Част Ⅰ: Бъбречни органоиди, генерирани от еритроидни прогениторни клетки на пациенти с автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice и др.

Въведение

Автозомно доминантна поликистозазаболяване на бъбреците(ADPKD) е най-честата генетична причина за хронично бъбречно заболяване (CKD) в световен мащаб и е едно от най-разпространените наследствени моногенни заболявания, засягащо популация, оценена на 1:400-1000 [1].ADPKD (автозомно доминантно поликистозазаболяване на бъбреците) се причинява от мутации в гените PKD1 (тип 1 поликистозна бъбречна болест) и PKD2 (тип 2 поликистозна бъбречна болест), кодиращи съответно полицистин-1(PC1) и полицистин-2 (PC2), което води до промени в ресничките и образуване на кисти. И двата протеина модулират множество молекулярни пътища, както и тъканна морфогенеза и функция. Въпреки това, точните молекулярни механизми, лежащи в основата на цистогенезата, остават неясни. Добре прието е, че мутация на зародишната линия, последвана от соматична мутация (второ попадение) в нормалния алел, е необходима за цистогенезата [2,3]. Освен това, въз основа на резултати от ортоложни модели на мишки, е доказано, че е необходим допълнителен бъбречен инсулт (трето попадение) за бърз и тежък растеж на кисти в зрели бъбреци [4,5]. Изглежда, че при хората повечето втори удари възникват по време на бъбречното развитие, което води до образуване на кисти и растеж дори в утробата. Следователно тежестта и скоростта на прогресиране на бъбречно заболяване в резултат на мутации на PKD1 (тип 1 поликистозна бъбречна болест) и PKD2 (тип 2 поликистозна бъбречна болест) могат да бъдат повлияни от няколко фактора, включително времето на инактивиране на гените, развитието на бъбреците етап, влияние на околната среда, наличие на съпътстващи бъбречни лезии и разнообразие от генетични мутации.

Въпреки че има безброй данни относно патофизиологичните механизми на ADPKD (автозомно доминантна поликистозазаболяване на бъбреците), събрани от проучвания, използващи ортологични и неортологични миши модели, са налични само няколко проучвания, фокусирани върху човешки клетъчни модели на цистогенеза [6]. През 2007 г. Takahashi et al.[Z успешно препрограмира соматичните клетки в плурипотентни стволови клетки с ембрионални свойства, като ги нарече "индуцирани плурипотентни стволови клетки" (iPSC). Оттогава много източници на соматични клетки са били препрограмирани в iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) от животински или човешки тъкани (hiPSCs) [Z], като възрастните фибробласти представляват основния източник на последните. През 2013 г. Freedman et al.[8] индуцирани hiPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) от фибробластите на ADPKD (автозомно доминантна поликистозазаболяване на бъбреците) пациенти и откриха намалена цилиарна експресия на полицистин-2, което подкрепя използването на такива клетки за изследване на патофизиологията на поликистозно заболяване (PKD). Съвсем наскоро Chen et al съобщиха през 2016 г., че са получили hiPS клетки от еритроидни прогениторни клетки [9].

През последните няколко години има значителен напредък в генерирането на 3-измерни органоиди от iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) [Z,10-12]. Първиченбъбректубулните епителни органоиди могат да бъдат получени от бъбречна тъкан, както и от урина, и тези органоиди са важен инструмент за персонализирано моделиране на заболяването, както е показано от Schutgens et al. [13]. В следващите проучвания Freedman et al.[14] успяха да генериратбъбрекорганоиди, получени от достъпна в търговската мрежа hiPS клетъчна линия, установявайки протокол за генериране на клетъчните типове, присъстващи в метанефричната маса, които пораждат всички структури на нефрона. След това, като съборите PKD1 (тип 1 поликистозабъбрекзаболяване) или PKD2 (тип 2 поликистозна бъбречна болест) гени, тези изследователи наблюдават образуване на кисти отбъбректубули. С оглед на всички тези напреднали и иновативни технологии, ние имахме за цел да получим iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) от циркулиращите еритроидни прогениторни клетки на ADPKD (автозомно доминантна поликистозазаболяване на бъбреците)пациенти и тествайте развитието на бъбречни органоиди in vitro, за да обобщите стъпките, включени в органогенезата, опитвайки се да предизвикате някои патофизиологични събития, свързани с ранната цистогенеза.

