0280), изоактеозид (A0281) и 2'-ацетилактеозид (A0943) са закупени от Chengdu Must Biotechnology. Чистотата на всички стандарти е повече от 98%. Комплектите за оцветяване на Nissl H&E са закупени от Boster. Edaravone (T0407-1) ​​е закупен от Target Mol (Шанхай, Китай). Бяха закупени заешки анти-плъхове MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) и миши анти-плъхове CD31 (ab24590) от Abcam Inc. Заешки анти-плъхове Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) и Occludin (BS72035) бяха закупени от Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Бостън, Масачузетс, САЩ) е източникът на заешки анти-плъх Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) беше закупен от Proteintech Group, Inc. Вторичните антитела бяха доставени от Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Пекин, Китай). Hoechst 33258 е получен от Beyotime.

Животни

Плъхове Sprague-Dawley (мъжки, с тегло 250–300 g) са получени от Vital River Laboratory Animal Technology и са настанени в климатизирана стая, поддържана в 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Всички експерименти с животни са извършени съгласно насоките за изследване на животни ARRIVE и са одобрени от Комитета за грижа и използване на животните към Пекинския университетски здравен научен център.

Експериментални протоколи с животни

Плъховете бяха подложени на MCAO/R, както е описано по-рано (Wang et al., 2018). Накратко, лявата обща каротидна артерия (CCA), външната каротидна артерия (ECA) и вътрешната каротидна артерия (ICA) бяха изложени и 3-0 найлонов монофиламентен конец беше вкаран от ECA в ICA до достигане на средата церебрална артерия (MCA). След 1, 5 часа оклузия на MCA, реперфузията беше симулирана чрез отстраняване на нишката. По време на хирургическата процедура телесната температура на всички плъхове се поддържа на 37,0 градуса. Лекарство

Администрация

Плъховете бяха разделени на случаен принцип в шест групи с помощта на софтуер SPSS версия 22.0, както е описано: нормална група (NOR); моделна група (MOD); група едаравон (положително лекарство, 6 mL/kg, EDI); TGs група (280 mg/kg, TGs); PSs група (280 mg/kg, PSs) и OSs група (280 mg/kg, OSs). TGs, PSs и OSs се прилагат веднъж на ден след MCAO/R в продължение на 14 дни. Групите NOR и MOD бяха третирани с нормален физиологичен разтвор. Броят на животните е показан в таблица 1.

Измерване на теглото и модифициран неврологичен дефицит (mNSS)

Телесното тегло беше наблюдавано на 14-ия ден с помощта на цифрова скала ADVENTURE™ (OHAUS, Ню Джърси, САЩ). mNSS беше оценен съгласно метода, описан от FJ Wang (Wang et al., 2018), с малки ревизии.

2, 3, 5-трифенилтетразолиев хлорид (TTC) оцветяване

Инфарктният обем се измерва, както е описано по-горе. Накратко, мозъците бяха разделени на седем еднакво разположени коронални блока (2 mm). Тези срезове се оцветяват с 2% TTC при 37 градуса за 15 минути. Обем на инфаркта (%)=(обем на ипсилатералната исхемична хемисфера − обем на контралатералната исхемична хемисфера)/обем на контралатералната исхемична хемисфера × 100.

Nissl и H&E оцветяване

Плъховете бяха дълбоко анестезирани и след това целият мозък беше бързо отстранен от черепа, фиксиран с помощта на 4% параформалдехид, вграден в парафинов восък и нарязан на резени с дебелина 7 µm. Срезовете се оцветяват с Nissl и H&E. В това изследване шест произволни 200 × 200 µm полета бяха уловени във всеки тъканен образец със светлинен микроскоп. Броят на телата на Nissl е преброен с IPP софтуер версия 6.0.

Анализ на синьото на Evans

Плъховете бяха инжектирани с 2% EB след MCAO/R. Два часа по-късно плъховете бяха анестезирани и след това целият мозък беше бързо отстранен и хомогенизиран в ацетон. Супернатантите се анализират при 620 nm от четец на 800 TS абсорбция.

