Систематична идентификация и сравнение на изразените профили на екзозомални miPHK при прасета, заразени с NADC30-подобен на PRRSV щам
Dec 27, 2023
Просто резюме:Екзозомите играят уникална роля при вирусна инфекция, представяне на антиген и потискане/насърчаване на телесния имунитет. Вирусът на репродуктивния и респираторен синдром на свинете (PRRSV) е един от най-увреждащите патогени в свиневъдството. Тук използвахме PRRSV NADC30-подобен на CHsx1401 щам за изкуствено заразяване на 42-дневни прасета, изолиране на серумни екзозоми и идентифициране на 33 значително диференциално експресирани (DE) екзозомни miRNAs между заразените и контролните групи, и 18 DE miRNA, свързани с PRRSV инфекция и имунитет, бяха скринирани като потенциални функционални молекули, участващи в регулирането на PRRSV вирусна инфекция от екзозоми.
Резюме:Екзозомите са биологични везикули, секретирани и освободени от клетки, които действат като медиатори на междуклетъчната комуникация и играят уникална роля при вирусна инфекция, представяне на антиген и потискане/насърчаване на телесния имунитет. Вирусът на репродуктивния и респираторен синдром на свинете (PRRSV) е един от най-увреждащите патогени в свиневъдството и може да причини репродуктивни нарушения при свинете майки, респираторни заболявания при свинете, намален растеж и други заболявания, водещи до смъртност при свинете. В това проучване използвахме PRRSV NADC30-като CHsx1401 щам за изкуствено заразяване на 42-дневни прасета и изолиране на серумни екзозоми. Въз основа на технология за секвениране с висока пропускателна способност, 305 miPHKs бяха идентифицирани в серумни екзозоми преди и след инфекцията, сред които 33 miPHKs бяха значително различно експресирани между групите (13 относително регулирани нагоре и 20 относително понижени). Анализът на запазване на последователността на генома CHsx1401 идентифицира 8 консервативни региона, от които общо 16 диференциално експресирани (DE) miPHKs се предвижда да се свържат към консервативния регион, най-близо до 30 UTR на генома CHsx1401, включително 5 DE miPHK, способни да се свързват с CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). По-нататъшен анализ разкрива, че целевите гени на диференциално експресирани miRNAs са широко включени в свързани с екзозомалната функция и свързани с вродения имунитет сигнални пътища и 18 DE miPHK (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 и т.н.), свързани с PRRSV инфекция и имунитет, бяха скринирани като потенциални функционални молекули, участващи в регулирането на PRRSV вирусна инфекция от екзозоми.
растение цистанче, повишаващо имунната система
Ключови думи:PRRSV; серумна екзозома; миРНК
1. Въведение
Вирусът на репродуктивния и респираторен синдром на свинете (PRRSV) е едноверижен положително-верижен РНК вирус със структура на обвивка, принадлежащ към разред Nidovirales, семейство Arteriviridae, род Betaarterivirus [1,2]. Той е сферичен или елипсоидален с диаметър 50–65 nm под замръзващ електронен микроскоп [3,4]. PRRSV геномът е с дължина около 15 kb с 50 cap и 30 polyA-опашка и съдържа най-малко 10 отворени рамки за четене (ORF), оградени от нетранслирани региони (UTR) както на 50, така и на 30 края [5,6] и е обвит от нуклеокапсиден протеин, с липидно двуслойно покритие за образуване на вирусни частици. Екзозомите принадлежат към везикули с монослойна мембранна структура и имат същата топологична структура като клетките [7]. Формата е "чашковидна" или "дискообразна" под електронен микроскоп [8,9]. Екзозомите могат да съществуват в кръвоносната система дълго време и веществата в екзозомите могат да бъдат абсорбирани от съседни клетки или отдалечени рецепторни клетки и след това да регулират рецепторните клетки, за да участват в обмена на генетични материали между клетките [10,11]. Те се състоят главно от мембранни повърхностни вещества и пренасяно съдържание, включително рецептори на клетъчната повърхност, мембранни протеини, разтворими протеини, липиди, РНК (mRNA, miRNA, lncRNA и вирусна РНК и др.), геномна ДНК, митохондриална ДНК [12–14]. ]. МикроРНК (miPHK) са клас от 18–25 нуклеотиди (nt) еволюционно запазени ендогенни некодиращи едноверижни малки РНК, които инхибират процеса на транслация чрез индуциране на разграждането на целевата иРНК или чрез свързване с 30 UTR на целевата иРНК, което води до до пост-транскрипционно заглушаване на гени, след което регулиране на генната експресия на пост-транскрипционно ниво [15–17]. Изчислено е, че miPHK регулират повече от 60% от гените на бозайниците след транскрипция [18,19]. MiPHK играят важна роля в междуклетъчната комуникация и могат също да се използват като потенциална функционална молекула за болести и вирусни инфекции, предаване и защита [20]. Все по-голям брой проучвания показват, че miPHK могат да присъстват в телесни течности, като слюнка, урина, кърма и кръв, и да действат чрез кръвоносната система на телесните течности [21,22]. Екзозомалните миРНК се считат за ендогенни регулатори на генната експресия и метаболизъм и могат да показват различни патологични състояния [23,24].
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
През последните две десетилетия беше показано, че miPHK имат решаваща роля в регулирането на развитието на имунните клетки, вродените имунни отговори и придобитите имунни отговори. Съобщава се, че някои други miPHK увреждат PRRSV инфекцията по следните начини, директно се насочват към PRRSV генома или PRRSV рецептора или играят роля чрез регулиране на вродения имунен отговор на гостоприемника. Семейството miR{0}} може значително да увреди репликацията на вируса, а miR-26a може да инхибира репликацията на тип 1 и тип 2 PRRSV щамове в свински алвеоларни макрофаги (PAM) чрез регулиране на интерферон тип I (IFN) път, който е по-ефективен от miR-26b [25,26]. miR-30c и miR-125b са идентифицирани, за да модулират вродения имунен отговор на гостоприемника чрез насочване съответно към пътя на IFN тип I и пътя на NF-кВ [27–29]. MiR-23, miR-378 и miR-505 са антивирусни фактори на гостоприемника, насочени към PRRSV и имат консервативни целеви места в тип 2 щамове на PRRSV [30]. В същото време е установено, че miR-506 на гостоприемника инхибира репликацията на PRRSV чрез директно насочване към рецептор CD151 на PRRSV в MARC-145 клетки [31]. miR-181 също може косвено да инхибира репликацията на PRRSV чрез понижаване на регулацията на PRRSV рецептор CD163 в кръвни моноцити и PAM [32]. В допълнение, miRNA могат да стимулират репликацията на PRRSV чрез намеса в основната клетъчна физиология. MiR-24-3p и miR-22 директно се насочват към 30 UTR на HO-1 по време на инфекция с PRRSV, за да избегнат инхибирането на хемоксигеназата-1 (HO-1), a протеин на топлинен шок (известен също като HSP32) върху PRRSV [33,34]. Известно е, че прасетата са по-податливи на PRRSV и по-малко способни да се защитят срещу навлизането на този патоген в организма [35]. В настоящото изследване вроденият имунитет и придобитият имунитет на прасета, заразени с този вирус, са изследвани на молекулярно ниво, като се използва щам, разпространен в полето. Комплект за изолиране на серумни екзозоми, трансмисионна електронна микроскопия (TEM), анализ за проследяване на наночастици (NTA) и Western blot (WB) бяха използвани за изолиране и идентифициране на серумни екзозоми преди и след инфекция с PRRSV, последвано от анализ на секвениране на малка РНК, идентификация, и анализ на резултатите от диференциалната експресия, използвайки биоинформатични методи за получаване на няколко PRRSV-асоциирани серумни екзозомни miPHK, последвано от идентифициране на резултатите от данните, използвайки количествена PCR в реално време (qRT-PCR).
