Насочването към катепсин B чрез циклоастрагенол повишава антитуморния имунитет на CD8 Т клетките чрез инхибиране на разграждането на MHC-I, част 1

АБСТРАКТ

Заден планЗагубата на туморни антигени и изчерпването на CD8 Т клетките, причинени от пътя на PD-1/PD-L1, са важни фактори за избягване на имунната система на тумора. През последните години се увеличават изследванията върху традиционната китайска медицина при лечението на тумори. Установено е, че циклоастрагенолът (CAG), ефективна активна молекула в Astragalus membranaceus, има антивирусни, против стареене, противовъзпалителни и други функции. Неговият антитуморен ефект и механизъм обаче не са ясни.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да пречиства DPPH свободните радикали и има способността да пречиства реактивните кислородни видове и да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена, а също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на анионите от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху плюсовете и минусите на cistanche

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

МетодиАнтитуморният ефект на CAG е изследван в MC38 и CT26 миши трансплантирани туморни модели. Антитуморният ефект на CAG беше допълнително анализиран чрез едноклетъчно мултиомично секвениране. Технологията за профилиране на достъпност, реагираща на целта, беше използвана за намиране на целевия протеин на CAG. Впоследствие антитуморният механизъм на CAG беше изследван с помощта на конфокална микроскопия, имунопреципитация и трансфекция на мутантни плазмиди. Накрая беше изследван комбинираният антитуморен ефект на CAG и PD-1 антитела при мишки или органоиди.

РезултатиОткрихме, че CAG ефективно инхибира туморния растеж in vivo. Нашият едноклетъчен мулти-омичен атлас демонстрира, че CAG насърчава представянето на антигени на туморна клетъчна повърхност и се характеризира с повишената функция на убиване на CD8 плюс Т клетки. Механично, CAG се свързва със своя целеви протеин катепсин В, който след това инхибира лизозомното разграждане на основния комплекс на хистосъвместимост I (MHC-I) и насърчава агрегата n на MHC-I към клетъчната мембрана, повишавайки предварителната станция на туморния антиген . Междувременно, комбинацията от CAG с PD-1 антитяло ефективно усилва унищожаващите тумор CD8 плюс Т клетки в ксенотрансплантирани мишки и органоиди на колоректален рак. Заключение Нашите данни съобщават за първи път, че регулирането на катепсин В надолу осигурява антитуморен имунитет и действа на антитуморния механизъм на естествения продукт CAG.

ВЪВЕДЕНИЕ

Колоректалният рак е един от най-често срещаните ракови заболявания в света. Неговата честота и смъртност се нареждат сред първите три, сериозно застрашаващи човешкия живот и здраве.1 Обичайните методи на лечение включват хирургична химиотерапия и лъчетерапия, таргетни лекарства и имунотерапия.2-4 Раковите клетки обаче обикновено показват загуба на повърхностни антигени и експресия високи нива на инхибиращи молекули, за да избягат от наблюдението на имунните клетки. Ето защо, за да решат проблема с имунното бягство на тумора, изследователите са разработили инхибитори на имунната контролна точка и неоантигенна терапия, за да блокират маскирането на раковите клетки към имунните клетки.5–8 Въпреки че инхибиторите на имунната контролна точка могат да възстановят изчерпаните имунни клетки, повърхностният антиген на рака клетки не е подобрен значително. Следователно е особено важно да се намерят лекарства, които могат да насърчат представянето на туморни повърхностни антигени. Разпознаването на ракови клетки от цитотоксични CD8 плюс Т клетки зависи от пътя на TCR/CD3/основния комплекс на хистосъвместимост (MHC-I). TCR получава антигена, присъстващ от мембранния протеин на дендритната клетка/ракова клетка CI и предава сигнала за плътно свързване на CD3, който след това се простира по-дълбоко в цитоплазмата.9 10 В същото време, с активирането на сигнала CD28/B7 , CD8 плюс Т клетките могат да бъдат коактивирани, за да разпознаят и убият раковите клетки.11 Последните проучвания установиха, че в процеса на прогресия на тумора лизозомите водят до намаляване на агрегацията на MHC-I на повърхността на раковите клетки, което не е ефективно присъстващи антигени.12 13 Liu et al съобщават, че инхибирането на PCSK9 може да предотврати разграждането на MHC-I в лизозомите и да позволи на MHC-I да се върне към клетъчната мембрана, за да представи антигени.12 Следователно възстановяването на антиген-представящата функция на MHC-I е особено важно за блокиране на имунното бягство на тумора.