Измерване на активността на каталазата (CAT), супероксид дисмутаза (SOD), малондиалдехид (MDA) и глутатион пероксидаза (GSH-Px)

Всички серумни проби се центрофугират при 4, 000 × rpm за 15 минути при 4 градуса и след това се анализират за откриване на активността на MDA, CAT, SOD и GSH-Px, следвайки инструкциите на производителя.

Western blotting анализ

Мозъчните тъкани (100 mg), събрани от всеки плъх, се хомогенизират и лизират в RIPA лизисен буфер и след това се анализират за откриване на протеиновата концентрация с помощта на BCA комплект. Общите тъканни протеини се зареждат върху 10% SDS-PAGE гелове и се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана. Мембраната се блокира с помощта на 5% обезмаслено мляко, след което се инкубира за една нощ с първични антитела при 4 градуса. След това мембраната се инкубира с вторично антитяло. Анализът на Western blot беше анализиран с помощта на Kodak Digital Imaging System.

Имунофлуоресцентен анализ

Извършено е имунофлуоресцентно оцветяване за CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 и Keap-1. Първичните антитела срещу Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 и Keap-1 бяха разредени до 1 :200 и 1:100, съответно. Вторичните антитела на Alexa Flur 488 миши анти-заешки IgG и родамин (TRITC) кози анти-заешки IgG бяха разредени до 1:200. Ядрата бяха оцветени с Hoechst 33258. Изображенията бяха заснети с помощта на Vectra® Polaris™ автоматизирана система за количествено изобразяване на патология (PerkinElmer, САЩ). Протеиновата експресия се анализира с помощта на IPP софтуер версия 6.0. Статистически анализ

Всички данни бяха описани като средно ± SD. Софтуерът SPSS версия 22.0 беше извършен за статистически анализ. Използвана е еднопосочна ANOVA при сравняване на различни групи. P < 0.05 се счита за статистическа разлика.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА АНТИИСХЕМИЧНА БОЛЕСТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

РЕЗУЛТАТИ

TGs увеличават телесното тегло и намаляват мозъчните увреждания при MCAO/R плъхове

След 14 дни лечение с TGs, PSs, Oss и EDI бяха оценени телесното тегло, неврологичните дефицити и инфарктните обеми на I/R плъхове. Резултатите показват, че телесните тегла в MOD групата са значително намалени, докато намалените тегла в TGs, PSs и EDI групите са увеличени (Фигура 2A). Резултатите за неврологичен дефицит бяха значително понижени от EDI и TGs (Фигура 2B). Мозъчните срезове при плъхове от групата NOR бяха наситено червени и нямаше инфаркти, докато плъховете от групата MOD показаха голям ипсилатерален мозъчен инфаркт. След лечение с TGs, обемите на инфаркта бяха значително намалени (Фигури 2C, D). Лечението с PSs и OSs не показва очевиден ефект върху горните индекси. Горните данни показват, че TG могат значително да облекчат индуцираното от I/R мозъчно увреждане, но PS и OS не могат.

TGs подобряват хистопатологичното увреждане при MCAO/R плъхове

За да се определят някои от ефектите от лечението с TGs, PSs и OSs върху хистопатологичните увреждания, беше направено H&E оцветяване, за да се разкрият патологични увреждания. Хистоморфологичните структури на мозъците в NOR групата бяха подредени редовно. Морфологичните промени в групите на TGs са по-леки от тези в групата на MOD. Въпреки това, групите на лечение с PSs и OSs не показват значително подобрение на морфологичните промени (Фигура 3).