2. Материали и методи
2.1. Експерименти с животни
Шест двойно отрицателни здрави бели прасета на PRRSV антиген и антитела на 42-дневна възраст бяха поставени в системата за чисто хранене на прасета за изолиране, здравеопазване и адаптиране към околната среда. Всички прасета са били свободни да ядат и пият без ограничения. Когато се запознаха с условията в изолатора, прасетата бяха назално инокулирани с 2 mL 105 TCID50/mL PRRSV NADC30-като CHsx1401, който беше споменат от предшественици [36,37]. Кръвта на прасетата преди (контролна група, n=6) и 7 дни след (третирана група, n=6) вирусна инокулация беше събрана от предната куха вена за изолиране на серум. Клетъчните остатъци в серума се отстраняват чрез центрофугиране при 3000 g за 15 минути. Всички експерименти с животни в нашето проучване бяха одобрени от Комитета по етика на животните към Института по животновъдни науки, Китайската академия на селскостопанските науки (CAAS) (Пекин, Китай), IAS2022-130.
2.2. Изолиране и пречистване на серумни екзозоми
Изолирането и пречистването на екзозома се извършва с помощта на комплекта exoEasy Maxi (QIAGEN, Hilden, Германия, кат. № 76064) съгласно протокола на производителя.
2.3. Трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ)
Екстрахираните екзозомни суспензии се нанасят върху медна мрежа, покрита с карбоформар, и екзозомите се изплакват с PBS и се подлагат на стандартно оцветяване с уранил ацетат в продължение на 3 минути при стайна температура. След изсушаване за няколко минути при стайна температура, решетката се визуализира и снима при 100 kV чрез трансмисионен електронен микроскоп (HT-7700, Hitachi-High Tech, Токио, Япония).
2.4. Анализ на проследяване на наночастици (NTA)
Екстрахираните екзозоми се разреждат с 1 × PBS чрез промяна на обема от 10 на 30 µL. След като пробата беше тествана, концентрацията и размерът на серумните екзозоми бяха анализирани чрез N30E поток нано-анализатор, следвайки инструкциите на производителя (NanoFCM, Xiamen, Китай).
2.5. Western Blot
Екстрахираните екзозомни проби се добавят към RIPA лизат, смесен с протеазен инхибитор (Invitrogen, Waltham, MA, USA) и фенилметилсулфонил флуорид (PMSF), за да се екстрахира екзозомният протеин, който се лизира върху лед за 30 минути. След това, съгласно инструкциите на комплекта Bradford, ние количествено определихме концентрацията на серумния екзозомен протеин. Екзозомните протеини претърпяха термична денатурация. Същото количество протеин се отделя върху 12% SDS-PAGE гел и след това се прехвърля към мембрана от поливинилиден флуорид (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, USA). Беше накиснат в TBST, съдържащ 5% обезмаслено мляко на прах и запечатан за 1 час при стайна температура. Накиснахме мембраната в разреденото първично антитяло (анти-CD9 антитяло, Abcam, Бостън, Масачузетс, САЩ, #ab92726; анти-CD81 антитяло, Abcam, Бостън, Масачузетс, САЩ, #ab109201) за една нощ при 4 ◦C и възстановихме първичното антитяло. Накиснахме мембраната в разреденото вторично антитяло, инкубирахме я при стайна температура за 1 час и възстановихме вторичното антитяло. Положихме измития филм от PBST върху филма за свежо съхранение, добавихме равен обем смесен ECL a/b хромогенен разтвор и го поставихме в хемилуминесцентната камера.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.6. Секвениране на екзозомна малка РНК и анализи на данни
Общата РНК от екзозомите се екстрахира с Trizol съгласно инструкциите на производителя. След това открихме концентрацията на РНК и стойността на оптичната плътност (OD) и открихме разграждането и чистотата на РНК с 1% електрофореза в агарозен гел. Междувременно Agilent Bioanalyzer 2100 беше използван за откриване на целостта на РНК. Използвахме общата РНК на екзозомите след проверка на качеството. Съгласно инструкциите на производителя, използвахме комплекта за подготовка на малка РНК библиотека NEB NEXT мултиплекс за Illumina® (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Комплектът подготви малка РНК кДНК библиотека и я секвенира, за да произведе 50 nt еднокрайни четения от платформата Illumina Novaseq 6000. Всички процедури за подготовка на малка РНК библиотека бяха извършени от Novogene (Пекин, Китай). Данните след контрол на качеството бяха подравнени към референтния геном на свинете (Sus scrofa 11.1) с помощта на папийонка. Известните miPHK бяха идентифицирани от базата данни miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, достъп на 14 януари 2022 г.), miRdeep2 (v0.0.5) [39] и miRevo (v1.1 ) [40] и бяха използвани за прогнозиране на нови miPHK. В същото време анализът на диференциалната експресия за miRNAs беше извършен от DESeq (v1.24.0) [41], което изисква |промяна на пъти| > 1,6 и p < 0,05. Подравняването беше извършено с помощта на MEGA (V11) [42], последвано от точкуване на една база с помощта на PHAST (v1.6.9) [43] и оценка на най-консервираните региони на 10 вирусни гена, включително WUH3 (GenBank номер за достъп HM853973), VR2332 ( GenBank номер за достъп U87392), JXA1 (GenBank номер за достъп. EF112445), CH-1a (GenBank номер за достъп. AY032626), NADC30 (GenBank номер за достъп. HN654459), HUN4 (GenBank номер за достъп. EF635006), HLJZD 22-1812 (GenBank номер за достъп MN648450), SC/DJY (GenBank номер за достъп MT075480) и Lelystad (GenBank номер за достъп M96262.2). RNAhybrid (V2.0) [44] беше използван за прогнозиране на свързването на идентифицираната miRNA последователност към 3 0 UTR на генома на вируса CHsx1401. Miranda (v3.3a) и RNAhybrid бяха използвани за целево прогнозиране на ген. Пакетът R на клъстерния профил [45] беше използван за GO (Генна онтология) функционален анализ на обогатяване на целевите гени и KEGG (Киото Енциклопедия на гените и геномите) анализ на обогатяване на пътя.
