Епигенетичният регулатор BRD4 участва в предизвиканата от кадмий възпалителна реакция в бъбрека на плъх

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong и др

Cistanche tubulosa предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получитепродукти и Cistanche DHT

РЕЗЮМЕ

Кадмият (Cd) е описан като потенциален индуктор на възпаление, докато все повече доказателства показват, че неподходящото възпаление е фактор, допринасящ заувреждане на бъбреците. Следователно изследването на предизвикания от Cd възпалителен отговор е от голямо значение за изясняване на механизма на индуцирана от Cd нефротоксичност. Съдържащ бромодомен 4(BRD4) е важен епигенетичен регулатор, участващ в развитието на много възпалителни заболявания, но неговите регулаторни роли при предизвикани от Cdвъзпалителенотговорът предстои да бъде изяснен. Тук открихме, че лечението с Cd при плъхове Sprague-Dawley (2 mg/kg BW, ip, 5 последователни дни) и при плъховебъбречна клеткалиния (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) индуцира транскрипцията на възпалителни цитокини, които могат да бъдат намалени от JQ1 (BRD4 инхибитор, 25 mg/kg BW, ip , 3 последователни дни in vivo; 0,5 μM, 12 h in vitro) или BRD4 малка интерферираща РНК (siRNA, in vitro), което предполага, че BRD4 участва в предизвикан от Cd възпалителен отговор. След това нашето проучване изясни ролите на BRD4 в предизвикания от Cd възпалителен отговор. Инхибирането на BRD4 намалява стимулираната от Cd NF-кВ ядрена транслокация и активиране in vivo и in vitro. Cd повишава нивото на ацетилиране на RelA K310 и засилва свързването на BRD4 към ацетилиран NF-кВ RelA in vivo и in vitro, които са отменени чрез инхибиране на BRD4. В обобщение, нашето проучване предполага, че BRD4 участва в Cd-предизвикана транскрипция на възпалителни цитокини чрез медииране на активирането на NF-кВ сигналния път и увеличаване на самото свързване с ацетилиран NF-кВ RelA при плъховебъбрек,следователно, BRD4 може да бъде потенциална терапевтична цел за индуцирани от Cd бъбречни заболявания.

Ключови думи: BRD4КадмийБъбречно възпалениецитокини NF-κB JQ1

1. Въведение

Кадмият (Cd) е тежък метален замърсител с висока токсичност и дълъг полуживот. С развитието на индустриалното производство повишената заплаха от замърсяване с Cd за сигурността на околната среда и човешкото здраве предизвика безпокойство (Wang et al., 2020; Horiguchi and Oguma, 2016). След като се абсорбира от тялото, Cd предизвиква многоорганно увреждане ибъбреке основният целеви орган (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Преди това ние систематично проверявахме, че инхибирането на аутофагията, оксидативния стрес и апоптозата синергично допринасят за причинената от Cd нефротоксичност при плъхове (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Възпалението е физиологичен отговор, който действа като защитна реакция срещу инфекция или нараняване, но индуцираните от Cd неконтролирани и неподходящи възпалителни реакции могат да причинят вреда като увреждане на нормалната тъкан на страничния наблюдател и насърчаване на автоимунни заболявания (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et др., 2020). Предизвиканият от Cd възпалителен отговор обостря сърдечно-съдовите заболявания и увреждането на черния дроб, което предполага, че възпалението може да играе важна роля в медиираното от Cdбъбрекпатологични процеси (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Епигенетиката се отнася до наследствени модификации в генната експресия, базирани на промени в не-ДНК последователности, и обратимостта на тези модификации позволява откриването на нови терапевтични цели (Vendetti и Rudin, 2013). Семейството на бромодомен и екстратерминален домен (BET) включва бромодомен-съдържащ 2 (BRD2), BRD3, BRD4 и бромодомен, специфичен за тестисите (BRDT), който се характеризира с два бромодомена и се свързва с ацетилирани лизини на хистони и нехистони ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee и Bohmann, 2018). BET протеините действат като транскрипционен ко-активатор на много гени, като по този начин регулират клетъчния цикъл, възпалителния отговор, оксидативния стрес и други физиологични процеси в различни патологични модели (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 е особено добре проучен член на семейството на BET протеини и натрупващите се изследвания го съобщават за нова епигенетична цел в регулирането на различнибъбречни заболявания, включително хроничен нефрит, диабетна нефропатия и експериментално увреждане на бъбреците (Zeng and Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Потвърдено е, че BRD4 участва в процеса на транскрипция, зависим от ядрен фактор-κB (NF-κB) за регулиране на възпалителните реакции при много заболявания (Xu и Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 може да бъде привлечен от ацетилиран RelA (NF-κB субединица, протеин-кодиращ ген) при лизин 310 (RelA-K310ac) чрез неговите бромодомени, като по този начин активира циклин-зависима киназа 9 (CDK9) и фосфорилира РНК полимераза II за насърчаване на транскрипция на NF-κB целеви гени (Hajmirza et al., 2018). Неотдавнашни проучвания показват, че инхибиторите на BRD4 могат да бъдат потенциална терапевтична възможност за възпалителни заболявания. При модели на увреждане на гръбначния мозък на плъхове, инхибирането на BRD4 отслабва възпалителния отговор и насърчава функционалното възстановяване на микроглията (Dey et al., 2019). Също така, инхибирането на BRD4 отменя експериментално бъбречно възпаление при миши модели на едностранна уретерална обструкция, антимембранен базален GN и инфузия на ангиотензин II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