Все по-голям брой проучвания установяват, че приложението на активни молекули на традиционната китайска медицина за противотуморна интервенция има големи перспективи.{0}} Циклоастрагенолът (CAG) е ефективна активна молекула за Astragalus membranaceus, която има антивирусно, антибактериално, анти- възпалителни и други фармакологични ефекти, но неговият антитуморен ефект рядко се съобщава.16–19 В това проучване открихме, че CAG инхибира растежа на транснирани тумори на тумори на рак на дебелото черво. Механизмът включва главно инхибиране на разграждането на MHC-I, медиирано от катепсин В (CTSB), насърчаване на антигенното представяне на раковите клетки и след това повишаване на способността за убиване на CD8 плюс Т клетки.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Антитела и реагенти

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 процента). Антитела на CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), актин (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Тубулин (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ) и Комплект за имунохистохимия за откриване срещу мишка/заек (Cat#PK10006) са закупени от Proteintech. Антитела на H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), и CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) са закупени от Santa Cruz Biotechnology. Антитяло на Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142 ) е закупено от Cell Signaling Technology. Антитяло на Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) е закупено от Abcam. Антитела с поточна цитометрия на CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) и CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) са закупени от BD Bioscience. Антитяло за поточна цитометрия на Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) беше закупено от BioLegend. Антитела с поточна цитометрия на NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) и IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) са закупени от Thermo Fisher Scientific. DMEM среда (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122) и фетален говежди серум (Cat#C04001-500) бяха закупени от Biological Industries. Кози серум (Cat#88RNG001) и Pierce BCA комплект за анализ на протеини (Cat#23225) са закупени от Thermo Fisher Scientific. Антителата на античовешки PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) и анти-миши PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) са закупени от Bio X cell. Комплект за дисоциация на туморни тъкани MACS (Cat#130-095-929) е закупен от Miltenyi Biotec.

Клетъчна култура

Клетъчните линии на миши рак на дебелото черво MC38 и CT26 бяха поддържани в нашата лаборатория.20 Човешките линии на рак на дебелото черво HCT-116 бяха получени от Колекцията за типови култури на Китайската академия на науките (Шанхай, Китай). Клетките MC38, CT26 и HCT-116 се култивират в среда DMEM, съдържаща 10 процента фетален говежди серум и 1 процент пеницилин/стрептомицин при 37 градуса в 5 процента CO2 инкубатор.

Експеримент с трансплантационен тумор

Шест-осемседмични женски C57BL/6JGpt мишки, BALB/c мишки и BALB/,c голи мишки бяха закупени от GemPharmatech (Nanjing, Китай). MC38 или CT26 ракови клетки (1 × 106) се инокулират подкожно във всяка мишка. Когато туморът нарасне до 100 mm3, микрофонът се разделя произволно на група с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) (напр. веднъж на ден) и CAG група (напр. 50 mg/kg веднъж на ден). Обемът на тумора се определя чрез измерване с дебеломер, като се използва формулата V=дължина × ширина2 /2. Когато обемът на тумора на мишките от PBS групата достигна 1000 mm3, туморът на мишките беше изваден, фотографиран и претеглен.

Едноклетъчна дисоциация от мишка за едноклетъчна РНК/ATACseq

Твърди тумори от мишки се усвояват с помощта на Tumor Dissociation Kit, за да се получат едноклетъчни едноклетъчни. Единична клетка Едноклетъчни с концентрация от 1000 клетки/1000 клетки, заредени на 10×genomics chromium контролер едноклетъчни единични клетки, следвайки протокола на производителя 10×genomics. Реагенти за обратна транскрипция, баркодирани гелни зърна и разпределително масло бяха смесени с клетките за генериране на гелни зърна в емулсии (GEM) за обратна транскрипция. scRNA-seq предварителна обработка на данни и qua y контрол.