2.7. Валидиране на експресията на miRNA чрез RT-qPCR
Общата РНК се изолира от серумни екзозоми с помощта на Trizol (Invitrogen, Шанхай, Китай) съгласно протокола на производителя. Изолираната РНК се проверява чрез RT-qPCR върху проби (n=6 на група). cDNA се синтезира съгласно инструкциите на miRNA 1st strand cDNA synthesis (by stem-loop) kit (Vazyme, Nanjing, China) и количественото определяне на флуоресценцията се извършва с помощта на ABI 7500 съгласно инструкции на miRNA универсална SYBR qPCR основна смес (Vazyme, Nanjing, Китай). Използваните параметри на термичния цикъл са както следва: първи етап: 95 ◦C за 30 s; Етап 2: 95 ◦C за 5 s, 60 ◦C за 34 s и 40 цикъла; Етап 3: 95 ◦C за 15 s, 60 ◦C за 1 min и 95 ◦C за 15 s. Праймерни последователности на miRNAs, генът U6, бяха използвани като референция [46] и изброени в допълнителна таблица S1. Всички qRT-PCR проверки бяха извършени с помощта на три биологични реплики и с три реплики за всяка проба. Относителното изобилие на транскрипти беше изчислено чрез 2-Ct метода и SPSS (v22.0) и GraphPad Prism (v8.0) бяха използвани съответно за анализ на данни и картографиране. p <0,05 означава, че разликата е статистически значима.
3. Резултати
3.1. Относителна стойност на антиген и антитяло след инокулация на вируса
Резултатите от тестовете за PRRSV антиген и антитела преди (ден 0) и след (ден 7) провокацията са показани в таблица 1. Серологичното откриване на PRRSV антиген и антитяло преди провокацията е отрицателно, а антигенът е положителен след провокацията, което показва, че прасетата са били успешно заразени с CHsx1401.
3.2. Изолиране и идентифициране на серумни екзозоми
Изолираните от серума везикули са открити чрез ТЕМ. Повечето везикули могат да видят вдлъбнати екзозоми във формата на чиния или диск в средата. Ръбът на мембраната на екзозомите е видим и морфологията е относително пълна (Фигура 1A, B). Анализът за проследяване на наночастици показа, че 95,73% от екзозомите имат диаметър 30–150 nm, главно около 72,25 nm, със среден диаметър 76,22 nm, което е в съответствие с характеристиките на размера на екзозомите (Фигура 1C). Този диапазон на размера е подобен на този, открит от ТЕМ и допълнително потвърждава идентичността на тези везикули като екзозоми. Western blot анализът показа, че везикулите, изолирани от серумните проби, са положителни за CD9 и CD81 протеини (Фигура 1D). Горните характеристики съответстват на стандартите за идентификация на екзозоми, формулирани от Международното дружество за допълнителни везикули (ISEV) в MISEV2018 [47].
Таблица 1. Антиген и антитяло от (ден 0) и (ден 7) с заразен вирус.
Фигура 1. Основни характеристики на серумните екзозоми. (A, B) показват морфологичните характеристики на везикулите чрез ТЕМ. Скалите са съответно 500 nm и 100 nm. (C) NTA показва диаметъра и концентрацията на повечето везикули. (D) Western blot показа наличието на екзозомни маркери CD81 и CD9 в серумни екзозоми. Забележка: Смесването в WB резултатите е смесената суспензия на пробата, изолирана от комплекта exoEasy Maxi
3.3. Малко РНК секвениране на серумни екзозоми
За всяка проба чистите данни достигнаха 0.5 Gb, а базовият процент Q30 беше над 96,20%. Чистите показания на всяка проба бяха приведени в съответствие с референтния геном на прасето. Сред 12-те проби контролната група получи съответно 10 920 887, 10 248 696, 10 109 117, 10 655 494, 9 217 285 и 9 782 523 прочитания. Лекуваната група получи съответно 11 889 518, 10 593 504, 10 593 504, 12 846 080, 10 105 325, 11 729 451 и 9 789 542 прочитания. Средно 77,96% от общите чисти показания съдържат 19–22 нуклеотида (nt) на дължина (Фигура 2А). Отчитанията след контрол на качеството представляват повече от 92,59% от общите четения. Обработените чисти показания бяха приведени в съответствие с референтния геном на свинете и картографираният процент на 12 библиотеки в генома беше повече от 92,30%, а картографираният процент беше 94,98% (Фигура 2B). Това показва, че конструираната серумна екзозомна miRNA библиотека е с високо качество и е подходяща за по-нататъшен анализ. Подробностите са изброени в допълнителна таблица S2.
Фигура 2. Преглед на данните за малки РНК транскриптоми. (A) Разпределение на дължината на броя на прочетените проби от серумни екзозоми (nt=нуклеотиди); (B) процент от 12 проби, картографирани към референтния геном
3.4. Диференциално експресионен анализ на miRNAs
След количествен анализ на идентифицираната експресия на miRNA, miPHK бяха скринирани чрез праговете, описани по-рано в раздел 2.6. Бяха получени общо 305 miPHK преди и след инокулирането на щама CHsx1401 (контрола, n=6; лечение, n=6). Общо 33 диференциално експресирани (DE) miRNAs бяха идентифицирани между двете групи, 13 DE miPHKs бяха регулирани нагоре и 20 DE miPHKs бяха регулирани надолу в групата на лечение (Фигура 3 и допълнителна таблица S3).
3.5. Анализ на функционално обогатяване на миРНК целеви гени
Общо 7283 целеви гена бяха предсказани от 33 DE miPHK и функциите на целевите гени бяха концентрирани главно в положителната регулация на MAPK каскадата, процеса на липидния метаболизъм, регулирането на вътреклетъчната сигнална трансдукция, ERK1 и ERK2 каскадата и т.н. (Фигура 4A ). По отношение на молекулярните функции, диференциално експресираните миРНК целеви гени се фокусират главно върху регулаторната активност на GTP-ензим, киназна активност, регулаторна активност на нуклеозид трифосфатаза и други функции, свързани със сигналната трансдукция и енергийния метаболизъм (Фигура 4В). В допълнение, сред клетъчните компоненти, целевите гени участват главно в биологичните функции на супрамолекулни полимери, Голджи, автофагозоми, клетъчна повърхност, ранни ендозоми и т.н. (Фигура 4C). Функциите на тези компоненти са тясно свързани с образуването на екзозоми, което обяснява и точността на секвенирането. Анализът на обогатяване на пътя на KEGG показа, че целевите гени са значително обогатени с ендоцитоза, сигнален път MAPK, сигнален път Rap1, сигнален път на сфинголипиди и сигнален път PI3K Akt (p < 0.05) (Фигура 5A ). В същото време обогатените пътища бяха класифицирани и анализирани. Резултатите показват, че пътят на KEGG на целевия ген е обогатен главно при обработка на информация за околната среда, човешки заболявания и биологични системи (Фигура 5B).