С оглед на потенциалните провъзпалителни ефекти на Cd и регулаторните ефекти на BRD4 върху възпалението, ние предположихме, че BRD4 участва в предизвикан от Cd възпалителен отговор. Както се очаква, BRD4 медиира процеса на транскрипция на възпалителни цитокини в модели на бъбрек на плъх, изложени на Cd. Нашето проучване разкрива потенциален механизъм в предизвиканата от Cd възпалителна реакция и предоставя нови прозрения за терапията на индуцирана от Cd нефротоксичност.

2. Материали и методи

2.1. Химикали и антитела

Кадмиев хлорид (CdCl2, безводен, 439800) е закупен от Sigma-Aldrich (Карлсбад, Калифорния, САЩ). (плюс)-JQ1 (HY-13030) беше получен от MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Комплект за екстракция на ядрен протеин беше закупен от Beyotime Institute of Biotechnology (Шанхай, Китай, P0027). Ефективен хемилуминесцентен комплект (ECL, 32209) и реагент за анализ на протеин на бицинхонинова киселина (BCA, 23225) бяха получени от Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Използвани са първични антитела срещу следните протеини: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) са закупени от Proteintech Group (Ухан, Китай); -актин (3700 s), хистон H3 (His3, 4499), сиртуин 1 (Sirt1, 8469), нормален заешки IgG (IgG, 4394) бяха закупени от Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); Бяха закупени BRD4 (ab128874), K (лизин) ацетилтрансфераза 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (ацетил K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-конюгиран магарешки анти-заек (ab150073) от Abcam (Кеймбридж, Великобритания). Втори антитела: кози анти-миши IgG (H плюс L) (115-035-003) и кози анти-заешки IgG (H плюс L) (111-035-003) са закупени от Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA ).

2.2. Животни и експерименти

Двадесет и четири плъха Sprague-Dawley (мъжки, на възраст 6 седмици, 110–120 g) бяха закупени от Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Китай). На плъховете беше разрешен свободен достъп до храна и вода в стая с контролирана среда (24 ± 5 ​​градуса, 12 часа цикъл светлина/тъмнина). Експерименталните процедури бяха приложими към Директива 2010/63/ЕС на Съвета на Европейските общности за експерименти с животни и всички процедури бяха одобрени от Комитета за грижа и използване на животните на Университета Янджоу. След една седмица на аклиматизация, плъховете бяха разделени на случаен принцип в четири групи: (1) Контролна група: инжектирани интраперитонеално със съответния разтворител (физиологичен разтвор или разтвор на 2-хидроксипропил- -циклодекстрин). (2) Cd група: CdCl2 (2 mg/kg телесно тегло, разтворен във физиологичен разтвор), инжектиран интраперитонеално в продължение на 5 последователни дни, за да се установи моделът на интоксикация с Cd. (3) Cd плюс JQ1 група: CdCl2 (2 mg/kg телесно тегло), инжектиран интраперитонеално в продължение на 5 последователни дни, за да се установи моделът на интоксикация с Cd, и JQ1 (25 mg/kg телесно тегло, разтворен в 2-хидроксипропил{{ 25}}разтвор на циклодекстрин), инжектиран интраперитонеално на ден 6-8. (4) JQ1 група: JQ1 (25 mg/kg телесно тегло), инжектиран интраперитонеално на дни 6-8. Статистическите данни за съдържанието на Cd в серуми и бъбречни тъкани на плъхове са изброени в таблица S1, отразявайки успешното установяване на модели на плъхове, изложени на Cd.