TGs намаляват невронното увреждане след I/R-индуцирани плъхове

Оцветяването по Nissl показва хистопатологичните промени на невроните в пенумбрата на исхемичната област. Както е показано на Фигура 4, нормалните неврони имат ясен нуклеол и непокътната структура. В групата на MOD невроните са имали разширени междуклетъчни пространства. Телата на nissl изчезнаха, свити и дълбоко изцапани. Въпреки това, тези промени рядко се наблюдават в групите EDI, TGs и PS. Тези резултати показват, че TGs и PSs могат значителноотслабване на исхемия/индуцирано от реперфузия невронално увреждане.

TGs намаляват разрушаването на BBB след I/R-третирани плъхове

Evans blue assay е класически метод за изследване на промяната на пропускливостта на BBB. Резултатите от експеримента показват, че повишено синьо Evans се наблюдава в групата на MOD, докато има значително намалено синьо Evans при плъхове, третирани с TGs и EDI. Освен това, няма значителна разлика между терапевтичните групи на PSs и OSs (Фигура 5). Тези резултати предполагат, че TGs могат значително да намалят прекъсването на BBB.

TG насърчават ангиогенезата при I/R наранени плъхове

По-нови проучвания показват, че ангиогенезата играе критична роля в неврологичното функционално възстановяване и прогностичните резултати след остър исхемичен инсулт (Yuen et al., 2015). За да се оценят ефектите на TGs, PSs и OSs върху ангиогенезата, CD31 и a-SMA бяха използвани за количествено определяне на капилярните числа. Имунофлуоресцентното оцветяване показа, че MOD групата причинява забележително намаляване на експресиите на CD31 (Фигури 6A, B) и a-SMA (Фигури 6C, D) в пенумбрата на исхемичните области на I/R плъхове, в сравнение с нормалните плъхове . Този резултат илюстрира, че I/R може да причини съдово увреждане в полусянката на кората на исхемичните полукълба. Въпреки това, лечението с TGs и EDI забележително повишава капилярната плътност, ангиогенезата и артериогенезата, както е показано от повишените експресии на CD31 и a-SMA. Тези резултати предполагат, че TGs могат да стимулират ангиогенезата в исхемичната полусянка на I/R плъхове, но PSs и OSs не могат.

TGs увеличават експресията на протеини с плътна връзка при I/R наранени плъхове

Нарушаването на BBB може да повиши съдържанието на вода в мозъка и подуване на тъканите, което води до мозъчно увреждане. Протеините с плътно свързване са важни структурни компоненти на BBB. За да се провери дали лечението с TGs, PSs и OSs след инсулт може да повлияе на целостта на BBB, експресиите на ZO-1, claudin-5 и occludin бяха извършени чрез имунофлуоресцентен анализ. Резултатите показват, че експресиите на claudin-5, occludin и ZO-1 са видимо намалени в MOD групата. Те обаче се увеличиха значително след 14 дни от прилагането му. PSs и OSs групите не показват значителни промени в тези протеинови експресии (Фигура 7). Тези данни показват, че TGs могат да регулират експресията на протеини с плътна връзка и вероятно поддържат целостта на BBB след I/R нараняване.

TGs увеличават перицитното покритие върху капилярите при I/R наранени плъхове

Перицитното покритие на капилярите играе критична роля за поддържане на целостта на BBB. По този начин тествахме дали покритието на перицитите може да бъде увеличено чрез лечение с TGs, PSs и OSs. Резултатите от анализа на интензитета на имунофлуоресценцията показват, че както PDGFRb, така и CD31 експресиите са драстично намалени в MOD групата. Прилагането на TGs на I/R плъхове значително възстановява или дори повишава интензитетите на експресия на PDGFRb и CD31, но не се наблюдава разлика в групите на лечение с PSs и OSs (Фигура 8). По този начин, лечението на TGs може значително да увеличи покритието на перицитите. Тези открития допълнително потвърждават, че TG могат да поддържат целостта на BBB след I/R.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРЕДОТВРАЩАВАНЕ НА ИШЕМИЧЕН ИНСУЛТ PHGS75% ECH 30% ACT 12%