Фигура 3. Диференциална експресия на miPHK в екзозоми. (A) Вулканичен график на miRNAs между контролните и третираните групи; (B) йерархична клъстерна топлинна карта на DE miRNAs между контролни и третирани групи.
Фигура 4. Анализ на обогатяване на функцията GO на DE miRNAs целеви гени. (A) Биологичен процес на DE miRNAs целеви гени; (B) молекулярни функции на DE miRNAs целеви гени; (C) клетъчни компоненти на DE miRNAs са насочени към гени
Фигура 5. Анализ на обогатяване на пътя на KEGG на целеви гени. (A) Значително обогатен KEGG път с целеви гени на DE miRNAs; (B) класификация на значително обогатени KEGG пътища.
3.6. Предсказване на насочване на серумна екзозомна миРНК и PRRSV CHsx1401 геном
Според оценката на phastCons на единична база след подравняване от PHAST, общо осем най-запазени сегмента (черни ленти над картата на пика) са получени сред вирусните геноми (Фигура 6). Установено е, че общо 31 DE miRNAs се свързват със запазения сегмент чрез предсказване на miRNAs, свързани със запазения сегмент. Сред тях, в запазената област (14 644–15 020 nt), най-близо до 30 UTR (14 870–15 020) на генома CHsx1401, се предвижда 16 DE miPHK да се свържат с него, включително 5 miPHK (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 и ssc-miR-6529), които могат да се свързват с 30 UTR на CHsx1401. Сред тези miRNAs, само ssc-miR-223 беше регулиран нагоре след инфекция, а други miPHKs бяха регулирани надолу след инфекция. Вижте допълнителна таблица S4 за подробности.
Фигура 6. Запазени сегменти в генома на щам CHsx1401, предсказан от PHAST
3.7. Скрининг на DE miRNA, свързани с функцията на екзозомата и PRRSV
Разнообразие от диференциално експресирани miRNAs, свързани с функцията на екзозомите и PRRSV, бяха открити чрез анализ на функционално обогатяване на целевите гени. Сред тях 11 DE miRNA като ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 и ssc-miR-320 участват в усвояването на екзозоми и техните целеви гени са концентрирани главно в генното семейство Ras, анексиновото семейство и генното семейство на ADP рибозилирането. Осемнадесет DE miRNAs, включително sscmiR-10b, ssc-miR-124a и ssc-miR-128, участват в имуно-свързани пътища и техните целеви гени са концентрирани главно в MAPK генно семейство, PIK3 генно семейство и генно семейство на протеин фосфатаза. Докато 11 DE miPHK участват във вирусна инвазия, свързаните целеви гени са концентрирани главно в генното семейство MAPK и генното семейство на протеин фосфатаза. Освен това, множество диференциално експресирани miPHK, като нови _102. Шест DE miRNA, включително ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p,ssc-miR-7137-3p и ssc-miR{{ 25}}, са ко-експресирани в екзозомна функция, вирусна инвазия на PRRSV и имуно-свързани пътища, както е показано на фигура 7. Подробностите са показани в допълнителна таблица S5.
Фигура 7. DE miPHK, свързани с усвояването на екзозоми, PRRSV инвазия и имунитет
3.8. QRT-PCR анализ на DE miRNA между двете групи
Пет DE miRNA бяха избрани на случаен принцип за проверка. Според резултатите от qRT-PCR, експресията на ssc-miR-19a и ssc-miR-32 се повишава в групата на лечение, докато ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} и ssc-miR-34c показаха по-висока експресия в контролната група, в съответствие с данните за секвениране (Фигура 8).
Фигура 8. Пет DE miPHK, валидирани чрез qRT-PCR
4. Дискусия
PRRSV все още е упорит патоген в глобалната свиневъдна индустрия, причинявайки огромни икономически загуби в света. Понастоящем ваксинацията се използва главно за предотвратяване и контрол на PRRSV, сред които модифицираната жива (MLV) вирусна ваксина е най-широко използваната [48]. Въпреки че тази ваксина беше ефективна за намаляване на огнищата и честотата на PRRS, тя също така увеличи значително генетичната вариация и разнообразието на вируса и доведе до вирусна рекомбинация между диви и живи ваксини вируси в полето [49,50]. През последните години разпространението и разпространението на рекомбинантния вирус NADC30-подобен на PRRSV щам причини множество огнища на репродуктивен и респираторен синдром при свинете в Китай. Сходството между CHsx1401 и NADC30, използвани в това проучване, остава на 92,2–99,1%. Оттогава се превърна в епидемичен щам в Китай. Екзозомите, като медиатори на клетъчната комуникация, се срещат широко в различни телесни течности и имат уникални предимства при диагностициране и лечение на заболявания [51,52]. Според предишни доклади екзозомите играят важна комуникационна роля в представянето на антиген [53], имунен отговор [53,54], репликация на вируса [54], рак [55], невродегенеративни заболявания [56], ангиогенеза [57], туморни клетки миграция [58] и инвазия [59] и имат висока изследователска стойност.