Въз основа на миши референтен геном GRCm38 (mm10), конвейерът CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) за обработка на едноклетъчна РНК данни за последователност за всеки експеримент (GSE197229). Матриците за цифрова генна експресия бяха zed в R (V.4.0.4) с помощта на пакета Seurat (V.4.0.0).21 Преди dBeforem анализ, клетките бяха филтрирани по UMI номер (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq предварителна обработка на данни и контрол на качеството

Данните за единична клетка ATAC-seq (GSE197229) бяха предварително обработени от cell ranger-at (V.2.0.0) с командния ред за преброяване. За последващата обработка и анализ на данни scATAC-seq използвахме пакета ArchR (V.1.{0.1).24 След това използвахме функцията addArchRGethe nome ('mm10') за анотация на генома и създадохме arrow файл с функцията cre ArrowFiles с параметрите по подразбиране. След това използвахме функцията filterDoublets, за да изтрием потенциалните дублети и създадохме проект ArchR, използвайки функцията ArchRProject с параметри по подразбиране. След това използвахме пакета Harmony, за да премахнем груповия ефект чрез функцията addHarmony.25 За намаляване на размерността използваме функцията addIterativeLSI в ArchR, за да работим с параметрите def t. За вграждане на една клетка избрахме намаления обект Dims с хармония и използвахме функцията addTSNE с параметъра „perplexity=30“ за визуализация.

Интегриран анализ на siRNA-seq и scATAC-seq данни

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. За да подобрим точността на прогнозите за по-добро интегриране на двата набора от данни, ние отново интегрирахме данните scATAC-seq и scRNA-seq, използвайки режима на „ограничена интеграция“. Накратко, ние анотирахме scATAC-seq данните с клетъчни типове въз основа на генните резултати на scATAC-seq. След това създадохме ограничен списък, така че сходството на генната експресия да се изчислява само в един и същ тип клетка както за scATAC-seq, така и за scRNA-seq. Неконтролираното групиране с t-SNE разкри 13 подклетъчни клъстера, които бяха анотирани с известни или предполагаеми маркери в онлайн допълнителна таблица 1.

Траектория на родословието на псевдовремето

Траекторията на клетъчната линия на раковите клетки беше изведена чрез използване на Monocle2 (V.2.18.0) R пакет.26 Моноцитите научават изричната главна графика от геномни данни за една клетка чрез вграждане на обърната графика, за да сортират клетките, като по този начин решават сложни биологични процеси стабилно и точно.27 Използвахме функцията ''differentialGeneTest'', за да извлечем DEG от всеки клъстер и след като конструирахме клетъчната траектория, открихме диференциално експресираните гени в псевдовремето. Всички гени, зависими от псевдовремето, бяха визуализирани от функцията за топлинна карта plot_pseudotime_, която взема обект CellDataSet. Графиките на траекторията на родословието и плавните експресионни криви, базирани на CellDataSet, бяха генерирани съответно от plot_cell_trajectory и plot_гени_в_псевдовреме.28

Извикване на вариация на номера на едноклетъчно копие

За идентифициране на злокачествени клетки с клонални широкомащабни вариации на броя на хромозомните копия (CNV), използвахме пакета inferCNV R, за да направим извод за генетичните профили на всяка клетка въз основа на средната експресия на големи набори гени във всяка хромозомна област на туморния геном в сравнение с нормални клетки.29 На базата на проба по проба, имунните клетки бяха използвани като референция за оценка на CNV в свързаните с рака клетки.

Анализ на обогатяване

Анализите на пътя на KEGG и анотациите на GO бяха извършени с помощта на R пакета clusterProfiler (V.3.11.1) с параметри на PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 и MaxGSSize=500.20Анализът на обогатяване на набор от гени (GSEA) беше приложен с помощта на 50 комплекта отличителни гени (h.all.V.7.4.symbols. gmt) за идентифициране на значително обогатени функционални пътища чрез софтуер GSEA (V.4.1.0), с критерии за скрининг на номинална P-стойност<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Количествен PCR анализ в реално време