След 8 дни лечение, плъховете бяха убити чрез цервикална дислокация под дълбока анестезия след 12 часа гладуване. Бъбречните тъкани бяха дисектирани и 1 g тъкан от всеки бъбрек беше бързо съхранен при -80 ◦C за последващ Western blot и количествен PCR (qPCR) анализ. Останалото количество тъкан бързо се фиксира в 4% параформалдехид (PFA) за имунохистохимично (IHC) оцветяване.

2.3. Клетъчна култура и лечение

Клетъчната линия от бъбрек на плъх (NRK{{0}}E) е получена от Шанхайската клетъчна банка на Китайската академия на науките. NRK-52E клетките се култивират с модифицирана на Dulbecco среда на Eagle (DMEM, Gibco, 12800-017), съдържаща 5 процента фетален говежди серум (FBS, Gibco, 10437-028), пеницилин и стрептомицин (1 00 U/mL) във влажни условия от 5 процента CO2 и 95 процента въздух при 37 градуса. CdCl2 (свръхчиста вода-разтворен) и JQ1 (диметилсулфоксид-разтворен) се съхраняват отделно при 4 градуса и -20 градуса и се разреждат в работни разтвори преди употреба. Експерименталният дизайн беше както следва: (1) Клетките бяха третирани с 0, 2.5, 5, 10 μM Cd за 12 часа или 5 μM Cd за 0, 6, 12, 24 часа за извършване на следващите анализи. (2) Клетките бяха третирани с 5 μM Cd и/или 0, 5 μM JQ1 в продължение на 12 часа, за да се извършат следващите анализи. (3) Клетките бяха трансфектирани със siBRD4 и/или третирани с 5 μM Cd за още 12 часа, за да се извършат следващите анализи.

2.4. Малка интерферираща РНК трансфекция

Трансфектирахме 20 nM BRD4 малка интерферираща РНК (siBRD4, Invitrogen, Калифорния, САЩ) в NRK-52E клетките чрез реагент за трансфекция Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat # 13778150) за 24 часа съгласно ръководствата за продукта. Бяха използвани следните сетивни siPHK:

siBRD4, с целева последователност от 5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3';

siCt (siRNA отрицателна контрола), с целева последователност от 5′- UUCUCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Проби от бъбречна тъкан и NRK-52E клетки бяха лизирани в RIPA буфер, съдържащ протеазни инхибитори, за да се извлече общият протеин. Ядреният протеин се приготвя предварително от свежи тъкани и клетки и се съхранява при -80 градуса. Протеинови проби (20-30 ug на проба) се разделят чрез SDS-PAGE електрофореза, след което се прехвърлят към мембраните от поливинилиден флуорид (Millipore, ISEQ00010). Мембраните се блокират с 5 процента обезмаслено мляко за 90 минути и се инкубират 12 часа при 4 градуса със следните първични антитела: -актин (1:5000), NF-кВ p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). След това мембраните се промиват с TBST и се инкубират със съответните вторични антитела (1: 10000) в продължение на 90 минути при стайна температура (RT). Мембраните се инкубират с електрохемилуминесценция (ECL, ThermoFisher Scientific) и се определят на Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Франция), а оптичната плътност се анализира с помощта на ImageJ (NIH, Bethesda, MD, САЩ).

