Управлението на разтворения кислород чрез контактор с мембрана от полипропиленови кухи влакна влияе върху стареенето на виното

контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Резюме

Заден план: Многобройни енологични практики могат да причинят излишък на разтворен кислород във виното, като по този начин определят сензорни и хроматични дефекти в краткосрочен до дългосрочен план. Следователно е необходимо да се управлява излишъкът от кислород преди бутилиране. Методи: В това изследване управлението на съдържанието на разтворен кислород чрез контакторен апарат с полипропиленова мембрана от кухи влакна беше извършено в две вина от различни сортове грозде (Aglianico и Falanghina). Вината бяха анализирани след 11-месечно отлежаване. Съдържанието на антоцианини и ацеталдехид се оценява чрез HPLC. Освен това дрфенолнисъединенията и хроматичните характеристики са анализирани чрез спектрофотометрични методи. ЯМР и HR ESIMS анализи бяха проведени за оценка на броя на проантоцианините и полимерните пигменти. Резултати: След 11-месечно отлежаване и в двете вина е установено намаление на свободния и общия SO2 по отношение на първоначалните стойности. При вината с най-високи нива на разтворен кислород се наблюдава по-забележителна загуба. Не бяха открити значителни разлики по отношение на цветовите параметри. В червено вино с най-високо съдържание на кислород, масивно образуване на полимерпигментии са наблюдавани BSA реактивни танини, за разлика от вина с по-ниски нива на кислород. Заключение: Проучването показа, че мембранният контактор може да се окаже успешен инструмент за управление на разтворения кислород във вината, за да се предотврати тяхното окислително разваляне.

Ключови думи: окисление; мембранен контактор; вино; полимерни пигменти

щракнете, за да получите повече информация

1. Въведение

Виното е химически динамична система и дори след ферментация съставът му продължава да се развива по време на съхранение. Тези промени след ферментацията се наричат ​​стареене, но трябва да се прави разлика между промените, настъпващи по време на фазата на зреене (напр. съхранение на вино в резервоар или бъчва), когато намесата на винопроизводителя все още е разрешена, и тези, които вземат място по време на фазата на стареене, след като виното е затворено в бутилки и единствената възможна намеса е ограничена до избора на най-подходящите условия за съхранение.

Сред съединенията на виното фенолните съединения са най-засегнати от стареенето. Произхождат от грозде (флавоноидии нефлавоноиди) и представляват един от най-важните параметри за качество на виното. По време на винопроизводството и отлежаването основно се подлагат на фенолиокислениереакции, които не само засягат самия фенолен състав, но също така определят промени по отношение на сензорни характеристики, като цвят и стипчивост.

Фенолните съединения са основните реагенти, които се окисляват в присъствието на кислород и метали (Fe3 плюс Cu2 плюс), което води до каскада от химични трансформации, които могат да доведат до прекомерно влошаване на виното [1]. Виноокислениесе състои от серия от реакции: първо, кислородът се редуцира до водороден пероксид чрез взаимодействие с преходни метали, включително железни и медни йони, в присъствието на катехолни субединици, които се окисляват до хинони [2]. Хиноните реагират силно с нуклеофилни съединения, като антиоксиданти (серен диоксид, глутатион, аскорбинова киселина), желани ароматни летливи тиоли

(т.е. 3-сулфанилхексанол), нежелани ароматни тиоли (т.е. сероводород), аминокиселини (т.е. фенилаланин, метионин) и множество полифеноли (главно флавоноли). Продуктите от тези реакции могат да доведат до образуването на кондензполимерни пигменти— особено важно при червените вина — или дори до загуба на цвят и сортови характеристики [3]. В следващ етап железните или медните видове реагират с водороден пероксид чрез реакцията на Fenton, за да се получи хидроксилният радикал, силен окислител, способен да реагира с всички органични съставки пропорционално на концентрацията [4]. Най-разпространеното органично съединение във виното е етанолът, който се превръща в ацеталдехид след окисляване от хидроксилния радикал.