В това проучване е използвана технология за секвениране с висока производителност за конструиране на профила на експресия на miPHK на серумни екзозоми и са идентифицирани 33 DE miPHK. Както всички знаем, кодираната от гостоприемника миРНК може да се свърже с вирусния геном и след това да регулира репликацията, синтеза и освобождаването на вируса, за да ограничи инфекцията и да повлияе на патологичния процес [15]. Изследвания на miPHK, насочени към вирусния геном, също са докладвани многократно при животни. gga-miR-454 и gga-miR-130b при инфекциозна бурсална болест на пилетата могат да се насочат към вирусния геном, за да инхибират вирусната репликация, докато gga-miR-21 директно се насочва към вирусния протеин VP1, за да инхибира транслация на вирусен протеин [60,61]. В проучванията на PRRSV, ssc-miR-181 се свързва специфично към силно консервативна област надолу по веригата на вирусния геном ORF4 и силно инхибира репликацията на PRRSV [62]. В това проучване разликата в експресията на ssc-miR-181 между двете групи не достигна значително ниво. В нашето изследване геномите на девет различни PRRSV вируса бяха сравнени с тези на щама CHsx1401 и бяха идентифицирани осемте най-запазени сегмента. Беше предсказано, че 31 DE miPHK могат да се свържат с 8-те най-запазени сегмента на CHsx1401, а 16 DE miPHK могат да се свържат със запазените последователности, близки до 30 UTR на CHsx1401. Сред тях 5 DE miRNA (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 и ssc-miR{{ 36}}) могат едновременно да се свържат към CHsx1401 30 UTR. В допълнение, предсказано е, че повишената експресия на ssc-miR-223 се свързва с 30 UTR мишена на PRRSV генома. Резултатите показват, че запазените последователности на генома на вируса могат да играят ключова роля в неговата патогенност и miPHK, които могат да се свържат със запазените последователности между геномите на различни щамове на PRRSV, могат да имат важно значение за контролиране на патогенността на вируса. Някои диференциално експресирани miRNAs са доказали, че са свързани с PRRSV от предишни проучвания и дори са пряко включени в регулацията на PRRSV, включително ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], нека-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] и ssc-miR{{57 }}a [67].
PRRSV може да избегне защитата на гостоприемника чрез намеса във вродения имунен отговор. Този процес се регулира от много сигнални пътища, включително MAPK сигнален път, PI3K Akt сигнален път, автофагия, хемокин и TNF сигнален път. Понастоящем сигналният път на MAPK включва три основни пътя: ERK1/2, JNK и p38 път. Активирането на MAPK каскадата може да насърчи апоптозата на клетката гостоприемник, да помогне на вируса да избяга от отговора на имунната защита на гостоприемника и да насърчи репликацията на PRRSV [68]. Освен това, активирането на c-Jun N-терминални кинази (JNKs) и p38 може също да стимулира освобождаването на възпалителния фактор IL-10 [68–70] и да засили възпалителния ефект. В допълнение към индуцирането на апоптоза, PRRSV може също да индуцира аутофагия, която може да насърчи репликацията на PRRSV. Активирането на PI3K/Akt е необходимо за навлизане на вируса и насърчаване на репликацията на вируса, а активираният от PRRSV Akt инхибира апоптозата на клетката гостоприемник чрез отрицателно регулиране на JNK пътя [71]. TNF може да играе важна роля в индуцирането и регулирането на възпалителния отговор заедно с други възпалителни фактори, но експресията на TNF се влияе от отрицателната регулация на репликацията на PRRSV [72]. В настоящото изследване miPHK (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p и др.), обогатени с тези пътища, участват в индуцирана от PRRSV апоптоза, аутофагия и възпаление и са тясно свързани с вирусния имунен отговор, избягване на имунитета и репликация.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Клетъчната плазмена мембрана е богата на различни липидни салове, а богатите на сфинголипиди и холестерол сфинголипиди (сфингомиелин и гликосфинголипиди) са ключови молекули на липидните салове. Разпознаването на липидите от някои протеини на вируса може да бъде необходимо условие за навлизането на вируса [73]. Обвивните вируси вмъкват гликопротеини от вирусната обвивка в липидните салове на етапа на навлизане на вируса, взаимодействат с рецептори, разположени в липидните салове, или преминават от естественото си състояние към активирана форма, за да инициират или насърчат вирусна интернализация/сливане, като HSV, SARS коронавирус и вирус на епидемична диария при прасенца [73,74]. Предишни проучвания установиха, че отстраняването на холестерола от повърхността на MARC-145 клетки значително намалява PRRSV инфекцията, демонстрирайки, че инхибирането на PRRSV инфекцията е специфично медиирано от отстраняването на клетъчния холестерол. Изчерпването на холестерола в клетъчната мембрана значително инхибира навлизането на вируса, особено прикрепването и освобождаването на вируса [75]. Сфинголипидният метаболизъм може да регулира структурата и адхезията на мембраната, което е от голямо значение при инвазията на вируса на PRRSV. Ендоцитозата беше най-значимото обогатяване в това проучване. Ендоцитозата е важен механизъм за усвояване на екзозоми от целевите клетки. Предишни проучвания показват, че поемането на екзозома е изискващ енергия и зависим от цитоскелета процес, което подчертава потенциалната роля на ендоцитозата в този процес [76]. Доказано е, че няколко пътя могат да медиират този процес, включително фагоцитоза, макропиноцитоза, клатрин и т.н. [77,78], което доведе до различни класификации и роли на ендоцитираните вещества. Обогатяването на диференциално експресирани екзозомални miRNAs в този път показва, че екзозомите играят важна роля в инфекцията с PRRSV и регулирането на транспорта и поемането на съдържанието в екзозомите може да доведе до патофизиологични промени в целевите клетки и органи.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
5. Изводи
Чрез идентифициране и биоинформатичен анализ на серумни екзозомални miPHK от инфектирани с PRRSV прасета, в това проучване бяха получени различни пътища, свързани с PRRSV и диференциално експресирани miPHK, като ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 и др., които играят потенциални функционални роли в PRRSV -индуциран имунен отговор, инвазия и усвояване на екзозоми. Освен това, тъй като една miRNA може да се насочи към множество гени и един ген също се регулира от множество miPHK, няколко miRNA изпълняват множество функции в горните пътища. Доказано е, че някои miPHK регулират инфекцията с PRRSV чрез действие върху ключови рецептори или директно насочване към вирусния геном, като ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a и т.н. Междувременно, настоящото проучване също прогнозира разнообразие от miPHK, които могат да се свързват с най-запазеният фрагмент от 30 UTR на генома на вируса CHX1401, включително ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } и ssc-miR-6529, които може да са важни за регулиране на вирусната патогенност.