2.6. Имунофлуоресцентно (IF) оцветяване

NRK{{0}}E клетки, посяти в 24-плака с ямки, бяха отгледани до около 60 процента сливане. Клетките бяха третирани с 5 μM Cd и/или 0,5 μM JQ1 за 12 часа, след това фиксирани с PFA (4 процента, 10 минути), пермеабилизирани с Triton X- 100 (0,1 процента, 15 минути), блокирани с BSA (2 процента, 90 минути) при стайна температура и се инкубира с първично антитяло (NF-кВ p65, разреждане 1:50) за една нощ при 4 градуса. След промиване с PBS три пъти, клетките се инкубират с вторично антитяло (1: 500 разреждане) за 90 минути и с DAPI за 5 минути при RT, след което клетките се наблюдават под конфокален микроскоп. Ядрената транслокация на NF-κB беше анализирана в три независими проучвания.

2.7. qPCR

Общата РНК на бъбречните тъкани и NRK-52E клетките бяха извлечени с комплект RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Япония). 1 ug от общата РНК се използва за синтезиране на 1-ва верига cDNA съгласно ръководството на производителя (Roche, Basel, Switzerland). 2 μL комплементарна ДНК (cDNA) на ямка бяха взети за откриване на относителните нива на mRNA с помощта на LightCycler® 96 PCR система в реално време (Roche). Изчислете относителните нива на иРНК съгласно уравнението 2-△△CT. Праймерите са изброени в Таблица S2. -актинът е референтен ген на плъх.

2.8. Ко-имунопреципитация (Co-IP)

Бъбречните тъкани и NRK-52E клетките бяха лизирани в прясно приготвен буфер за клетъчен лизис (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1% Triton X{{8} }), съдържащи PMSF. Протеинови G зърна (100 μL на проба, Bio-Rad, Hercules, СА, САЩ) се смесват с 2 ug BRD4, RelA-K310ac или IgG антитяло на проба и се въртят за 10 минути при RT. След това общите протеинови лизати се инкубират с комплекс перли-антитяло за една нощ при 4 градуса. След промиване с буфер за клетъчен лизис три пъти, имунопреципитатите бяха ресуспендирани с 1 × SDS PAGE буфер за проби за конфигуриране на пробите. Целевите протеини бяха открити с помощта на Western blotting с анти-BRD4 и анти-RelA K310ac първични антитела.

2.9. Статистически анализ

Всички данни са получени от поне три независими експеримента и са изразени като средна стойност ± SEM, освен ако не е посочено друго. Експерименталните групи бяха сравнени чрез несдвоен двустранен t-тест на Student или еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), използвайки SPSS 22.0 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ). Значимостта беше определена на p <>

3. Резултати

3.1. Cd индуцира експресията на възпалителни цитокини in vivo и in vitro

Като замърсител на околната среда е доказано, че Cd причинява увреждане на бъбреците чрез регулиране на серия от биологични процеси (Wang et al., 2019c). В това проучване промените в нивата на транскрипция на възпалителни цитокини бяха изследвани след излагане на Cd, за да се изследва дали възпалението е включено в индуцирана от Cd нефротоксичност. Данните показват, че експозицията на Cd значително повишава нивата на интерлевкин (IL)-1 и тумор некрозисфактор (TNF)-протеини в NRK-52E клетки (Фиг. 1A-B) и бъбречни тъкани на плъх (Фиг. 1C -Д). Междувременно, както е показано на Фиг. 1E-F, експозицията на Cd повишава транскрипционните нива на възпалителни цитокини (IL-1, IL-6, TNF- и (Моноцитен хемоатрактантен протеин-1) MCP -1) in vivo и in vitro. Тези открития предполагат, че Cd индуцира експресията на възпалителни цитокини в бъбреците на плъхове.