Клетките MC38 и HCT-116 се посяват в плаки с шест ямки за 6 часа и след това се третират с CAG за още 24 часа. Клетките се промиват три пъти със студен PBS и се центрофугират при 180g за 5 минути при 4 градуса. В същото време, след смилане на туморната тъкан. Общата РНК се екстрахира от MC38, HCT-116 клетки и туморна тъкан, като се използва реагент TRIzol, съгласно инструкциите на производителя. Реакционният обем беше 20 µL, съдържащ: 1 µg РНК, 5 µL 5×Hiscript III qRT SuperMix и RNase Free dH2 O. cDNA беше подложена на количествена PCR с реакционен обем от 10 µL с 1 µL cDNA, 5 µL qPCR смес, 0,75 µL 5 µM праймери (Напред и назад) и 3.25 µL свободен от РНКаза dH2 O. Праймерите са синтезирани от GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Китай) съгласно следните последователности (онлайн допълнителна таблица 2).

Откриване на цели чрез подход за профилиране на достъпността, отговарящ на целта

Скринингът на CAG-свързващи протеини беше извършен, както е описано по-горе.31 32 Накратко, подходът за профилиране на достъпност, отговарящ на целта (TRAP), беше използван за откриване на свързващите протеини за CAG в клетъчната среда чрез наблюдение на индуцирания от ангажирането на лиганд лизин промени в достъпността на ниво протеом. Накратко, две блюда с клетки бяха третирани съответно с 10µM CAG и диметилсулфоксид (DMSO). След 1-часова инкубация, клетките се пермеабилизират с M-PER буфер (Thermo Scientific) и получените лизати се маркират ковалентно чрез добавяне на формалдехид и боран пиридинов комплекс, които заедно специфично маркират протеинови лизинови остатъци при стайна температура за профилиране на достъпността . След това лизатите се утаяват от органичен разтворител и събраните пелети се разтварят отново в 8 mol/L урея, редуцират се с дитиотреитол (DTT) при 56 градуса за 30 минути, последвано от алкилиране с използване на йодоацетамид (IAA) на тъмно за 30 минути. Отново се добавя подходящо количество DTT разтвор, за да реагира с излишък от IAA. Впоследствие протеомът се разрежда с разтвор на амониев бикарбонат, докато крайната концентрация на урея достигне 1 mol/L. Събраните разградени протеини бяха обезсолени на C18 HLB колони (Waters, Milford, Massachusetts, USA) и обогатените пептиди бяха изсушени и възстановени в 0,1 процента воден разтвор на мравчена киселина (FA). Системата AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) беше използвана за анализиране на пробите за количествено профилиране на промените в достъпността на лизин в отговор на свързването на CAG за откриване на целта. Придобиването на зависимост от данни в положителен режим беше използвано за получаване на данни. Анализът на данните беше извършен с помощта на PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Канада). По-конкретно, cys алкилирането беше избрано като фиксирана модификация, а окислението на метионин и диметилирането на лизин, постигнати чрез маркиране с TRAP, бяха определени като променливи модификации. Накратко, пептиди, които съдържат индуцирано от TRAP диметилиране и показват значителни промени в изобилието с и без инкубация на CAG, бяха определени като реагиращи на мишената пептиди. Съотношението на изобилието на всеки TRAP-белязан пептид показва степента на промяна на достъпността и е тясно свързана с афинитета на свързване на лиганда. Беше проведен t-тест на Student, за да се оцени дали откритите промени в достъпността на белязаните пептиди са статистически значими. Междугрупова p-стойност (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Органоидна култура

Човешките органоиди на колоректален рак са конструирани и култивирани от Chongqing Kingbiotech.33 Пробите от тъкани на пациенти, получени от хирургическата операция, са смлени на възможно най-малки парчета със стерилни ножици. Парчетата тъкан се смесват старателно с Matrigel (Corning, Cat #356231) при приблизително съотношение 1:4 върху лед. Последващата обработка се отнася до публикувани протоколи. Накратко, суспензиите на парчета-Matrigel се посяват бързо в многоямковата плака, за да се образуват полусферични капчици и се прехвърлят при 37 градуса за 15–20 минути, което позволява на капчиците да се втвърдят. Добавете подходящото количество културална среда (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​към всяка ямка и сменяйте средата на всеки 2–4 дни.