Щракнете, за да видите страничните ефекти и ползата за бъбреците

Методи Подбор на пациенти

Бяха взети кръвни проби от две несвързани пациентки (PT1 и PT2), клинично диагностицирани с ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) (PT1: 66 години, eGFR 43,8 mL/min на 1,73 m2 и PT2: 56 години, eGFR 60,2 mL/ min на 1,73 m2), проследени при Бъбречна поликистоза. Амбулаторна клиника на Отделението по нефрология на Федералния университет в Сао Пауло (UNIFESP) и друга проба беше събрана от една здрава жена, която послужи като контрола за стабилизиране и нормализиране на техниката. Диагнозата ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) се основава на положителна фамилна анамнеза и на наличието на бъбречни кисти, съгласно ултразвуковите диагностични критерии от Pei et al [15]. (Фамилните родословия са представени на S1A фиг.). И двамата пациенти са имали кистозни бъбреци и черен дроб (изображенията с магнитен резонанс са представени на фигура S1B). Проучването беше прегледано и одобрено от Консултативния комитет по етика на университета (CEP UNIFESP, „Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo“, Nr.1199.-0079-10/2018). След интервю, за да се обясни целта на изследването, пациентите и здравата контрола подписаха формуляра за информирано съгласие.

Експанзия на еритроидни прогениторни клетки, изолирани от цяла кръв. Кръвните проби се събират във вакуумна епруветка, съдържаща EDTA (като антикоагулант) при стайна температура. Еритроидните прогениторни (EP) клетки след това се разделят чрез метод RosetteSep (15216; Stem Cell Technologies), който отстранява нежелани клетки, като зрели RBCs и тромбоцити, като същевременно запазва желаната EP популация. Поради ниската концентрация на ЕР в цяла кръв, клетките бяха размножени и култивирани в специфична културална среда, съдържаща цитокини и добавки (среда X-Vivo, Lonza). ЕР клетките бяха идентифицирани чрез поточна цитометрия с помощта на рецептора за трансферин (CD71) и гликофорин A (Gly A) като маркери, белязани с GFP (S2 Фигура).

Препрограмиране на еритроидни прогениторни клетки

Разширените EP клетки бяха събрани и нуклеофектирани с помощта на Epi5 Episomal iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) комплект за препрограмиране (Thermo Fisher), съдържащ оптимизирана смес от пет препрограмиращи фактора (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, и Klf4). Трансфекцията (електропорация) се извършва с епизомални вектори (без вируси, неинтегриращи се) от комплект Lonza Nucleo фактор. След трансфекцията клетките се поставят в ReproTeSR-специфична културална среда за препрограмиране (Технологии на стволови клетки) при стандартни условия на клетъчна култура (37°C, 95 процента CO и 5 процента O).

Кариотипиране

За да се провери дали процесът на препрограмиране запазва хромозомната цялост, беше извършен анализ на кариотипа в Генетичния отдел на UNIFESP. Клетките бяха третирани с 100 ul колхицин (0,08ug/ml) в 5 ml iPs среда за клетъчна култура за индуциране на спиране на клетъчния цикъл, което беше последвано от добавяне на 0.075 М хипотоничен разтвор на KCI за индуциране на ядрено подуване; След това клетките се фиксират със смес от метанол и оцетна киселина (3:1). Метафазните хромозоми бяха събрани и оцветяването по Райт беше използвано за цитогенен анализ на G-ленти (S3 Фигура).

iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) характеристика на колония