3.2. BRD4 участва в Cd-индуцирания процес на транскрипция на възпалителни цитокини

BRD4 е новоописан епигенетичен регулатор, който се свързва с ацетилирани хистони или нехистони, за да регулира възпалителните процеси при много заболявания. Тук BRD4 инхибиторът JQ1 и BRD4-siRNA бяха използвани за изследване на ролята на BRD4 върху предизвикания от Cd възпалителен отговор. Данните показват, че нивата на Cd-повишен IL-1 и TNF- протеин се регулират надолу чрез лечение с JQ1 in vivo и in vitro (фиг. 2A–D) и чрез нокдаун на BRD4 in vitro (фиг. S1A-B). Междувременно лечението с JQ1 значително инхибира нивата на Cd-усилена транскрипция на IL-1, IL-6, TNF- и MCP-1 в NRK-52E клетки (фиг. 2E) и тъкани от бъбрек на плъх (фиг. 2F). Също така, нокдаунът на BRD4 значително намалява нивата на транскрипция, повишени от Cd на възпалителни цитокини в NRK-52E клетки (фиг. S1C). Взети заедно, тези открития предполагат, че BRD4 е критичен регулатор на предизвикания от Cd възпалителен отговор в бъбреците на плъхове.

3.3. Нивата на експресия на BRD4 остават непроменени след излагане на Cd

След това бяха открити промени в нивата на експресия на BRD4 след излагане на Cd. NRK-52E клетките бяха третирани с Cd под концентрационен градиент и плъховете бяха интраперитонеално инжектирани с Cd в продължение на 5 дни, за да се изясни ефектът на Cd върху експресията на BRD4 в бъбреците in vivo и in vitro. Резултатите показват, че нивата на BRD4 протеин са непроменени както в експонираните на Cd NRK-52E клетки (Фиг. 3A-B), така и в бъбречните тъкани на плъхове (Фиг. 3C-D). Също така, нивата на BRD4 mRNA са непроменени след излагане на Cd (фиг. 3E-F). Тези резултати показват, че BRD4 медиира възпалителен отговор, предизвикан от Cd, не зависи от промените в нивото на експресия.

3.4. BRD4 регулира ядрената транслокация на NF-κB, стимулирана от Cd

Ролите на BRD4 в предизвикания от Cd възпалителен отговор бяха изследвани в нашето проучване. Промяната на NF-κB сигналния път е тясно свързана с транскрипцията на възпалителни цитокини (Chi et al., 2021). Нашето проучване установи, че BRD4 участва в Cd-регулирана ядрена транслокация и активиране на NF-κB. Първо, субклетъчната локализация на NF-кВ се определя чрез IF оцветяване и IHC оцветяване. Данните на Фиг. 4A и D показват, че JQ1 инхибира стимулираната от Cd NF-кВ ядрена транслокация в NRK-52E клетки и бъбречни тъкани на плъх. Междувременно резултатите от Western blot показват, че JQ1 значително намалява нивата на ядрения протеин на NF-κB, повишени от Cd in vivo (Фиг. 4B-C) и in vitro (Фиг. 4E-F). По същия начин, нокдаунът на BRD4 също значително инхибира Cd-насърчава NF-κB ядрена транслокация (фиг. S2A) и намалява Cd-повишените нива на ядрения протеин на NF-kB (фиг. S2B-C) в NRK-52E клетки. Взети заедно, инхибирането на BRD4 може да намали стимулираната от Cd NF-κB ядрена транслокация, което предполага, че BRD4 медиира активирането на NF-κB сигналния път в бъбрека след излагане на Cd.

3.5. Cd повишава нивата на ацетилиране на RelA K310

Проучванията потвърждават, че BRD4 се свързва с ацетилиран RelA K310 чрез неговите бромни домени, за да регулира NF-κB-зависимата транскрипция (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). По този начин бяха открити нивото на ацетилиране на RelA K310 и експресията на два ензима. Данните показват, че протеиновите нива на RelA-K310ac и ацетилаза Ep300 намаляват непрекъснато с повишената концентрация на Cd, докато нивото на протеина на деацетилаза Sirt1 постепенно се повишава в NRK-52E клетките (Фиг. 5A-B) и бъбречните тъкани на плъхове (Фиг. 5C-D). Също така нивата на мРНК на Ep300 и Sirt1 показват същите тенденции (фиг. 5E-F). Тези резултати предполагат, че Cd насърчава нивото на ацетилиране на RelA K310, като по този начин BRD4 може да участва в транскрипцията на възпалителни цитокини, предизвикана от Cd в бъбреците.