Изолиране и култура на човешки CD8 Т клетки

Добавете същия обем нормален физиологичен разтвор към периферната кръв на здрави хора, съдържащ антикоагуланти, за да разредите цялата кръв. Добавете определен обем разтвор за разделяне към 15 ml центрофужна епруветка, бавно добавете разредената цяла кръв по стената на епруветката до горната част на разтвора за разделяне и центрофугирайте при 750 g за 20 минути. След центрофугиране използвайте пипета, за да изсмучете внимателно моноцитите в средния бял слой в центрофужна епруветка от 15 ml, добавете определен обем PBS за ресуспендиране, центрофугирайте 250 g за 5 минути и изхвърлете супернатантата. След добавяне на човешки CD8 магнитни зърна към клетъчните преципитати, CD8 Т клетките бяха сортирани чрез LS колона за сортиране. CD8 Т клетки се добавят към перфорираната плоча, предварително покрита с 5 µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) антитяло и след това 10 ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) и 5 ​​µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) бяха добавени функционални антитела, култивирани за 24 часа.

Кокултура

След като органоидите бяха инкубирани с CAG в продължение на 24 часа, прясната културална среда беше заменена и след това органоидите и активираните CD8 Т клетки бяха суспендирани в матричния гел, след което суспензията беше добавена към шестямковата плака и поставена в 37 градуса инкубатор за 15 минути и след това се добавят 2 mL безсерумна пълна културална среда за 24 часа.

Уестърн петно

Клетките MC38 и HCT-116 се посяват в плаки с шест ямки за 6 часа и след това се третират с CAG за още 24 часа. Клетките се промиват три пъти със студен PBS и се центрофугират при 180 g за 5 минути при 4 градуса. Общият протеин се лизира с WB-IP лизис, съдържащ 1% протеазен инхибитор за 30 минути върху лед. Общият протеин беше оценен с помощта на комплект за количествено определяне на протеин BCA. Протеиновите проби се разделят чрез електрофореза с 10% -12% SDS полиакриламиден гел и се прехвърлят към PVDF (поливинилиден флуорид) мембрани при 350 mA за 90 минути. PVDF мембраните се блокират с 5 процента BSA за 1 час, лентите с посоченото първично антитяло за една нощ и с вторичното антитяло се инкубират за 90 минути при стайна температура. Накрая, лентите бяха открити с помощта на хемилуминесцентна субстратна система LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Мериленд, САЩ).

Поточна цитометрия

След смилането на туморната тъкан се приготвя суспензията от единични клетки. Повърхностното оцветяване се извършва с повърхностни антигенни антитела в FCM (поточна цитометрия) буфер (PBS, съдържащ 1% FBS) и се оцветява върху лед с подходящи антитела за 30 минути. Използвани са реактивни багрила (eBioscience) за елиминиране на мъртвите клетки. Оцветяването с вътреклетъчни цитокини се извършва с BD клетъчен фиксиращ разтвор/разтвор на екстрацелуларна мембрана и клетките се фиксират и проникват, след което се оцветяват с антитела срещу цитокини в Perm/Wash буфер (BD Biosciences).

Трансфектирани CTSB мутантни плазмиди

HCT-116 клетки се посяват в 6-ямкови плаки за 12 часа и след това се трансфектират с CTSB-WT-EGFP или CTSB мутантни плазмиди (Y75A, A77V и G198A) за 36 часа.

Интерференция на трансфекция или свръхекспресия на плазмид на CTSB в MC38 клетки или HCT-116 клетки

MC38 клетки (1 × 106 /ямка) се инокулират в 6-ямкови плаки за 6 часа, след това се трансфектират с CTSB интерферираща РНК (последователност: напред-GGACAUAGAUCUACCUGAATT и обратно-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) за 48 часа и нивата на експресия на иРНК или протеин на Ctsb и H2-k1 бяха открити. HCT-116 клетки (1×106 /ямка) се инокулират в 6-плаки с ямки за 6 часа, след това се трансфектират с CTSB интерференция (последователност: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) или свръхекспресионен плазмид за 48 часа и иРНК или бяха открити нива на протеинова експресия на CTSB и HLA-A.

Докинг технология

3D структурата на CTSB беше изтеглена от базата данни за протеини (PDB ID: 2iPP), а структурите на CAG бяха изтеглени от PubChem. Процесът на докинг беше извършен в Autodock 2 с грубо докинг с помощта на симулиран алгоритъм за отгряване и последващо усъвършенстване с помощта на генетичен алгоритъм.