Като следствие отокисление, в червеното вино естествените антоцианинови пигменти бързо се трансформират в по-стабилни пигменти чрез различни видове реакции, като реакции на кондензация, медиирани от алдехид с танини и реакции на циклоприсъединяване, водещи до образуването на проантоцианини [5]. Реакциите на окисление също допринасят за модифициране на стипчивостта на виното чрез промяна на структурата на танина в резултат на вътрешно- и междумолекулни реакции, медиирани от кислород [6]. Тези „стабилизирани продукти“ антоцианин или пигментирани танини се запазват много по-дълго във виното, отколкото в първоначалните си форми [7]. По този начин ниските количества кислород в червеното вино са важни за стабилизиране на цвета или стипчивостта. Самият Пастьор, в своите изследвания върху виното, теоретизира, че само когато виното е изложено на кислород, то може да развие качества, които го правят фино отлежал висококачествен продукт. По време на винопроизводството кислородът играе решаваща роля в процеса на ферментация. Насърчава синтеза на биомаса от дрожди и благоприятства добрата ферментация. Няколко проучвания показват, че рискът от блокирани и бавни ферментации е намален след добавяне на кислород от 10-20 mg/L [8].

При белите вина окисляването обикновено се свързва с важни промени в цвета. Кафявият цвят обикновено е нежелан, тъй като е признак на окисление в трапезното бяло вино. Кафявото оцветяване може да бъде предизвикано от ензимно или химично окисление, медиирано от кислород. Последното е по-бавно от ензимно-индуцираното окисление. Бялото вино обикновено е по-чувствително към О, отколкото червеното вино. Дори малки добавки на O. към бяло вино могат да доведат до загуба на аромат, особено плодовост с появата на неприятни вкусове, описани като карамел, гранясало, отглеждани във ферми, подобни на мед и варени зеленчуци. Хиноните, генерирани от окислението, могат да реагират с тиоли чрез реакцията на присъединяване на Michael или да генерират H2O2, както е съобщено по-горе. Окислителната среда през всички фази на винопроизводството е в положителна връзка с образуването на тези продукти. По време на стареенето на червеното вино в дъбови бъчви, окислителният процес също предизвиква образуването на сотолон чрез окисление на треонин или чрез реакция на ацеталдехид с -кетомаслена киселина. Окислителното разграждане на фенилаланин и -фенилетанол в варел също води до по-високи концентрации на фенилацеталдехид [9].

Както е описано по-горе, кислородът може да има както благоприятно, така и вредно въздействие върху качеството на виното. Нивото на излагане на кислород на виното по време на винопроизводство или стареене е от решаващо значение, тъй като може да повлияе на крайния продукт. Сингълтън [10] оценява количеството кислород, което бялото или червеното вино може да абсорбира, преди да се появят окислителни дефекти. При бялото вино толерантността е около 10 насищания на въздуха за разлика от червеното вино, което може да понесе повече от 30 насищания на въздух (180 mLO2/L). Той също така препоръчва около 10 насищания за подобряване на качеството на червеното вино.

Следователно управлението на кислорода по време на фазите на винификация и съхранение е важно и трябва да се управлява в съответствие с придобитите знания, за да се избегне появата на окислителни характеристики. След производството на вино виното обикновено се подлага на серия от практики за стабилизиране като декантиране, охлаждане и филтриране, които могат да определят неконтролирано подаване на кислород. Освен това новите методи за винификация, които използват резервоари от неръждаема стомана и системи, позволяващи контролирано микроподаване на кислород (микрооксигениране), вече са често срещани. Дори когато са положени специални усилия за производство на вина, които са възможно най-устойчиви на по-нататъшен прием на кислород, всичкият неконтролиран разтворен кислород във виното може да определи по-нататъшното развитие на окислителни характеристики, след като бъде бутилирано. В този контекст използването на мембранен контактор за управление на кислорода във виното преди бутилиране може да бъде успешна стратегия за получаване на възможно най-добрите вина.

Мембранните контактори са сред най-използваните промишлени системи и тази технология е доказано полезна в редица приложения течност/течност и газ/течност при ферментация, фармацевтични продукти, пречистване на отпадъчни води, хирални сепарации, производство на полупроводници, газиране на напитки, екстракция на метални йони , извличане на протеини, отстраняване на VOC от отпадъчни газове, осмотична дестилация и деалкохолизация на вино [11,12]. Това е устройство, което постига пренос на маса газ/течност или течност/течност без дисперсия на една фаза в друга. Въпреки че мембранната контакторна технология беше въведена като инструмент за управление на газа във вината [13,14], досега малко проучвания се занимаваха с ефективността на нейното приложение преди бутилиране за регулиране на еволюцията на бяло и червено вино по време на стареене в бутилка.