3.6. Cd увеличава свързването на BRD4 към RelA-K310ac, за да подобри неговата транскрипционна функция

Свързването към местата на ацетилиране е основата за транскрипционната регулация на BRD4 (Huang et al., 2009). За да се провери дали Cd регулира функцията на BRD4 чрез увеличаване на свързването на BRD4 към RelA-K310ac, взаимодействието между RelA-K310ac и BRD4 беше открито чрез Co-IP. Данните на Фиг. 6A показват, че Cd значително подобрява взаимодействието между RelA-K310ac и BRD4 в NRK-52E клетки, което е облекчено чрез лечение с JQ1 или нокдаун на BRD4. Също така, същата тенденция се наблюдава в тъканите на бъбреците на плъхове (фиг. 6В). Тези резултати показват, че Cd усилва свързването на BRD4 към RelA-K310ac, което насърчава NF-κB-зависима транскрипция и впоследствие допринася за предизвикания от Cd възпалителен отговор.

4. Обсъждане

Съобщено е, че Cd е потенциален тригер на възпаление поради високата му токсичност, докато точният механизъм все още не е напълно разбран (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Нашето проучване потвърди, че Cd индуцира експресия на възпалителни цитокини в бъбречни клетки на плъх и установи, че BRD4, епигенетична цел, която има критични функции в серия от клетъчни процеси, включително възпаление, допринася за предизвикан от Cd възпалителен отговор. По-нататъшни експерименти показват, че BRD4 участва в активирането на сигналния път на NF-κB, стимулирано от Cd. Също така, Cd повишава нивото на ацетилиране на RelA K310, като по този начин увеличава свързването на BRD4 към ацетилиран NF-κB RelA за насърчаване на NF-κB-зависима транскрипция на възпалителни цитокини.

Възпалението е един от естествените защитни механизми срещу екзогенни химикали, докато неконтролираният и неподходящ възпалителен отговор може да увреди нормалните тъкани и да предизвика автоимунни заболявания (Jian et al., 2018). Увеличените с Cd биологични маркери на възпаление често се свързват с различни заболявания. Проучванията показват, че индуцираното от Cd възпаление участва в атерогенезата (Tinkov et al., 2018). Освен това, Cd насърчава експресията на възпалителни цитокини, което допринася за увреждане на белите дробове и тъканите на тестисите и предизвиква хепатотоксичност (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Тези вредни ефекти са в съответствие с нашите резултати, че възпалителният отговор е включен в индуцирано от Cd бъбречно увреждане. Все повече изследвания се фокусират върху механизмите на възникване на Cd-индуцирано възпаление. Като добре проучен член на семейството на BET протеини, BRD4 играе критична роля в много биологични процеси, включително възпаление. Тук JQ1 (инхибитор на BRD4) и siRNA бяха използвани за дерегулиране на функционалната активност на BRD4 и беше установено, че инхибирането на BRD4 намалява индуцираната от Cd транскрипция на възпалителни цитокини в бъбреците на плъхове, което предполага, че BRD4 участва в предизвикания от Cd възпалителен отговор . Обикновено се смята, че дисрегулацията на експресията на BRD4 е решаващо събитие при появата на възпалителна реакция. При увреждане на гръбначния мозък, патологична сърдечна хипертрофия и други заболявания, свързани с възпаление, нарушената експресия на BRD4 допринася за експресията на възпалителни цитокини (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Въпреки това, Cd няма ефект върху нивата на експресия на BRD4 при настоящите експериментални условия, което ни накара да обмислим дали BRD4 медиира предизвикания от Cd възпалителен отговор чрез други пътища.

NF-κB е важен регулаторен фактор при възпалителните процеси и е отговорен за контролирането на експресията на много възпалителни медиатори (Lawrence, 2009). Докладвани са проучвания, че BRD4 участва в регулирането на NF-κB сигналния път. Хуанг и др. (2017) предполагат, че BRD4 регулира IKK-медиирана NF-κB активация чрез пътищата p38 и JNK-MAPK. Wang и др. (2019a) установиха, че нокдаунът на BRD4 или лечението с JQ1 блокира липополизахарид (LPS)-активиран NF-κB сигнален път в микроглия. Meng и др. (2014) демонстрира, че лечението с JQ1 блокира експресията на възпалителните цитокини чрез инхибиране на активирането на NF-κB в третирани с LPS RAW 264.7 клетки. Тези доклади показват, че BRD4 медиира активирането на NF-κB в много модели на възпаление, докато инхибирането на BRD4 е ефективен терапевтичен подход за противовъзпалително действие. В настоящото проучване, инхибирането на BRD4 блокира ядрената транслокация на NF-κB в бъбречни тъкани на плъхове, изложени на Cd и NRK-52E клетки, което предполага, че BRD4 медиира Cd-активирания NF-κB сигнален път.