Препратки
1. Снайдер, EJ; Кикерт, М.; Fang, Y. Артеривирусна молекулярна биология и патогенеза. J. Gen. Virol. 2013, 94 Pt 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]
2. Лу, Й.; Джан, Й.; Xiang, X.; Шарма, М.; Лиу, К.; Wei, J.; Шао, Д.; Li, B.; Тонг, Г.; Olszewski, MA; et al. Notch сигнализирането допринася за експресията на възпалителни цитокини, индуцирани от високопатогенна инфекция с вируса на репродуктивен и респираторен синдром на свинете (HP-PRRSV) в свински алвеоларни макрофаги. Dev. Comp. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]
3. Деа, С.; Сойер, Н.; Ален, Р.; Athanassious, R. Ултраструктурни характеристики и морфогенеза на вируса на репродуктивен и респираторен синдром на свинете, размножен в силно пермисивния MARC{1}} клетъчен клон. адв. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95–98. [PubMed]
4. Dokland, T. Структурната биология на PRRSV. Virus Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]
5. Джонсън, CR; Григс, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Нов структурен протеин във вируса на репродуктивен и респираторен синдром на свинете, кодиран от алтернативен ORF5, присъстващ във всички артериивируси. J. Gen. Virol. 2011, 92 Pt 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]
6. Лий, SC; Лий, С.; Йоо, GW; Choi, HW; Не, YH; Парк, CE; Шин, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Фенотипни и генотипни анализи на атенюиран вирусен щам на свински репродуктивен и респираторен синдром след серийни пасажи в култивирани свински алвеоларни макрофаги. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]
7. Зебровска, А.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Видлак, П.; Pietrowska, M. Метаболом на екзозоми: Фокус върху везикули, освободени от ракови клетки и присъстващи в човешки телесни течности. Вътр. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3461. [CrossRef]
8. Бебелман, депутат; Смит, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Биогенеза и функция на извънклетъчни везикули при рак. Pharmacol. Там. 2018, 188, 1–11. [CrossRef]
9. Заборовски, депутат; Балай, Л.; Breakefield, XO; Lai, CP Извънклетъчни везикули: Състав, биологично значение и методи на изследване. Bioscience 2015, 65, 783–797. [CrossRef]
10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Холандия, О.; Майер, С.; Roche, JR; Бърк, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. Циркулиращите екзозоми могат да идентифицират биомаркери за крави с риск от метаболитна дисфункция. Sci. Rep. 2019, 9, 13879. [CrossRef]
11. Джан, RC; Du, WQ; Джан, JY; Ю, SX; Lu, FZ; Динг, ХМ; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Лечение на мезенхимни стволови клетки за увреждане на периферните нерви: Наративен преглед. Невронна регенерация. Рез. 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]
12. Бризгунова, О.Е.; Зарипов, М.М.; Скворцова, Т.Е.; Лехнов, Е.А.; Григорьева, А.Е.; Запорожченко, И.А.; Morozkin, ES; Рябчикова, Е.И.; Юрченко, Ю.Б.; Voitsitskiy, VE; et al. Сравнително изследване на извънклетъчни везикули от урината на здрави индивиди и пациенти с рак на простатата. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]
13. Камуси, Г.; Дерегибус, MC; Бруно, С.; Grange, C.; Фонсато, В.; Tetta, C. Епигенетично препрограмиране на клетки, медиирано от екзозома / микровезикули. Am. J. Cancer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]
14. Тамкович, С. Н.; Тутанов, О.С.; Лактионов, П. П. Екзозоми: Генериране, структура, транспорт, биологична активност и диагностично приложение. Biochem. Mosc. Доп. сер. Член. Cell Biol. 2016, 10, 163–173. [CrossRef]
15. Bartel, DP МикроРНК: геномика, биогенеза, механизъм и функция. Cell 2004, 116, 281–297. [CrossRef]
16. Гордино, Г.; Коста-Перейра, С.; Corredeira, P.; Алвес, П.; Коста, Л.; Гомес, AQ; Силва-Сантос, Б.; Ribot, JC MicroRNA-181a ограничава човешката δ Т клетъчна диференциация чрез насочване към Map3k2 и Notch2. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [CrossRef]
17. Лю, Б.; Ян, Л.; Chi, Y.; Sun, Y.; Yang, X. Дългата некодираща РНК AFAP1-AS1 улеснява прогресирането на рак на яйчниците чрез регулиране на оста miR-107/PDK4. J. Ovarian Res. 2021, 14, 60. [CrossRef]
18. Ким, Й.; Лий, DH; Парк, SH; Jeon, TI; Jung, CH Взаимодействието на микроРНК и транскрипционни фактори в регулирането на аутофагията при неалкохолна мастна чернодробна болест. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548–559. [CrossRef]
19. Казмерчак, Д.; Йопек, К.; Стержинска, К.; Новицки, М.; Ручински, М.; Januchowski, R. Профилът на експресията на микроРНК и потенциалната роля в регулирането на резистентни към лекарства гени в резистентни на цисплатин и паклитаксел клетъчни линии на рак на яйчниците. Вътр. J. Mol. Sci. 2022, 23, 526. [CrossRef]
20. Гонг, Й.; Вей, X.; Sun, W.; Рен, X.; Чен, Дж.; Aweya, JJ; Ма, Х.; Chan, KG; Джан, Й.; Li, S. Exosomal miR-224 допринася за хомеостазата на хемолимфната микробиота по време на бактериална инфекция при ракообразни. PLoS Pathog. 2021, 17, e1009837. [CrossRef]
21. Cheng, Y.; Коу, В.; Жу, Д.; Ю, X.; Zhu, Y. Бъдещи насоки в диагностиката, прогнозата и мониторинга на заболяването на адренокортикален карцином: Нови неинвазивни биомаркери. Преден. Ендокринол. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]
22. Гало, А.; Тандон, М.; Алевизос, И.; Illei, GG По-голямата част от микроРНК, откриваеми в серума и слюнката, са концентрирани в екзозоми. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]
23. Фан, Б.; Чоп, М.; Zhang, ZG; Liu, XS Нововъзникващи роли на микроРНК като биомаркери и терапевтични цели за диабетна невропатия. Преден. неврол. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]
24. Уей, Х.; Чен, Q.; Лин, Л.; Sha, C.; Ли, Т.; Liu, Y.; Ин, X.; Xu, Y.; Чен, Л.; Гао, В.; et al. Регулиране на производството на екзозоми и сортиране на товари. Вътр. J. Biol. Sci. 2021, 17, 163–177. [CrossRef]
25. Джия, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Янг, Х.; Liu, W. Cellular microRNA miR-26a потиска репликацията на вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете чрез активиране на вродения антивирусен имунитет. Sci. Rep. 2015, 5, 10651. [CrossRef]
26. Ли, Л.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Ю, Л.; Zheng, H.; Тонг, В.; Янг, С.; Zheng, H.; Шан, Т.; et al. miR-26a на гостоприемника потиска репликацията на вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете чрез регулиране на интерферони тип I. Virus Res. 2015, 195, 86–94. [CrossRef]
27. Лиу, Ф.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Джан, К.; Feng, WH MicroRNA-30c е насочена към бета веригата на рецептора на интерферон-алфа/бета за насърчаване на инфекция тип 2 с PRRSV. J. Gen. Virol. 2018, 99, 1671–1680. [CrossRef]