ЕР клетките бяха препрограмирани от епизомални вектори, образуващи типични iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) колонии и представиха нормален кариотип (S3 фиг.). Характеристиките на колонията на iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) бяха сравнени с тези на установена контрола, получена от клетка от линия H9 (hESC, човешки ембрионални стволови клетки, WA09, достъпни от Wicell Research Institute, САЩ) ( Фиг. 1B). Тъй като iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) представят типична морфология, маркерите за плурипотентност са идентифицирани чрез имунофлуоресценция. Клетките се фиксират с 4 процента параформалдехид за 30 минути при стайна температура. След фиксиране, пробите се промиват с PBS три пъти, блокират се в 5 процента PSA и 0,3 процента Triton-X-100/DPBS и се инкубират за една нощ с първични антитела (клетъчно сигнализиране, Ma, EUA), а именно OCT4(1 :400 разреждане) като тест за плурипотентност. На следващия ден беше приготвено ново предметно стъкло, промито в PBS и инкубирано с Alexa Fluor вторично антитяло (1:200 разреждане, клетъчно сигнализиране) и DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, USA) беше добавен за ядрено идентифициране.

Фигура 1. Генериране и характеризиране на iPSC(индуцирани плурипотентни стволови клетки). iPSC бяха препрограмирани от разширени еритроидни прогениторни (ЕР) клетки от здрава контрола (НС) и двама различни ADPKD пациенти (РТ1 и РТ2).

A. Схематично поетапно генериране на бъбречни органоиди B. Сходство на iPSC (a. типично изображение на iPSC от търговски H9 ембрионални клетки. b. iPSC от прогениторни еритроидни клетки от здрава контрола)

C. Морфология на iPSC колонии D. Характеризиране на iPSC плурипотентност, наблюдавана под EVOS fl обърнат цифров флуоресцентен микроскоп.

Маркирането на OCT4 антитяло се използва като маркер за плурипотентност за характеризиране на естеството на плурипотентността на НС, РТ1 и РТ2 колониите.

Клетъчните ядра бяха белязани с DAPI (мащабна лента за Фигура 1B: 200 μm; мащабна лента за Фигура 1C: 1000 μm; мащабна лента HC / PT2 за Фигура 1D: 1000 μm; мащабна лента PT1 за Фигура 1D: 200 μm).

Капацитетът на iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) да се диференцират и в трите зародишни слоя

iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) се отглеждат в 6-плаки с ямки, покрити с Matrigel (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) в културална среда mTeSR1 (Stem Cell Technologies, Британска Колумбия, Канада). За да се предотврати диференцирането на iPSC (индуцираните плурипотентни стволови клетки), колониите бяха пасирани ръчно чрез механично фрагментиране с върха на пипета под микроскоп или бяха дисоциирани чрез ензимно смилане с помощта на Gentle Cell (Life Technologies) (S4 Фиг.). Използвайки тези методи, iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) се поддържат за 22 серийни пасажа, за да се гарантира, че клетките правилно включват факторите за препрограмиране. След това iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) бяха стимулирани да се диференцират в трите зародишни слоя с помощта на STEMdiff Trilineage Differentiation kit (Stem Cell Technologies). След пет дни клетките бяха събрани за анализ на специфични за възрастта на линията маркери на мезодерма и ендодерма и след седем дни те бяха анализирани за ектодерма, съгласно протокола STEMdiff Trilineage Differentiation (S5 Fig).

Молекулярна характеристика на трите зародишни линии чрез qRT-PCR

Общата РНК от култури на трите зародишни слоя се екстрахира с помощта на комплект GE RNA Spin Mini (GE Healthcare, САЩ) и след това се превръща в сДНК с помощта на комплект за обратна транскрипция с голям капацитет (Applied Biosystems, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Количествена PCR в реално време (gRT-PCR) се провежда с помощта на SYBR Green PCR комплект (Applied Biosystems, САЩ) съгласно протокола на производителя. Нивата на експресия на mRNA се изчисляват с помощта на метода 2^Ct. Хидроксиметилбилан синтаза (HMBS) и глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) бяха използвани като вътрешни контроли, а експресията на OCT4 беше използвана като количествена контрола. Експресията на SOX17 се използва за идентифициране на диференциация в ендодерма, CXCR4 се използва за идентифициране на диференциация в мезодерма и PAX6 се използва за идентифициране на диференциация в ектодерма (S6 Фигура). Всички праймерни последователности са посочени в таблица S1 и кривата на ефективност беше оценена за всяка двойка праймери.