В това проучване е извършена частична деоксигенация на две моносортови вина: Aglianico и Falanghina. Ефектът от отстраняването на кислорода върху няколко параметъра на виното като съдържание на свободен и свързан SO2 и ацеталдехид беше оценен след 1 1 месец отлежаване в бутилка. За червеното вино също беше оценен ефектът върху хроматичните характеристики и основните фенолни съединения.

2. Резултати и дискусия

В това проучване две търговски вина (Aglianico (R) и Falanghina (W)) бяха подложени на процес на деоксигениране чрез използване на мембранна контакторна технология, за да се получат три вина с намаляващи нива на разтворен кислород (високо (H), средно (M), и ниско (L) за всяко вино) преди фазата на бутилиране. След 11 месеца стареене в бутилка, ефектите върху серен диоксид, ацеталдехид, хроматични знаци,полимерни пигментиБяха оценени VRF, BSA-танини и общо фенолно съдържание.

2.1. серен диоксид

Концентрацията на свободен и общ SO2 беше наблюдавана след 11 месеца стареене във виното Aglianico (Таблица 1). За всички проби се наблюдава загуба на SO2 по отношение на времето за бутилиране (свободен SO2, 18 mg/L, общ SO2, 43 mg/L) и най-голям спад в стойностите на общия SO2 се наблюдава при вината с по-високи съдържание на кислород при бутилиране (RHO2 и RMO2), както се очаква.

По време на процеса на стареене, най-разпространените форми на свободен SO2 при рН на виното, бисулфитният йон (HSO, в равновесие с молекулярния SO,), се изразходват от реакцията с водороден пероксид и няколко електрофилни компонента на виното, като тези произведени от окислителната каскада, включително хинон и ацеталдехид [15]. В настройките на винарната обичайна практика е да се измерва така нареченият "свободен SO", който е сумата от молекулярния SO и бисулфитния йон. Това последно съединение може да образува ковалентни адукти с електрофили, наречени SO2 свързващи вещества, които могат да бъдат класифицирани като слаби или силни въз основа на константата на дисоциация на образуваните сулфитни адукти. Тези сулфитни адукти се наричат ​​свързани SO, а сумата

на свободен и свързан SO дава "общия SO". Свободният и свързаният SO са в равновесие един с друг във виното. Освен това, по време на окисление, чрез равновесието между тези две форми на SO2 и чрез консумацията на свободен SO2, комбинираната форма се освобождава, за да се възстанови равновесието. Във всички третирани червени вина, стойности на свободен SO2 под 3,84 mg/L са открити след 11 месеца стареене в бутилка. Тези стойности са доста под границата на количествено определяне на официалните методи за анализ на свободния SO2 [16]; следователно е по-правилно да се счита за пренебрежимо малка стойността на свободния SO, докато стойностите на общия SO са по-ниски в проби, бутилирани с по-високо съдържание на разтворен кислород (RHO2). Преминаването между свободното и комбинираното стареене на виното може да е причината, поради която във вината са открити намаляващи нива на общ SO2, тъй като разтвореният кислород при бутилиране се увеличава. Освен консумацията на SO2 поради окислителни реакции, част от него може да бъде загубена и по време на стареене поради реакциите на серен диоксид с флаваноли. Механизмът на образуване на 4/ß-сулфонирани продукти все още е неясен. Хипотезата е, че мономерните 4ß-сулфонирани производни се образуват чрез киселинно-катализирана деполимеризация на проантоцианидини [17].

Концентрациите на свободен и общ SO2 (Таблица 1) бяха наблюдавани след 11 месеца стареене в бяло вино, чието поведение се оказа същото като това в червеното вино. Освен това, в този случай беше открита загуба на свободен и общ SO2 по отношение на първоначалните стойности (свободен SO, 26 mg/L и общ. SO, 89 mg/L). В допълнение, вина с по-високо съдържание на кислород при бутилирането (WHO2) показа по-ниско съдържание на свободен и общ SO2.

Ацеталдехидът, образуван от катализираното от метал окисление на етанол по време на окисляване на вино, е по-висок при 11 месеца отлежаване в проба WHO, по отношение на пробата WMO, и WLO, както се очаква предвид по-ниското съдържание на свободен и общ SO, в WHO, проби (Таблица 2). Тъй като тегловното съотношение между ацеталдехид и серен диоксид е 1,4/1 (1,4 mg SO2, консумирани на 1 mg CH3CHO), можем да оценим, че количеството ацеталдехид в проба WHO е напълно комбинирано с SO, (50 mg ацеталдехид, комбиниран с 70 mg SO2) и като се имат предвид незначителните нива на свободен серен диоксид след 11 месеца стареене, се очаква, че по-нататъшното излагане на кислород може да доведе до появата на свободен ацеталдехид.

