Синергични противовъзпалителни ефекти на Laminaria Japonica Fucoidan и Cistanche Tubulosa Extract

Като имунен отговор срещу чужди антигени, макрофагите освобождават провъзпалителни цитокини като фактор на туморна некроза (TNF-), интерлевкин-1 (IL- 1), IL-6 и други. Такива цитокини предизвикват хемотактичен приток на гранулоцити, моноцити, лимфоцити и мастоцити към увредената тъкан, което насърчава отстраняването на антигена и възстановяването на тъканта. Въпреки това, прекомерната инфилтрация и активиране на клетките влошава тъканните наранявания, водещи до оток (съдова ексудация) и болка, които са добре известни явления на възпаление.

TNF- е важен фактор за индуциране на генна експресия на азотен оксид синтаза (iNOS) в няколко клетъчни линии. Активирането на iNOS води до производство на азотен оксид (NO), който не само модулира няколко физиологични функции като бактерицидна и вазодилатация, но също така причинява възпаление. След тъканно увреждане, разграждането от фосфолипази на фосфолипидите на клетъчната мембрана генерира арахидонова киселина. Арахидоновата киселина се разгражда допълнително от циклооксигеназа (СОХ) до простагландини (PG). Прекомерното количество PGE2, образувано от COX-II, индуцира няколко цитокина за възпаление. Тъй като както NO, така и PGE2 действат като основни фактори за възпаление и индуциране на болка, пътищата на TNF- –NO и COX-II–PGE2 са основните потоци на възпалителния процес, които се инхибират от кортикостероиди и нестероиднипротивовъзпалителни лекарства(НСПВС), съответно.

Въпреки че има няколко стероида и НСПВС затерапия на възпалителни заболявания, тези лекарства могат да доведат до неблагоприятни ефекти върху имунната система, стомашно-чревния тракт, бъбреците, черния дроб, централната нервна система, кръвното налягане и сърдечно-съдовата система. Ето защо е необходимо да се сведат до минимум неблагоприятните ефекти от химичните терапевтици, като се заменят или използват в комбинация с природни продукти.

Фукоидан, сулфатен полизахариден комплекс от морски водорасли като Laminaria japonica и Cladosiphon okamuranus, широко разпространен в много страни, се използва като терапевтик в ориенталската медицина за дълъг период от време. В предишни проучвания е доказано, че фукоиданът има антиоксидантно, антикоагулативно, противораково ипротивовъзпалителни дейности. Съответно благоприятните ефекти на фукоидан върху възпалителни заболявания, исхемия, имунна дисфункция и тумори привличат вниманието на изследователите. От друга страна,Cistanche tubulosa(CT) също се използва широко като традиционно лекарство в Китай. Съобщава се, че CT екстрактите понижават производството на TNF-á и IL- 4, които са основни фактори за производството на NO във възпалителните пътища [19].

Такива предишни констатации ни накараха да изследваме комбинираната ефикасност на фукоидан и CT екстракт върху 2-та основни пътя на възпаление. За да изясним механизма на действие, ние анализирахме NO и PGE2 в ексудатите от възпаление на въздушната торбичка, предизвикано от карагенан.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРОФИЛАКТИКАВЪЗПАЛИТЕЛНИ ДЕЙНОСТИPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Материали и методи

Материали

Полупречистен фукоидан и воден екстракт от CT бяха получени от Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Корея). Фукоиданът и CT екстрактът се държат при 4 градуса, смесват се (1:3), разтварят се в пречистена вода преди употреба и се прилагат перорално в обем от 5 mL/kg.

Клетъчна култура и количествено определяне на NO

Клетъчната линия от миши макрофаги RAW 264.7 е закупена от American Type Culture Collection (Manassas, USA) и е култивирана в модифицирана среда на Eagle на Dulbecco (Sigma, St. Louis, USA), съдържаща 10% фетален говежди серум и антибиотици [100 U/mL пеницилин (Sigma) и 100 µg/mL стрептомицин (Sigma)]. Клетките се инкубират в овлажнена 5% CO2 атмосфера при 37 градуса.