Обикновено, след като NF-κB се активира от различни стимули и се премести в ядрото, BRD4 се свързва с ацетилиран NF-κB RelA на мястото K310, което повишава неговата стабилност и транскрипционна активност в ядрото (Hajmirza et al., 2018). По този начин нивото на ацетилиране на RelA K310 влияе върху регулаторната функция на BRD4 върху възпалителния отговор. В невроните на хипокампа деацетилазата Sirt1 медиира деацетилирането на RelA K310 за регулиране на експресията на BACE1, което допринася за производството на невронален амилоид (Flores-Leon et al., 2019). В клетките на глиобластома стресът от фотодинамичната терапия регулира надолу деацетилазата Sirt1 и активира ацетилазата Ep300, което повишава нивата на RelA-K310ac и води до повишено производство на про-оцеляващия азотен оксид (Fahey et al., 2019). Нашето проучване установи, че Cd насърчава нивото на ацетилиране на RelA K310 чрез увеличаване на експресията на Ep300 и намаляване на експресията на Sirt1, което показва, че Cd засяга регулаторната функция BRD4 чрез увеличаване на нивата на ацетилиране на RelA K310.

Трябва да се отбележи, че нашите резултати показват, че лечението с JQ1 е по-ефективно от нокдауна на BRD4 при облекчаване на възпалителен отговор, предизвикан от Cd. JQ1 има висок афинитет на свързване с BRD4 и може почти напълно да блокира свързването на BRD4 към хромозомата, докато siBRD4 може само да пречи на експресията на BRD4 протеин, за да намали свързването на BRD4 към целевото място, което предполага, че BRD4 медиира предизвикания от Cd възпалителен отговор може да зависи от свързване с ацетилиран NF-кВ RelA. Последните проучвания показват подобен регулаторен механизъм: след NF-κB ядрена транслокация и активиране, BRD4 след това взаимодейства с ацетилиран RelA за коактивиране на транскрипционното активиране на NF-κB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 беше набран към NF-κB целеви промотори в различни състояния на възпалителна стимулация, докато лечението с JQ1 действаше чрез предотвратяване на свързването на BRD4 към ацетилиран NF-κB RelA, като по този начин намалява транскрипционната активност на NF-κB (Zou et al., 2014). Нашите резултати показват, че инхибирането на BRD4 блокира Cd-усиленото взаимодействие между BRD4 и RelA-K310ac в бъбреците на плъх, подкрепяйки нашите горни резултати, че инхибирането на BRD4 потиска индуцираната от Cd транскрипционна активност на NF-κB, което показва, че Cd усилва свързването на BRD4 към ацетилиран NF-κB RelA за увеличаване на транскрипцията на възпалителни цитокини.

В обобщение, нашето проучване разкрива регулаторните механизми на BRD4 в предизвикан от Cd възпалителен отговор в бъбреците на плъхове: (1) BRD4 медиира Cd-индуцираната NF-кВ ядрена транслокация и активиране. (2) Cd повишава нивата на ацетилиране на RelA K310 и подобрява свързването на BRD4 към ацетилиран NF-κB RelA, което насърчава NF-κB-зависима транскрипция на възпалителни цитокини. В допълнение, инхибирането на BRD4 значително облекчава Cd-повишените нива на възпалителни цитокини, което предполага, че целевият BRD4 има потенциала да бъде разработен като ефективно средство за лечение на възпалителни заболявания, включително Cd-индуциран нефрит.