В червените вина концентрацията на ацеталдехид не се различава в анализираните проби. Това вероятно се дължи на факта, че в присъствието на антоцианини и по-висока концентрация на флаваноли, ацеталдехидът участва в редица реакции с тези феноли по време на стареене. Както е обсъдено по-долу, най-важната реакция, включваща ацеталдехид, антоцианини и флавоноли, е образуването на съединения с етилов мост [18,19] и олигомери, свързани с етил, които могат допълнително да реагират с допълнителни ацеталдехид, антоцианини и флаваноли, за да генерират пирани пръстен или други структури от полимерен тип. В крайна сметка тези продукти могат да променят сетивните характеристики на виното [20], като повлияят на някои ключови характеристики на виното като цвят, вкус и стипчивост.

2.2. Ефект върху пигменти и хроматични знаци

Данните за съдържанието на мономерни антоцианини в третирани червени вина след 11 месеца стареене в бутилка показват (Таблица 3 и Допълнителни материали Фигура S1) загуба на малвидин-3-глюкозид в пробата RHO2 с по-висока концентрация на кислород, отколкото в RMO2 и RLO2. Последователно са открити разлики по отношение на общите антоцианини сред вината (Фигура 1). Вино с ниска концентрация на кислород при бутилиране показва по-висока концентрация на общи нативни антоцианини в сравнение с тези с по-високи концентрации на разтворен кислород. Ефектът от обработката с мембранен контактор върху различни класове пигменти, определени по метода на Harbertson, включваше очаквана значителна ниска концентрация в SPP (къси полимерни пигменти) в проби RLO, в сравнение с пробите RHO2 и RMO2, които показаха най-голямо увеличение на тези важни стабилни съединения (Таблица 4). LPP (дълги полимерни пигменти) не се различават значително във всички проби. Полимерните пигменти (SPP и LPP) се определят като пигменти, устойчиви на бисулфитно избелване. Те се образуват от реакцията между антоцианини и танини по време на стареене на виното [21], което води до стабилизиране на цвета с течение на времето. Основната разлика между тези два класа пигменти е, че за разлика от SPP, LPP има тенденция да се утаява с протеин [22]. Тъй като червеното вино старее, обикновено се наблюдава по-голямо образуване на LPP в сравнение с SPP. По този начин промените, открити за SPP, а не за LPP, могат да отразяват ранно окислително състояние на вината Aglianico след 11 месеца стареене. Участието на естествени антоцианини в реакции, даващи нови полимерни пигменти, е в съответствие с намаляването на общите естествени антоцианини, показано в (Таблица 4), и с подобни ефекти, наблюдавани в червени вина по време на микрооксигениране [23].

С остаряването на виното и чрез различно излагане на кислород тези полимерни пигменти стават от решаващо значение за цвета на виното и малки количества ацеталдехид могат да реагират с антоцианините, за да произведат нови стабилни червени пигменти [19,24]. Фактът, че не са открити значителни разлики по отношение на интензитета на цвета и оттенъка (Таблица 5), вероятно може да се дължи, както вече беше наблюдавано за LPP, на относително краткото време на стареене.