Имунофлуоресценция за различните зародишни слоеве

iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) бяха индуцирани да се диференцират върху покривни стъкла в шест ямкови плаки. След диференциация, покривните стъкла се отстраняват от оригиналните ямки и се прехвърлят в нова плака, където клетките се фиксират с 4 процента параформалдехид и след това се промиват с PBS, както е описано по-горе. Бяха използвани първични антитела срещу OCT4 (1:400; клетъчно сигнализиране), CXCR4 (1; 100; клетъчно сигнализиране), PAX6 (1: 100; Thermo Fisher) и SOX17 (1: 100; R&D Systems). Флуоресценцията беше оценена с помощта на вторично антитяло Alexa Fluor (1:200; клетъчно сигнализиране).

Диференциация на бъбречни органоиди от iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки)

Бъбречните органоиди се генерират следвайки протокола, описан от Cruz et al. [6] с някои адаптации. Накратко, 50 000 iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) от HC и двама пациенти с ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) бяха използвани за получаване на суспензии от единични клетки с разтвор за отделяне на Accutase (Stem Cell Technologies). Единичните клетки бяха допълнени с 10uM Rho-киназен инхибитор (Y27632, Stem Cell Technologies или Stemgent). След 16 часа културалната среда беше заменена с 1 mL mTeSR1 плюс 2,5 процента Matrigel плюс 10 μuM Y27632. След 20 часа средата беше заменена само с 1 ml mTeSRI; 14 часа по-късно културалната среда беше заменена и клетките бяха индуцирани с 6 uM CHIR99021 (AT104; стволови клетки или Stemgent GSK-3b инхибитор/агонист на пътя на Wnt) плюс Advanced RPMI (Thermo Fisher) плюс Glutamax (Life Technologies) плюс 10 ug/ml антибиотик (ампицилин; 1:1000; Gibco ). Накрая, 36 часа по-късно, културалната среда беше заменена с DRB среда, съдържаща Advanced RPMI (Thermo Fischer) плюс Glutamax (Thermo Fischer) плюс добавка B27 (17504-044; Life Technologies) плюс антибиотик. DRB средата се сменя на всеки три дни в продължение на 28 дни. Този период (28 дни) е достатъчен, за да могат органоидите да бъдат видими чрез микроскопия.

Молекулярно характеризиране на органоиди чрез RT-PCR

Полуколичествената генна експресия се оценява чрез RT-PCR по време на ембриогенния процес, като общата РНК се пречиства от клетъчните структури, образувани на дни 0(iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки)) и на 14, 21, 28 и 35 дни след индукция на диференциация. Беше оценена експресията на WT1 (развиващ се бъбрек), AQP1 (проксимална тръба) и ECAD (маркер на епител на киста). GAPDH беше използван като вътрешна контрола. Експресията на OCT4 се използва като количествен стандарт.

Резултати

Получаване на iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) от еритроидни предшественици (ЕР)

Протоколът, използван за получаване на бъбречни органоиди от еритроидни предшественици, е обобщен. Експанзията на EPs доведе до 1x10 градуса клетки след приблизително 20 дни (S2A фиг.) и приблизително два месеца по-късно EPs бяха идентифицирани чрез тяхната експресия на маркерите CD71 и Gly A. Ефективността на метода на разделяне разкри експресия; 88 процента от клетките са CD71 положителни, а 57,4 процента са Gly A положителни (S2BFig).