Тест за клетъчно термично изместване

Клетките MC38 се посяват в 10cm плаки за една нощ и след това се третират с CAG или 0,1 процента DMSO за още 2 часа. Клетките се събират, промиват се със студен PBS и се центрофугират при 180 g за 5 минути. След това клетките се разделят равномерно в епруветки за центрофугиране (70 µL всяка епруветка) и се нагряват в продължение на 3 минути при следната температура: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 и 67 градуса, пробите се охлаждат в продължение на 3 минути при температури и след това се съхраняват върху лед. След това пробите бяха поставени в хладилник при -80 градуса за една нощ. Пробите се размразяват при стайна температура за 30 минути и след това се охлаждат при -80 градуса за 4 часа. Накрая, пробите се центрофугират при 12, 000g за 25 минути, супернатантът се добавя към зареждащия буфер и се анализира чрез Western blotting.

Имунохистохимично оцветяване

Парафиновите срезове от туморна тъкан се потапят в ксилен за 20 минути за депарафинизиране и след това в 100 процента, 75 процента и 50 процента етанол за 10 минути. След като срезовете бяха подложени на възстановяване на антиген с разтвор за възстановяване на антиген натриев цитрат, ендогенният водороден пероксид беше инактивиран с 3 процента водороден пероксид. След блокиране с 5 процента кози серум за 1 час се добавя анти-Ki67 антитялото (1:200) и се инкубира една нощ при 4 градуса. Беше добавен анти-миши/заешки HRP белязан полимер (100 µL) и пробите бяха инкубирани при 37 градуса за 30 минути, последвано от 100 µL работен разтвор на DAB и инкубиране при стайна температура за 5 минути. След 1 минута оцветяване с хематоксилин, пробите се промиват в 50 процента, 75 процента и 100 процента етанол и ксилен за 5 минути и се използва неутрална гума за запечатване на филма. Филмът е наблюдаван и заснет под микроскоп.

Статистическианализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуер GraphPad Prism (V.8.0). Всички резултати са изразени като средна стойност ± SEM от три независими експеримента. Еднопосочен анализ на дисперсията, последван от post hoc теста на Dunnett, беше използван за оценка на разликите, когато имаше повече от две групи. Използван е t-тестът на Student за оценка на значимата разлика между двете групи. Статистическата значимост беше зададена на p<0.05.

РЕЗУЛТАТИ

Едноклетъчен мултиомичен анализ на CAG, инхибиращ растежа на трансплантиран рак на дебелото черво при мишки

За да проучим дали CAG има антитуморен ефект, първо трансплантирахме MC38 ракови клетки в C57BL/6 мишки. Отбелязахме, че CAG значително инхибира растежа на тумори (онлайн допълнителна фигура S1A, B). Впоследствие трансплантирахме CT26 клетки в BALB/c мишки и открихме, че CAG също инхибира растежа на тумори (онлайн допълнителна фигура S1C, D).

За по-нататъшно разкриване на специфичния механизъм, чрез който CAG инхибира растежа на тумора, ние го анализирахме с помощта на техниките scRNA-seq и scATAC-seq (фигура 1А). Разделихме клетъчната популация на четири групи: ракови клетки, фибробласти, миелоидни клетки и лимфоцити (фигура 1B, онлайн допълнителна фигура S2A, B). Открихме, че раковите клетки (52 процента) и фибробластите (41 процента) са инфилтрирани главно в туморните тъкани, докато имунните клетки представляват само 7 процента. След това разделихме раковите клетки на осем подгрупи и фибробластите на три подгрупи (фигура 1C–E). Впоследствие анализът на обогатяването на силно експресирани гени във всяка клетъчна популация показа, че MHC-I молекулярните пътища в раковите клетки са обогатени, както и антитуморните сигнали на Т клетките и NK клетките (онлайн допълнителна фигура S2C). След това бяха открити и четири групи клетки с помощта на интеграционен анализ scATAC-seq и scRNA-seq (фигура 2D–G). След сравнението открихме, че ракови клетки (C01, C03 клетки), CD8 плюс Т клетки, Spp1 плюс TAM клетки и фибробласти (F01 и F02 клетки) се появяват в ATAC секвенирането (фигура 1F, G) и освен това силно изразени транскрипционните фактори са обогатени в тези клетки (фигура 1Н). Чрез тези анализи ние спекулираме, че инхибирането на туморния растеж от CAG е тясно свързано с промените в тези клетки.