2.3. Ефект върху пигментите на червеното вино: NMR и HR ESIMS анализи

С цел разбиране на молекулярната основа на наблюдаваните промени във вината, третирани с различни нива на кислород, проби от RHO2, RMO2 и RLO бяха подложени на NMR-базиран анализ, както е описано в раздел 3. Внимателна проверка на получените H-NMR спектри на трите проби не извеждат наяве никаква забележима разлика между трите сравнени вина (допълнителни материали Фигура S2). Следователно решихме да изследваме същите вина с помощта на HR ESIMS предвид присъщата по-висока чувствителност на техниката в сравнение с NMR спектроскопията. Трите вина бяха фракционирани чрез HPLC/Vis чрез използване на C-18 колона. Бяха получени три фракции за всяко вино: първата фракция беше събрана от 15 до 25 минути (фракция 1), втората от 25 до 3 0 минути (фракция 2) и накрая, трета фракция (фракция 3) от 30 минути до края на хроматографския цикъл. В съответствие с данните, докладвани в литературата [25], в първата фракция се очаква да се появят неацетилирани антоцианини, докато потенциалните пираноантоцианини трябва да бъдат събрани във втората фракция. Трите получени фракции (1-3) за всяко от трите анализирани вина (RHO,, RMO и RLO,) всички бяха подложени на пълен сканиращ HR ESIMS анализ в режим на положителни йони. При нарушение 1 на всички вина открихме йонен пик, който беше приписан на малвидин-3-О-глюкозид (493.1332;△=-1.648; съответстващ на C23H2sO12 плюс), докато йонните пикове бяха свързани с другия често срещан винените антоцианини, когато бъдат открити, показват грешки над 10 ppm и не се считат за надеждни (допълнителни материали, фигура S3). По отношение на фракции 2 и 3 на RMO2 и RLO, те се оказаха основно наслагващи се един с друг, докато масспектрите на фракции 2 и 3 на RHO, виното показа някои интересни особености. По-конкретно, в RHO, фракция 2 се наблюдава йонен пик, центриран при m/z517.1317(△=-4.569; съответстващ на C25H25O12). Този пик се приписва на витизин B (допълнителни материали Фигура S4) [26]. В масовия спектър на фракция 3 на RHO, два йонни пика при m/z809.2294(△=0.827; съответстващо на Ca0H4O18) (допълнителни материали Фигура S5) и 1029.2871(△=-0.065 ; съответстващи на CsH53O25) (допълнителни материали Фигура S6), съответно, се съдържат. Тези йонни пикове са показателни за появата на полимерни пигменти. Пикът при m/z 809 се приписва на димери с етилиденов мост, съставени от една малвидин-3-О-глюкозидна единица и една (епи)катехинова част [27I, а пикът при m/z1029 се приписва на етилиден- мостов димер, съставен от две малвидин-3-О-глюкозидни единици, от които едната се среща в своята флавилиева форма, а другата в нейната псевдо основна форма [28,29].

Vitis в B и пигментите с етилиден мост (m/z 809 и 1029) са резултат от химическата реакция между ацеталдехид и антоцианини или флаван-3-оли. Ацеталдехидът може да действа или като нуклеофил в неговата алфа позиция, или като електрофил в карбонилната функционалност. Реакцията между нуклеофилния ацеталдехид и електрофилната С4 позиция на антоцианините води до образуването на витизин В, доста стабилно съединение, класифицирано като пираноантоцианин. Обратно, когато ацеталдехидът действа като електрофил, като претърпява нуклеофилна атака от C8 и в по-малка степен дори от C6 позициите на флаван-3-оли или антоцианини, се образуват димери с етилиденов мост. Не е изненадващо, че наблюдавахме витизин В и червени пигменти само във виното RHO2, тъй като такива продукти, както беше обсъдено по-горе, се образуват от реакцията на ацеталдехид с антоцианини и флаван-3-оли, а ацеталдехидът е молекула главно в резултат на окислителния процес, на който са подложени вината с течение на времето чрез излагане на атмосферен кислород. Следователно, по-високи количества ацеталдехид със сигурност присъстват в RHO, отколкото в RMO и RLO, вина, които изглежда са били защитени от кислород до

2.4. Ефект върху VRF, BSA-танини и общи феноли

Въпреки че скоро след третирането с мембранен контактор нивата на общите феноли са сходни сред третираните вина, след 11 месеца отлежаване в бутилка броят на общите феноли е по-висок в пробата с по-високи концентрации на кислород при бутилиране, както е показано в таблица 6. Това вероятно може да се дължи на ролята на кислорода в образуването на фенолни съединения, по-реактивни към желязото и в вариация на молекулярната структура на мономерни и полимерни фенолни структури, както вече е показано във вина, подложени на различно усвояване на кислород по време на стареене [6]. Това се потвърждава от тенденцията, наблюдавана в таблица 6 за BSA-реактивни към танини и флавани, реактивни към ванилин и в таблица 4 за SPP, които показват статистическа разлика след 11-те месеца на стареене.

по-голяма степен от RHO2.