След проверка, че клетките са ЕР, те бяха трансфектирани с препрограмиращи фактори (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc и klf4) и след това бяха поддържани в специфична среда за препрограмиране (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) за приблизително пет дни. iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) развиват типични клетъчни характеристики чрез образуване на колонии с морфология, различна от тази на непрепрограмирани клетки, присъстващи в същата клетъчна култура. Клетките бяха наблюдавани, докато не наблюдавахме типични колонии, подобни на iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки), които бяха подобни на колониите от търговска клетъчна линия H9 (Eig 1B). Колониите на iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) също бяха разпознати по техния относително по-голям размер, плътна клетъчна опаковка, добре дефинирана хомогенна форма и правилни ръбове. Идентифицирането беше улеснено от ниската степен на свръхрастеж на колонии от диференцирани клетки в среда за препрограмиране без фидер (Eig 1C). Не са открити забележими разлики сред iPSC колониите от пациенти с HC и ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) (PT1 и PT2) по отношение на морфологията на колонията и маркерите за плурипотентност, както е показано на Фигура 1D.

iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки) се характеризират допълнително чрез тяхната способност да се диференцират в трите зародишни слоя. Типичните изображения на прогресията на развитието на зародишния слой в клетките от HC са показани на S5 Фиг. Развитието на трите зародишни слоя беше потвърдено чрез типична морфология (Eig 2A) и чрез имунофлуоресцентно маркиране за маркери за диференциация, а именно FOXA2 за ендодерма , гладкомускулен актин (SMA) за мезодерма и SOX2 за ектодерма (Eig2B-2D). Отрицателните контроли за антителата са показани на S7 Фигура. Фигура 2E показва нивата на генна експресия на специфични маркери на ендодерма (SOX17), мезодерма (CXCR4) и ектодерма (PAX6), както са открити чрез RT-PCR.

Фигура 2. Характеристика на трите зародишни листа. Здрава контрола (HC) и ADPKD1 пациенти (PT1 и PT2).

А. Типична морфология на трите зародишни листа. Зародишните слоеве се характеризират чрез имунофлуоресцентно оцветяване с използване на специфични антитела. B. Ендодерма (FOXA2),

C. Мезодерма (SMA) и D. Ектодерма (SOX2). Клетъчните ядра бяха оцветени с DAPI. Последните колони показват обединени изображения.

E. Генна експресия на OCT4 показва плурипотентност на iPSCs, SOX17 е маркер за ендодерма, CXCR4 е маркер за мезодерма и PAX6 е маркер за ектодерма (n=2).

Експресията на OCT4 от iPSCs се използва като вътрешен количествен контрол. Експресията на OCT4 беше неоткриваема в клетките на трите зародишни слоя (мащаб: 200 μm).

Генериране на бъбречни органоиди от iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки)

Триизмерни бъбречни структури бяха генерирани от iPSCs (индуцирани плурипотентни стволови клетки), получени от HC и пациенти с ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване), следвайки стъпки, които рекапитулират ембрионалното развитие. Фигура 3 показва стъпките, които са необходими за получаване на съответните ембрионални структури. iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) колонии (Eig 3A) бяха дисоциирани с Accutase (Фигура 3B), за да се получат единични iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) (Fig 3C). Като се има предвид нормалният ембриогенен процес, се очаква колониите да се диференцират в бластула и след това в гаструла, но спонтанната диференциация на iPSC (индуцирани плурипотентни стволови клетки) в културата все още е предизвикателство, тъй като клетките спонтанно претърпяват апоптоза [16]. За да се заобиколи този нежелан резултат, ROCK инхибитор на сигнализирането （10 μM Rho-киназен инхибитор Y27632） беше добавен 16 часа след етапа на една клетка. Инхибирането на пътя на ROCK пречи на клетките да задействат пътищата на смъртта, което им позволява да оцелеят и да се приспособят, за да продължат към процеса на диференциация. След това iPSCs (индуцираните плурипотентни стволови клетки) нарастват до достигане на епибластния стадий, който се характеризира с наличието на сфероидни кухини (Фигура 3D). След това беше добавен мощен инхибитор на GSK-3b/агонист на пътя на Wnt (CHIR99021), което беше последвано от добавяне на DRB среда за индуциране на епителен-мезенхимален преход (Фигура 3E и 3E) и накрая мезенхим-епителен преход ( Фиг. 3G); тези стъпки позволяват епителизация и последователно образуване на претубулни агрегати и бъбречни везикули (Eig 3H), което в крайна сметка позволява образуването на бъбречни тубулни органоиди (Фигура 3D). Всички тези стъпки на in vitro ембриогенеза са сходни за клетки, получени от пациенти с HC и ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване).