Cag насърчава представянето на антиген на туморни клетки

За да анализираме антитуморния механизъм на CAG, първо анализирахме популацията на туморни клетки и разделихме раковите клетки на осем подгрупи (фигура 2A, B, онлайн допълнителна фигура S3A). Резултатите показват, че в сравнение с PBS групата, клетките от група C05 намаляват значително, докато клетките от група C07 се увеличават (фигура 2C). Междувременно, за да проверим точността на нашето групиране на туморни клетки, сравнихме CNV на лимфоцити и миелоидни клетки като референтни клетки. Резултатите показват, че CNV на раковите клетки е значително по-висок от този на имунните клетки (онлайн допълнителна фигура S3B). Когато анализирахме подгрупите от ракови клетки, открихме, че гените за отговор на интерферон Isg15, Irf7, Ifit3 и Ifi47 са силно експресирани в клетъчните популации C07 и C08 на CAG групата в сравнение с PBS групата (онлайн допълнителна фигура S3C). Анализът на популацията от туморни клетки установи, че пътищата, свързани с представянето на антигена, са значително обогатени в множество клетъчни популации. Следователно, ние спекулираме, че CAG може да насърчи антигенното представяне на раковите клетки, за да играе антитуморна роля (фигура 2D). След това избрахме гените, свързани с представянето на антигена, и открихме, че нивото на експресия в CAG групата е значително по-високо от това в PBS групата (фигура 2E, онлайн допълнителна фигура S3D). Открихме също, че CAG насърчава представянето на антиген в туморните тъкани (фигура 2F, G).

След това използвахме scATAC-seq, за да анализираме специфичните причини зад представянето на антиген на туморни клетки, насърчаващо CAG. Открихме, че популацията на туморни клетки силно експресира транскрипционните фактори Fos, Junb, Jund, Fosb и Fosl1 (фигура 2H, I). Впоследствие конструирахме карта на взаимодействието между транскрипционните фактори и съответните гени, за да обясним, че CAG насърчава експресията на свързани с туморни клетки антиген-представящи гени (фигура 2J). В туморните тъкани открихме също, че транскрипционните фактори Junb, Fos, Jund и Fosb са значително свръхекспресирани в PBS групата при лечение с CAG (фигура 2K–N, онлайн допълнителна фигура S3E-I). Досега сме открили, че CAG може да насърчи експресията на транскрипционни фактори на гени, свързани с представяне на антиген, като по този начин повишава антиген-представящата функция на раковите клетки. Въпреки това как тези ракови клетки реагират на отговорите на имунните клетки остава неясно.

За да разкрием феномена, чрез който CAG насърчава антигенното представяне на раковите клетки, ние извършихме анализ на траекторията, за да изследваме как раковите клетки се променят една друга в отговор на имунните клетъчни отговори. Открихме, че с течение на времето C07 раковите клетки се трансформират в C05, C06 и C08 клетки, а генното обогатяване също показа, че раковите клетки ще се трансформират в представяне на антиген (фигура 3A–E).

CAG подобрява убиващата функция на имунните клетки

Тези резултати показват, че CAG може да представи антигени на туморни клетки, така че подобряването на представянето на антиген на туморни клетки ще доведе до подобряване на функцията на имунните клетки? За да разберем това, анализирахме съответно лимфоцити и миелоидни клетки. Резултатите показват, че CAG насърчава инфилтрацията на CD8 плюс Т клетки в туморните тъкани и инфилтрацията на CD8 плюс Т клетки и NK клетки също е увеличена, открито чрез поточна цитометрия (онлайн допълнителна фигура S4A-F). Ние също така наблюдавахме, че CAG засилва експресията на Ifitm2, Cxcr6 и S100a6 гени в CD8 плюс Т клетки,