За да се оценят ефектите на фукоидан и CT екстракт върху секрецията на NO, RAW 264.7 клетки (1×106 клетки/mL) се инкубират с фукоидан или CT екстракт (1–320 µg/mL) за 5 минути , последвано от интерферон- (IFN-, 10 U/mL) и липополизахарид (LPS, 10 µg/mL) за 24 часа. В нашите предварителни проучвания беше потвърдено, че лечението с IFN- плюс LPS за активиране на клетки RAW 264.7 не повлиява жизнеспособността на клетките до 24 часа и че фукоиданът и екстрактът от CT не са цитотоксични до 1 mg/mL. Като индикатор за NO се измерва концентрацията на нитрит (NO2 – ), окисления продукт на NO. Културалната среда се смесва с равен обем реактив на Griess (1% сулфаниламид, 0,1% нафтил етилендиамин в 2,5% фосфорна киселина) [21] и се инкубира при стайна температура за 10 минути. Концентрацията на нитрит се анализира при 540 nm, където NaNO2 се използва за генериране на стандартна крива.

Животни и лечение

Мъжки ICR мишки (на възраст 7 седмици) бяха закупени от Daehan Biolink (Eumseong, Корея) и настанени в стая с постоянни условия на околната среда (22±2ºC; 40-70% относителна влажност; 12-часова светлина -тъмен цикъл; 150-300 лукс яркост). Пелетната храна и пречистената вода бяха достъпни ad libitum. Всички експерименти с животни бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и използване на животни (IACUC) на Националния университет Chungbuk (CBNU), Корея, и проведени съгласно стандартните оперативни процедури (SOP) на Центъра за лабораторни изследвания на животни, CBNU.

Мишките (n=8/група) са третирани перорално с фукоидан (18 или 54 mg/kg), CT екстракт (54 или 162 mg/kg) или тяхна смес (18+54, {{6 }} или 90+270 mg/kg) веднъж дневно в продължение на 7 дни. Ниски дози фукоидан (18 mg/kg) и CT екстракт (54 mg/kg) са от изчислени дози за хора от 100 mg/тяло (70 kg) и 300 mg/тяло след транслация на телесното тегло (Km{{14) }} съответно за човек/Km=3 за мишка). Високите дози фукоидан и CT екстракт бяха определени на 3 пъти, самостоятелно или в смес, а сместа с най-висока доза беше фиксирана на 5 пъти, за да се оценят максималните синергични ефекти.

На първия ден от лечението с фукоидан и CT екстракт, мишките бяха инжектирани подкожно с 10 mL стерилен въздух в задната страна, за да се образува торбичка [22,23]. След 2 и 5 дни торбичката се инжектира отново с 5 mL въздух. Един час след последното третиране, 1 mL карагенан (1% във физиологичен разтвор; Sigma) или неговият носител (физиологичен разтвор) се инжектира в торбичката.

Анализи на ексудатите

Въздушната торбичка се промива с 1 mL студен физиологичен разтвор 6 часа след инжектирането на карагенан и се записва нетният обем на промивната течност. Общият брой на възпалителни клетки, неутрофили, моноцити и лимфоцити се определя с помощта на брояч на ботуши. Концентрациите на NO и PGE2 се определят чрез реагент на Griess (Sigma) и ензимен имуноанализ (EIA), като се използва съответно комплект Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА БЛОКИРАЩО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ВЪЗПАЛИТЕЛЕН ХЕМОТАКСИС PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Хистопатологично изследване

Тъканта, покриваща торбичката, се отстранява и фиксира в неутрален формалинов разтвор. Покрити с парафин тъканни слайдове се оцветяват с хематоксилин-еозин и се изследват под светлинен микроскоп за възпалителни лезии.

Статистически анализ

Резултатите са представени като средно ± SE. Сравненията на експериментални групи бяха направени чрез еднопосочен анализ на дисперсията, последван от корекция на теста на Tukey. AP стойност<0.05 was considered statistically significant.

Резултати

In vitro, лечението с клетъчна култура RAW 264.7, IFN- и LPS значително повишава производството на NO (Фигура 1). Предварителното третиране с фукоидан (1–320 µg/mL) не повлиява освобождаването на NO от клетъчната линия на макрофагите (Фигура 1А). За сравнение, CT екстракт (32–320 µg/mL) значително потиска производството на NO, което е показателно за противовъзпалителна активност (Фигура 1B).