Наличието на тубулни структури беше потвърдено чрез експресията на специфични маркери чрез имунофлуоресценция: NHE3 и AQP1 за проксималните тубули (Eig4A) и NPHS2 за гломерулите (Eig 4B). Обратно, маркирането на AQP2 не беше открито (Eig 4B), потвърждавайки, че това методологията позволява само развитието на метанефричната маса, но не и на уретерната пъпка. Маркерът ECAD не беше открит в отсъствието на форсколин (Фигура 4B).

За да се провери наличието на специфични маркери, експресирани по време на процеса на развитие на прогениторен бъбрек, всички проби (HC, PT1 и PT2) бяха събрани в пет точки от целия процес на диференциация: ден 0(iPSCs (индуциран плурипотентен ствол клетки)), дни 14, 21, 28 и след това на ден 35 (7 дни след индукция на киста). Времевият ход на генната експресия разкрива диференциация по време на процеса на ембриогенеза, както е показано на Фигура 5A-5C. Маркерът за плурипотентност OCT4 беше експресиран от iPSCs (ден O), но неговите нива бяха намалени за 14 дни, достигайки много ниски нива след диференциация. Обратно, експресията на специфичните маркери на метанефричния мезенхим (WT1) и проксималния тубул (AQP1) прогресивно се повишава, когато процесът на диференциация е започнал до 14-ия ден, достигайки плато до 21-ия ден. Фигура 5D показва експресията на ECAD, цистогенеза маркер, на ден 35, т.е. 7 дни след индуциране на кисти от форсколин. При отсъствието на форсколин, експресията на ECAD е много ниска, дори при пациенти с ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване). Въпреки това, когато беше добавен форсколин (ден 28), и двамата пациенти показаха повишена експресия на ECAD; но същият модел не се наблюдава в HC органоид, който остава с ниски нива на ECADекспресия дори в присъствието на форсколин.

Наличието на кисти, образувани от органоидите, стимулирани с форсколин, е очевидно при пациенти с ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване), както е показано в Eig6. Горният панел показва изображения на органоидите на ден 28, преди добавянето на форсколин (Eig6Aa). Eig6Ab (панорамен изглед-4X) и 6Ac (20X преглед) показват органоидите на ден 35 в присъствието на форсколин, показващ наличието на цистоподобни структури в проби от двата пациента (PT1 и PT2), но не и в HC пробата. Наличието на кисти също беше потвърдено чрез имунофлуоресцентно оцветяване (Фигура 6B). ECAD маркирането не беше открито в HC органоида, но беше ясно наблюдавано в органоидите и от двамата пациенти. Интересното е, че може да се наблюдава и наличието на лумен на кистата.

Фигура 3. Генериране на тубулни органоиди.

Фазово-контрастни изображения на генерирането на епителни тубулни бъбречни органоиди на 28 дни от iPSCs, генерирани от групите HC, PT1 и PT2. През първите 36 часа iPSCs се поддържат в 3D култура.

След това те бяха дисоциирани, трансформирани в единични клетки и третирани с Y-27632, което позволи клетъчна реорганизация и оцеляване, произвеждайки епибластни сфероиди (d).

След това бяха добавени CHIR99201 и DRB, активирайки пътя на Wnt/-catenin и позволявайки диференциация в тубулни органоиди (I).

Морфологията сред сфероидите, получени от пациенти с ADPKD и от HC донор, е сходна. (Мащабна лента за a и f: 1000 μm; мащабна лента за b, cd, e, g, h и i: 200 μm).

НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА РАЗДЕЛЕНИЕⅡ