28. Джан, К.; Huang, C.; Янг, Q.; Гао, Л.; Liu, HC; Танг, Дж.; Feng, WH MicroRNA-30c модулира отговорите на тип I IFN, за да улесни инфекцията с вируса на репродуктивния и респираторен синдром при свинете чрез насочване към JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [CrossRef]
29. Уанг, Д.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Чен, Q.; Луо, Р.; Чен, Х.; Ли, К.; Xiao, S. MiR-125b намалява репликацията на вируса на репродуктивния и респираторен синдром при свинете чрез отрицателно регулиране на NF-κB пътя. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [CrossRef]
30. Джан, К.; Гуо, XK; Гао, Л.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; Feng, WH MicroRNA-23 инхибира репликацията на PRRSV чрез директно насочване към PRRSV РНК и вероятно чрез регулиране на интерферони тип I. Вирусология 2014, 450–451, 182–195. [CrossRef]
31. Ву, Дж.; Peng, X.; Джоу, А.; Qiao, М.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Джън, X.; Джан, С.; Mei, S. MiR-506 инхибира репликацията на PRRSV в MARC-145 клетки чрез CD151. Mol. клетка. Biochem. 2014, 394, 275–281. [CrossRef]
32. Гао, Л.; Гуо, XK; Wang, L.; Джан, К.; Li, N.; Чен, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 потиска инфекцията с вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете (PRRSV) чрез насочване към PRRSV рецептор CD163. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [CrossRef]
33. Сяо, С.; Ду, Т.; Уанг, X.; NIH.; Ян, Й.; Li, N.; Zhang, C.; Джан, А.; Гао, J.; Liu, H.; et al. MiR-22 насърчава репликацията на вируса на репродуктивния и респираторен синдром при свинете чрез насочване към фактора гостоприемник HO-1. ветеринарен лекар Microbiol. 2016, 192, 226–230. [CrossRef]
34. Сяо, С.; Уанг, X.; NIH.; Li, N.; Джан, А.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Гао, J.; Zhao, Q.; et al. МикроРНК miR-24-3p насърчава репликацията на вируса на репродуктивния и респираторен синдром при свинете чрез потискане на експресията на хемоксигеназа-1. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [CrossRef]
35. Бътлър, JE; Синкора, М.; Wang, G.; Степанова, К.; Li, Y.; Cai, X. Смущението в развитието на тимоцитите е в основата на пандемията от PRRS: тествана хипотеза. Преден. Immunol. 2019, 10, 1077. [CrossRef]
36. Джоу, Л.; Wang, Z.; Динг, Й.; Степанова, К.; Li, Y.; Cai, X. NADC30-подобен щам на вирус на репродуктивен и респираторен синдром на свинете, Китай. Emerg. заразявам. дис. 2015, 21, 2256–2257. [CrossRef]
37. Джоу, Л.; Янг, Б.; Xu, L.; Джин, Х.; Ge, X.; Гуо, X.; Han, J.; Yang, H. Оценка на ефикасността на три модифицирани живи вирусни ваксини срещу щам на вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете, подобен на NADC30-. ветеринарен лекар Microbiol. 2017, 207, 108–116. [CrossRef]
38. Уонг, Н.; Wang, X. miRDB: Онлайн ресурс за предсказване на целта на микроРНК и функционални анотации. Nucleic Acids Res. 2015, 43, D146–D152. [CrossRef]
39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Чен, В.; Rajewsky, N. miRDeep2 точно идентифицира известни и стотици нови микроРНК гени в седем животински класа. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 37–52. [CrossRef]
40. Уен, М.; Шен, Й.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: Интегративна платформа за еволюционен анализ на микроРНК за експерименти за секвениране от следващо поколение. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [CrossRef]
41. Андерс, С.; Huber, W. Анализ на диференциалния израз за данни за броя на последователностите. Genome Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]
42. Тамура, К.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Анализ на молекулярната еволюционна генетика версия 11. Mol. Biol. Еволюция 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]
43. Hubisz, MJ; Полард, Канзас; Siepel, A. PHAST и RPHAST: Филогенетичен анализ с модели пространство/време. Накратко. Биоинформ. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]
44. Крюгер, Й.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: лесно, бързо и гъвкаво предсказване на целите на микроРНК. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W451–W454. [CrossRef]
45. Ю, Г.; Wang, LG; Хан, Й.; Той, QY clusterProfiler: R пакет за сравняване на биологични теми между генни клъстери. OMICS 2012, 16, 284–287. [CrossRef]
46. Que, R.; Динг, Г.; Чен, Дж.; Cao, L. Анализ на серумни екзозомални микроРНК и клинико-патологични характеристики на пациенти с аденокарцином на панкреаса. World J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [CrossRef]
47. Théry, C.; Witwer, KW; Айкава, Е.; Алкараз, MJ; Андерсън, JD; Andriantsitohaina, R.; Антониу, А.; Араб, Т.; Арчър, Ф.; Atkin-Smith, GK; et al. Минимална информация за изследвания на извънклетъчни везикули 2018 (MISEV2018): Декларация за позицията на Международното дружество за извънклетъчни везикули и актуализация на указанията на MISEV2014. J. Extracell. Везикули 2018, 7, 1535750. [CrossRef]
48. Lyoo, K.-S.; Чой, JY; Хан, TW; Парк, КТ; Kim, HK Ефект от ваксинацията с модифицирана жива ваксина срещу репродуктивен и респираторен синдром на свинете върху производителността на растеж при прасета за угояване при полеви условия. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533–1536. [CrossRef]
49. Биан, Т.; Sun, Y.; Хао, М.; Джоу, Л.; Ge, X.; Гуо, X.; Han, J.; Yang, H. Рекомбинантен тип 2 вирус на свински репродуктивен и респираторен синдром между NADC30-подобен и MLV-подобен: Генетична характеристика и патогенност за прасенца. заразявам. Женет. Еволюция 2017, 54, 279–286. [CrossRef]
50. Ли, Й.; Ji, G.; Wang, J.; Тан, Ф.; Zhuang, J.; Ли, X.; Tian, K. Пълна геномна последователност на NADC30-като вирус на репродуктивен и респираторен синдром при свинете, характеризиращ се с рекомбинация с други щамове. Обявяване на генома. 2016, 4, e00330-16. [CrossRef]
51. Калури, Р.; Lebleu, VS Биологията, функцията и биомедицинските приложения на екзозомите. Наука 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]
52. Miao, XY Последните постижения в разбирането на ролята на miPHK в екзозомите и техния терапевтичен потенциал. J. Integr. Agric. 2017, 16, 753–761. [CrossRef]
53. Шенода, BB; Ajit, SK Модулиране на имунните отговори чрез екзозоми, получени от антиген-представящи клетки. Clin. Med. Прозрения Pathol. 2016, 9 (Допълнение S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]
54. Ли, С.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Екзозомите модулират вирусната репликация и имунните отговори на гостоприемника при HBV инфекция. BioMed Res. Вътр. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]
55. Озеленяване, DW; Гопал, SK; Xu, R.; Симпсън, RJ; Chen, W. Екзозоми и тяхната роля в имунната регулация и рака. В семинари по клетъчна и биология на развитието; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2015; Том 40, стр. 72–81.