Инжектирането на карагенан във въздушната торбичка на мишката значително увеличава обема на ексудата в торбичката (Фигура 2). Такава повишена ексудация беше отслабена чрез третиране с фукоидан (18 mg/kg) и CT екстракт (54 и 162 mg/kg). По-специално, комбинираното лечение с фукоидан и CT екстракт допълнително намалява обема на ексудатите в сравнение с индивидуалните ефекти, въпреки че комбинациите с по-високи дози (54+162 mg/kg и 90+270 mg/kg) не показват допълнителна ефикасност към комбинацията с най-ниска доза (18+54 mg/kg) (Фигура 2А). Съдържанието на степен N в торбичката също се увеличи драстично след инжектиране на карагенан (Фигура 2B). В сравнение с лекия ефект на фукоидан, екстрактът от CT значително понижава концентрацията на N степен. Комбинираното лечение с фукоидан и CT екстракт допълнително намалява нивото на NO по дозозависим начин. По подобен начин повишеното съдържание на PGE2 беше синергично потиснато от комбинираната терапия на фукоидан и CT екстракт (Фигура 2C).

Успоредно с възпалителните медиатори в торбичката, броят на възпалителните клетки се увеличава драстично чрез инжектиране на карагенан: 37,8, 4,8 и 24,1 пъти повече от контролните нива за неутрофили, моноцити и лимфоцити, съответно (Таблица 1). Въпреки това, фукоиданът и CT екстрактът значително намаляват възпалителната клетъчна инфилтрация, при което фукоиданът е донякъде по-добър от CT екстракта. Неочаквано не се постига синергичен ефект при инфилтрацията на възпалителни клетки чрез съвместно прилагане на фукоидан и CT екстракт.

Както се заключава от възпалителната клетъчна инфилтрация в ексудатите, подкожната тъкан, заобикаляща въздушните торбички, показва тежки възпалителни лезии (Фигура 3). Бяха наблюдавани изключително много клетки в удебелената подкожна тъкан, изложени на карагенан (Фигура 3B), в сравнение с почти нормалните характеристики при контролните животни (Фигура 3A). Такива възпалителни лезии бяха забележително отслабени чрез лечение с фукоидан (Фигури 3C и 3D) или CT екстракт (Фигури 3E и 3F).

По-специално, по-високи противовъзпалителни ефекти са получени чрез комбинирана терапия с фукоидан и CT екстракт (Фигури 3G-3I).

Дискусия

Използвайки in viv модел на индуцирано от арагинан възпаление на въздушната торбичка, инжектирането на въздух в гърбовете на гризачите предизвиква пролиферация на клетки, които се разслояват на повърхността на кухината, за да образуват структура, подобна на синовиума. В този модел, инжектирането на предизвикана от карагенан възпалителна клетъчна инфилтрация увеличава ексудата, което е показателно за съдово изтичане. Въздушната торбичка служи като резервоар на възпалителни клетки и медиатори, които могат лесно да бъдат измерени в течността, която се натрупва локално.

Сред различните възпалителни медиатори, които могат да индуцират съдова пропускливост, е добре известно, че NO и PGE2 са основни фактори, участващи в патогенезата на много възпалителни заболявания. Те са известни също като медиатори на индукция на болка и възприятие. iNOS, който се експресира и активира в различни типове клетки чрез стимулация с TNF- и/или LPS по време на възпаление, произвежда високи, постоянни концентрации на NO. NO е важна регулаторна молекула в различни физиологични функции, като вазодилатация, водеща до съдово изтичане. PGE2, който се генерира от арахидонова киселина чрез COXs, допринася за развитието на много възпалителни заболявания и свръхпроизводството на PGE2 в отговор на различни възпалителни стимулации е свързано с повишена регулация на нивата на COX-II и прогресия на възпалението. Следователно пътищата на TNF- - NO и COX-II-PGE2 се разглеждат като два основни потока на възпалителни процеси, които се блокират съответно от инхибитори на iNOS (кортикостероиди) и COX (НСПВС).