Декларация за авторски принос на CrediT

Zhongguo Gong: Концептуализация, методология, визуализация, формален анализ, валидиране, разследване, формален анализ, обработка на данни, писане – оригинална чернова. Gang Liu: Концептуализация, Методология, Визуализация, Подреждане на данни, Писане – оригинална чернова, Администриране на проекта, Придобиване на финансиране. Wenjing Liu: Софтуер, ресурси, методология, формален анализ. Hui Zou: Администриране на проекта, Надзор. Ruilong Song: Софтуер, Официален анализ, Надзор. Hongyan Zhao: Софтуер, формален анализ, надзор. Ян Юан: Надзор. Jianhong Gu: Надзор. Jianchun Bian: Придобиване на финансиране, Надзор. Jiaqiao Zhu: Писане – преглед и редактиране, Супервизия. Zongping Liu: Писане – преглед и редактиране, Надзор,

Администриране на проекти, Придобиване на финансиране, Концептуализация.

Декларация за конкурентен интерес

Авторите декларират, че нямат известни конкурентни финансови интереси или лични взаимоотношения, които биха могли да повлияят на работата, докладвана в този документ.

Признание

Тази работа беше подкрепена от Националната природонаучна фондация на Китай (№ 31872533, 31902329, 32072933), Националната ключова научноизследователска и развойна програма на Китай (№ 2016YFD0501208) и проекта на Приоритетната академична програма за развитие на висшето образование в Дзянсу Институция (PADP). Ръкописът е редактиран за правилния английски език, граматика, пунктуация, правопис и цялостен стил от един или повече от висококвалифицираните редактори на ELIXIGEN, говорещи английски.

Препратки

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Пчелното млечице отслабва индуцираната от кадмий нефротоксичност при мъжки мишки. Sci. Представление 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Съвместното излагане на нетоксични нива на кадмий и флуорид предизвиква хепатотоксичност при плъхове чрез задействане на митохондриално окислително увреждане, апоптоза и NF-kB пътища. Environ. Sci. замърсяване. Рез. Вътр. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Прахът от семена от сминдух смекчава предизвиканото от кадмий увреждане на тестисите и хепатотоксичността при мъжки плъхове. Exp. Токсикол. Патол. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting върху Nrf2: как Nrf2 сигнализирането може да повлияе на терапевтичните дейности на BET протеиновите инхибитори. Биоесета 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Роли на селенопротеин S в образуването на неутрофилни екстрацелуларни капани, зависимо от реактивни кислородни видове, индуцирано от селен- дефицитен артериит. Redox Biol. 44, 102003 Дей, А., Янг, У., Гегоне, А., Нишияма, А., Пан, Р., Яги, Р., Гринберг, А., Финкелман, Ф.Д., Пфайфер, К., Джу, Дж. ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 насочва развитието на хематопоетичните стволови клетки и модулира възпалителните реакции на макрофагите. EMBO J. 38 (7)

Фагерберг, Б., роден, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Експозицията на кадмий е свързана с разтворим рецептор на урокиназа плазминогенен активатор, циркулиращ маркер за възпаление и бъдещо сърдечно-съдово заболяване. Environ. Рез. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Сигналните събития нагоре по веригата водят до повишено производство на благоприятен за оцеляването азотен оксид във фотодинамично предизвикани глиобластомни клетки. Свободен Радик. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Вариации на различни метаболити и тежки метали в Oryza sativa L., свързани с хронично бъбречно заболяване с неизвестна етиология в Шри Ланка. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Индуцираното от палмитинова киселина NAD (плюс) изчерпване е свързано с намалената функция на SIRT1 и повишената експресия на BACE1 в невроните на хипокампа. Neurochem. Рез. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Лечението с кадмий предизвиква ехинококоза, увреждане на ДНК, възпаление и апоптоза в сърдечната тъкан на плъхове албиноси Wistar. Environ. Токсикол. Pharmacol. 59, 43–52. възпаление и рак. Биомедицина 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Острата експозиция на кадмий предизвиква продължителна неутрофилия заедно със забавено индуциране на фактор, стимулиращ гранулоцитни колонии, в черния дроб на мишки. арх. Токсикол. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Ефектите от експозицията на кадмий при индукция на възпаление. Имунофармакол. Имунотоксикол. 42 (1), 1–8.