Концентрациите на танин, реагиращи на BSA-протеини, се определят по метода на Habertson в RHO, RMO и RLO. По време на стареенето се наблюдава повишаване на нивото на танини, реагиращи на BSA в RHO2, в съответствие с възможна полимеризация на таниновите структури [27]. ]. Наистина, Harbertson [30] показа, че утаяването на BSA се увеличава като функция на нарастващата степен на полимеризация (или размер) от тримери до октамери. Като следствие, всяка промяна в състава и размера на танините може да повлияе на способността им да реагират с BSA. Окисляването на танините предизвиква образуването на вътрешномолекулни, както и междумолекулни връзки между флавоноидите. Последното кара полимерите да се удължат и да станат по-реактивни към слюнчените протеини [31]. Тези видове реакции всъщност могат да променят структурата на танина и по този начин водородните връзки и хидрофобните взаимодействия с протеините [32].

Тъй като стипчивостта се причинява от индуцираната от танин агрегация и утаяването на слюнчените протеини [33], увеличаването на BSA-танините в RHO2 предполага, че промените

подложени на танини чрез тези реакции по време на стареене могат да допринесат за промяна на усещането за стипчивост.

Ванилин-реактивните флавани (VRF) могат вместо това да предоставят допълнителна информация, свързана с размера на кондензираните танини. Всъщност ванилинът реагира с А пръстена на флаванолите на позиция 6 или 8, но също така ацеталдехидът реагира със същите позиции на А пръстена на флаванолите. Следователно, намаляването на VRF може да се разглежда като косвена мярка за окислителната полимеризация на флаваноли, свързана с реакции, предизвикани от ацеталдехид и включващи танини и антоцианини [34].

В нашето изследване се наблюдава малко по-ниска концентрация на VRF в пробата RMO2. Липсата на ясна тенденция като функция на количеството кислород може да се дължи на факта, че тези молекули могат също да претърпят хидролитично разцепване в присъствието на кислород чрез нови молекулни пренареждания с образуването на нови вътрешно- и междумолекулни връзки [6].

3. Материали и методи

3.1. вина

Използвани са две търговски червени вина Aglianico и бели Falanghina, произведени в Южна Италия от винарна Cantina del Taburno. Подробности за пробите заедно с някои основни параметри са показани в Таблица 7. Базовите параметри са определени съгласно компендиума на OIV за международни методи за анализ на вино и мъст (2007 г.).

3.2. Управление на кислорода във виното

Промишлена система ISIOX (Tebaldi srl), оборудвана с мембранен контактор газ-течност (Liqui-Cel9, напречен поток, South Lakes Dr. Charlotte, NC, САЩ, прекъсване 50 g/mol) и центробежна помпа от неръждаема стомана беше използвани. Мембраната осигурява фиксиран и добре определен интерфейс за пренос на маса газ/течност, без да се отделя една фаза в друга. Структурата на мембранния контактор (хидрофобни кухи влакна) е изработена от полипропилен (PP) и предлага много голяма контактна площ (газ/течност) от 20 m²2.

Процесът на деоксигениране се състои от непрекъснати цикли, при които N, вакуум или комбинация от първите два процеса (смес), циркулиращи върху едната повърхност на полипропиленовата мембрана, постепенно се обогатяват с кислород, произтичащ от виното, циркулиращо от другата страна на мембраната. Движещата сила на процеса е разликата в парциалното налягане на кислорода през мембраната. По време на процеса виното непрекъснато циркулира от затворен резервоар към апарата за деоксигениране.

За да се постигне необходимото ниво на кислород, съдържанието на кислород във виното беше наблюдавано през всички процеси до достигане на целевото ниво.

Контролът на процеса беше извършен чрез наблюдение на нивото на O във вината с помощта на компютър, вграден с много проста програмна логика и специфични сензори, които следят температурата и съдържанието на кислород (луминесцентна система, Hach Lange, диапазон на измерване {{{{2} }}} до 20 mg/LO, разделителна способност: 0,01 mg/L O2, точност: 0-5mg/LO2±0,1). За контрол на входното и изходното налягане бяха използвани електронни пресостати, както и налягането на газа в процеса и нивото на всеки вакуум.

Бяха приложени различни обработки за деоксигениране на виното, за да се получат различни проби с различно съдържание на кислород. Количеството кислород в бялото вино е съответно бяло високо O2, WHO2=2.7 mg/L, бяло средно O2, WMO2=1 mg/L, бяло ниско O2, WLO2= 0. 25 mg/L.

Количеството кислород в червеното вино е съответно червено високо O, RHO, =1 mg/L, червено средно O2, RMO2=0.5 mg/L, червено ниско O2, RLO2=0 .2 mg/L. И двата комплекта вина бяха филтрирани при 1 μm преди да бъдат инжектирани в машината, с цел избягване на замърсяването и феномена на омокряне на мембраната [35].