56. Хауит, Дж.; Hill, AF Екзозоми в патологията на невродегенеративните заболявания. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [CrossRef]
57. Рибейро, МФ; Zhu, H.; Милард, RW; Fan, G. Екзозомите функционират в про- и анти-ангиогенезата. Curr. Ангиогенеза 2013, 2, 54–59. [CrossRef]
58. Lan, J.; Сън, Л.; Xu, F.; Лиу, Л.; Hu, F.; Песен, Д.; Hou, Z.; Wu, W.; Луо, X.; Wang, J.; et al. Екзозомите, получени от макрофаги M2, насърчават клетъчната миграция и инвазия при рак на дебелото черво. Cancer Res. 2019, 79, 146–158. [CrossRef]
59. Ага, М.; Бенц, GL; Рафа, С.; Torrisi, MR; Кондо, С.; Вакисака, Н.; Йошизаки, Т.; Пагано, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 поддържа инвазивен потенциал на LMP1-положителни екзозоми, свързани с назофарингеален карцином. Oncogene 2014, 33, 4613–4622. [CrossRef]
60. Фу, М.; Wang, B.; Чен, X.; Той, З.; Wang, Y.; Ли, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 потиска репликацията на вируса на инфекциозна бурсална болест (IBDV) чрез директно насочване към геномния сегмент B на IBDV и клетъчните супресори на цитокиново сигнализиране 6 (SOCS6). Virus Res. 2018, 252, 29–40. [CrossRef]
61. Фу, М.; Wang, B.; Чен, X.; Той, З.; Wang, Y.; Ли, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b потиска репликацията на вируса на инфекциозна бурсална болест чрез насочване към вирусния геном и клетъчните супресори на цитокиновото сигнализиране 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [CrossRef]
62. Гуо, XK; Джан, К.; Гао, Л.; Li, N.; Чен, XX; Feng, WH Повишаването на експресията на микроРНК 181 инхибира репликацията на вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете и има значение за контролиране на вирусната инфекция. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]
63. Конг, П.; Xiao, S.; Чен, Й.; Wang, L.; Гао, J.; Ли, М.; Той, З.; Guo, Y.; Zhao, G.; Джан, X.; et al. Интегрирани miRNA и mRNA транскриптоми на свински алвеоларни макрофаги (PAM клетки) идентифицират специфични за щама miPHK молекулярни подписи, свързани с H-PRRSV и N-PRRSV инфекция. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]
64. Ли, Н.; Хуанг, К.; Чен, Й.; Хуанг, З.; Джан, Й.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a проявява антивирусна активност срещу вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете чрез потискане на гените на гостоприемника CD163. ветеринарен лекар Microbiol. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]
65. Ли, Н.; Ду, Т.; Ян, Й.; Джан, А.; Гао, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA let-7f-5p инхибира вируса на репродуктивния и респираторен синдром при свинете чрез насочване към MYH9. Sci. Rep. 2016, 6, 34332. [CrossRef]
66. Жен, Й.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Гао, Г.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Джан, К.; Liu, B. Идентифициране на диференциално експресирана некодираща РНК в свински алвеоларни макрофаги от Tongcheng и големи бели прасета, отговорили на PRRSV. Sci. Rep. 2018, 8, 15621. [CrossRef]
67. Джоу, X.; Михал, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. Профилиране на експресията на MicroRNA в алвеоларни макрофаги на местни китайски свине Tongcheng, заразени с PRRSV in vivo. J. Appl. Женет. 2017, 58, 539–544. [CrossRef]
68. Лий, YJ; Lee, C. Репликацията на вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете се потиска чрез инхибиране на извънклетъчния сигнал-регулиран киназен път (ERK). Virus Res. 2010, 152, 50–58. [CrossRef]
69. Песен, С.; Bi, J.; Уанг, Д.; Fang, L.; Джан, Л.; Li, F.; Чен, Х.; Xiao, S. Инфекцията с вируса на репродуктивния и респираторен синдром на свинете активира производството на IL-10 чрез NF-κB и p38 MAPK пътища в свински алвеоларни макрофаги. Dev. Comp. Immunol. 2013, 39, 265–272. [CrossRef]
70. Ин, С.; Huo, Y.; Dong, Y.; Фан, Л.; Янг, Х.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. Активирането на c-Jun NH (2)-терминална киназа е необходимо за индуцирана от вируса апоптоза на репродуктивен и респираторен синдром на свинете, но не и за репликация на вируса. Virus Res. 2012, 166, 103–108. [CrossRef]
71. Fan, L. Сигнални пътища, участващи в регулирането на индукцията на апоптоза в клетките гостоприемници при инфекция с PRRSV. Вирусни гени 2019, 55, 433–439. [CrossRef]
72. Лопес-Фуертес, Л.; Кампос, Е.; Доменек, Н.; Ezquerra, A.; Кастро, JM; Домингес, Дж.; Alonso, F. Вирусът на репродуктивния и респираторен синдром на свинете (PRRS) намалява производството на TNF в инфектирани макрофаги. Virus Res. 2000, 69, 41–46. [CrossRef]
73. Teissier, É.; Pécheur, EI Липиди като модулатори на мембранно сливане, медиирано от вирусни слети протеини. Евро. Biophys. J. 2007, 36, 887–899. [CrossRef]
74. Jeon, JH; Lee, C. Клетъчният холестерол е необходим за инфекция с нидовирус по свинете. арх. Virol. 2017, 162, 3753–3767. [CrossRef]
75. Сън, Й.; Xiao, S.; Уанг, Д.; Луо, Р.; Li, B.; Чен, Х.; Fang, L. Холестеролът на клетъчната мембрана е необходим за навлизането на вируса на репродуктивния и респираторния синдром на свинете и освобождаването му в MARC{1}} клетки. Sci. China Life Sci. 2011, 54, 1011–1018. [CrossRef]
76. Тиан, Т.; Zhu, YL; Джоу, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Поглъщане на екзозома чрез клатрин-медиирана ендоцитоза и макропиноцитоза и медииране на доставката на miR-21. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [CrossRef]
77. Мълкахи, Луизиана; Розово, RC; Carter, DRF Пътища и механизми на поемане на извънклетъчни везикули. J. Extracell. Vesicles 2014, 3, 24641. [CrossRef]
78. Джан, М.; Занг, X.; Уанг, М.; Li, Z.; Qiao, М.; Hu, H.; Chen, D. Базирани на екзозоми наноносители като био-вдъхновени и гъвкави средства за доставка на лекарства: Последни постижения и предизвикателства. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [CrossRef]