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРЕДПАЗВАНЕ НА ВЪЗПАЛИТЕЛНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В настоящото проучване съвместното приложение на фукоидан и CT екстракт намалява обема на ексудата в торбичката, което предполага, че те притежават супресивна активност срещу съдово изтичане (Фигура 2А). В сравнение с индивидуалните ефекти на всеки фукоидан и екстракт от CT, комбинираното лечение се увеличава допълнително, което означава, че две степени на съединенията действат синергично. Такива синергични ефекти между фукоидан и CT екстракт бяха подкрепени от тяхната активност върху нивата на NO и PGE2 в ексудатите (Фигури 3B и 2C).

Интересно е обаче, че беше потвърдено, че фукоиданът не инхибира директно активирането на макрофагите in vitro анализ (Фигура 1А). По подобен начин, инхибиторният потенциал на фукоидан върху натрупването на NO и PGE2 in vivo анализ е относително по-нисък от този на CT екстракт (Фигури 2B и 2C). Такъв механизъм на действие на фукоидан е различен от директното инактивиране на клетките чрез CT екстракт (Фигура 1B). За сравнение, фукоиданът проявява висока ефикасност при инхибирането на възпалителната клетъчна инфилтрация в торбичките (Таблица 1). Фукоиданът превъзхожда CT екстракта при блокиране на миграцията на неутрофили, моноцити и лимфоцити към местата на увреждане на тъканите, причинени от карагенан. Интересното е, че няма синергичен антимиграционен ефект, показателен за различни механизми на действие между фукоидан и CT екстракт: т.е. фукоиданът блокира инфилтрацията на възпалителни клетки, докато CT екстрактът инхибира активирането на клетките.

Полиморфонуклеарните клетки, особено неутрофилите, са основните клетъчни компоненти, привлечени към остри възпалителни места, индуцирани от карагенан. В допълнение, произтичащите възпалителни клетки като макрофаги и лимфоцити също играят централна роля във възпалителния процес чрез секретиране на цитокини. При предварително третиране с фукоидан или CT екстракт, броят на белите кръвни клетки, които мигрират в инжектираните с карагенан въздушни торбички, е значително потиснат. Този резултат е в съответствие с ефект, който би се получил от кортикостероиди като дексаметазон, но не и от НСПВС, включително индометацин. Следователно се предполага, че фукоиданът и екстрактът от CT имат частично свойство на стероиди.

В допълнение към блокиращото действие върху възпалителния клетъчен хемотаксис, изглежда, че CT екстрактът потиска активирането на макрофагите. Това се потвърждава от неговите инхибиторни действия върху NO in vitro и in vivo, който е основният възпалителен медиатор, произвеждан от макрофагите. По този начин, ефектът на CT екстракта върху макрофагите може да се дължи на потискане на експресията на иРНК и/или директно инхибиране на активността на iNOS в тези клетки.

PGE2 също е един от основните възпалителни медиатори. Увеличава се паралелно с оток на тъканите, който се потиска от НСПВС, инхибитори на COX. Карагенанът може да увеличи производството на PGE2 чрез индуциране на COX-II иРНК и COX-II протеин в ексудата на торбичката. В този модел карагенанът значително увеличава количеството на PGE2 и той е значително потиснат от CT екстракт. Интересно е да се отбележи, че този резултат е в съответствие с ефект, който би се получил от NSAID индометацин. Следователно, от резултатите се прави извод, че екстрактът от CT има допълнителни свойства на НСПВС. Взети заедно, се смята, че CT екстрактът упражнява както кортикостероидни, така и подобни на НСПВС ефекти в модела на индуцирано от карагенан възпаление и че фукоиданът засилвапротивовъзпалителни ефекти на CT екстрактчрез блокиране на възпалителната клетъчна инфилтрация.

Въпреки че определянето на точния механизъм на действие изисква по-нататъшно проучване, смес от фукоидан и CT екстракт значително отслабва възпалителните признаци чрез блокиране на TNF- –NO и COX-II-PGE2 пътищата при възпаление на въздушната торбичка, предизвикано от карагенан. Тези констатации предоставят доказателства, че комбинираното лечение с фукоидан и CT екстракт може да бъде обещаващ кандидат за облекчаване на различни видове възпаления, които се повлияват от кортикостероиди или НСПВС.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРЕДПАЗВАНЕ НА ВЪЗПАЛИТЕЛНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%