Fcer1g, Gzmb, AW112010 и Zfp36i2 гени в NK клетки и Nfkbia и Junb гени в CD4 плюс Т клетки (онлайн допълнителна фигура S4G). Експресията на Ifng и Gzmb в CD8 плюс Т клетки също беше значително повишена, както беше открито чрез поточна цитометрия (онлайн допълнителна фигура S4H, I). Освен това открихме, че след лечение с CAG, експресията на инхибиторните рецептори Lag3, Tigit и Havcr2 на повърхността на CD8 плюс Т клетки намалява и експресията на гените Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 и Pdcd1, характеризиращи активирането на CD8 плюс Т-клетки, повишено значително (онлайн допълнителна фигура S4J). За по-нататъшна проверка, че CAG засилва функцията за убиване на CD8 плюс Т клетки чрез насърчаване на засилено представяне на туморен антиген, ние трансплантирахме CT26 клетки в трансплантирани тумори в голи мишки и наблюдавахме, че CAG не може ефективно да инхибира растежа на тумори (онлайн допълнителна фигура S4K-M ).

След това анализирахме миелоидните клетки и открихме, че Spp1 плюс TAM клетките се увеличават след лечение с CAG, докато броят на C1qc плюс TAM клетки намалява и броят на Il1b плюс моноцитите се увеличава (допълнителна онлайн фигура S5A-D). След лечение с CAG, Spp1 плюс TAM и C1qc плюс TAM клетки бяха по-податливи на провъзпалителна TAM трансформация. Анализът на обогатяването установи, че се фокусира главно върху Tnf-, Ifn-g и сигналния път на възпалителния отговор (онлайн допълнителна фигура S5E-H). Въз основа на гореспоменатите резултати, ние правим извода, че CAG подобрява функцията за разпознаване и убиване на имунните клетки чрез насърчаване на представянето на антиген в раковите клетки. Не е ясно обаче как се регулира CAG.

Откриване на CAG целевия протеин CTSB чрез капан

След това ще изследваме специфичния целеви протеин на CAG, който играе антитуморна роля. Избрахме раковите клетки като обект на изследване, защото открихме, че CAG може да подобри антигенното представяне на раковите клетки, като по този начин засили убиващата функция на имунните клетки. Първо синтезирахме биотиновото производно на CAG и открихме, че само 3-OH може да реагира (онлайн допълнителна фигура S6A). След това изследвахме дали CAG-биотинът също насърчава експресията на гени, свързани с представянето на антигена, в миша MC38 туморна клетъчна линия. Резултатите показват, че CAG-биотинът не повлиява експресията на гените H2-K1, Cd74 и Anxa1 (онлайн допълнителна фигура S6B-D).

Поради това ние използвахме предишния метод за търсене на цели TRAP в лабораторията.32 CAG и DMSO бяха инкубирани с клетъчна линия MC38 (фигура 4A). Избрахме протеина с FC По-голямо или равно на 2 и ap По-малко или равно на 0.05 като кандидат целеви протеин на CAG. Следвайки принципа, че свързването на малки молекули с протеини ще доведе до ниска ефективност на етикетиране на лизин, ние избрахме CTSB за изследването (фигура 4B). След това използвахме анализ на клетъчно термично изместване (фигура 4C) и микромащабна термофореза (MST) (фигура 4D), за да проверим свързването между CAG и CTSB и открихме, че афинитетът между CAG и CTSB е 26,6 nM (фигура 4D). Впоследствие предвидихме местата на свързване между CAG и CTSB според протеиновата кристална структура на CTSB в PDB библиотеката. Открихме, че хидроксилните групи в двата края на CAG и местата ALA77 и GLY198 на CTSB са свързани с водородна връзка, докато местата TYR75, PRO76 и ALA173 на CAG и CTSB са свързани от силата на Ван дер Ваалс (фигура 4E) . За да проверим мястото на свързване между CAG и CTSB, ние трансфектирахме мутантния плазмид на CTSB в HCT-116 клетки. Резултатите показват, че афинитетът между мутантния плазмид при A77V и G198A и CAG е стотици пъти по-висок от този на WT плазмида (фигура 4F, G). В следващия раздел изследваме специфичния механизъм, чрез който CAG играе антитуморна роля чрез CTSB.

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】