3.3. Бутилиране и отлежаване на проби

След обработките вината бяха бутилирани и всички бутилки бяха запечатани с помощта на коекструдирани синтетични капачки на Nomacorc (Nomacorc SA, Thimister Clermont, Белгия) изберете зелено 100, което позволява на кислорода да преминава през корковата тапа контролиран начин (0,4 mg O2 след 3 месеца, 0,7 mg O2, след 6 месеца, 1,2 mg O2, след 12 месеца и 1,1 mg O2, година след първата година на стареене). Бутилките са отлежавали 11 месеца при 15 градуса.

3.4. Методи за анализ

3.4.1. Определяне на ацеталдехид с високоефективна течна хроматография

Анализите на ацеталдехид се извършват чрез дериватизиране на експериментална проба от вино и HPLC.

Анализът на дериватизация беше както следва: 100 μL проба от вино се разпределя във флакон, последвано от добавяне на 20 μL от прясно приготвен 1,120 mg/L SO, разтвор, 20 μL 25 процента сярна киселина (реагент на Карло Ерба 96 процента) и 140 μL от 2 g /L2,4-динитрофенилхидразин реагент. След смесване, разтворът се оставя да реагира в продължение на 15 минути при 65 градуса и след това бързо се охлажда до стайна температура [36].

Използваният HPLC беше апарат Shimadzu LC10 ADVP (Shimadzu Италия, Милано, Италия), оборудван със системен контролер SCL-10AVP, две помпи LC-10ADVP за създаване на необходимия градиент на разтворителя , SPD-M 10 AVP детектор и система за впръскване изцяло Rheodyne модел 7725 (Rheodyne, Cotati, Калифорния, САЩ). Разделянето се извършва на колона Waters Spherisorb (C 18, субстрат от силициеви частици, ODS2 250×4.6 mm, 5 um диаметър на частиците, размер на порите 80 A), оборудвана с предпазна колона. Оптимална ефективност на разделяне се получава при използване на скорост на потока от 0.75 mL/min, температура на колоната от 35 градуса; подвижните фазови разтворители бяха: (A) 0,5 процента мравчена киселина (Sigma Aldrich По-голямо или равно на 95 процента) във вода milli-Q (Sigma Aldrich) и (B) ацетонитрил (Sigma Aldrich По-голямо или равно на 99,9 процента) ; протоколът за градиентно елуиране беше: 35 процента B до 60 процента B(t=8min), 60 процента B до 90 процента B(t=13min), 90 процента B до 95 процента B(t{{29 }} min,2-min задържане), 95 процента B до 35 процента B（t=17 min, 4-min задържане）, общо време на работа, 21 min, пробни инжекции 50 μL и откриването се извършва чрез наблюдение на сигналите за абсорбция при 365 nm.

The calibration curves were made up by injecting 5 solutions(in triplicate) containing their respective standards covering the range of linearity 10-120mg/L and were characterized by a correlation coefficient (R7)>0.976. Бяха извършени три аналитични реплики за всяка експериментална реплика.

3.4.2. Анализи с високоефективна течна хроматография на антоцианини

Анализите на нативните антоцианини бяха извършени от HPLC Shimadzu LC10 ADVP апарат (Shimadzu Италия, Милано, Италия), оборудван със SCL-10AVP системен контролер, две LC-10ADVP помпи за създаване на необходимия градиент на разтворителя, детектор SPD-M 10 AVP и система за впръскване пълен Rheodyne model7725 (Rheodyne, Cotati, Калифорния, САЩ). Съгласно метода, описан в Компендиума на OIV за международни методи за анализ на вино и мъст [37].

HPLC разтворителите са следните: разтворител A: вода milli-O (Sigma-Aldrich, Милано, Италия)/мравчена киселина (Sigma-Aldrich По-голямо или равно на 95 процента)/ацетонитрил (SigmaAldrich По-голямо или равно на 99,9 процента) (87:10:3)/v; разтворител В: вода/мравчена киселина/ацетонитрил (40:10:50) o/v. Градиентът беше: условия на нулево време 94 процента A и 6 процента B; след 15 минути помпите бяха регулирани на 70 процента А и 30 процента В, на 30 минути на 50 процента А и 50 процента В, на 35 минути на 40 процента А и 60 процента В, на 41 минута, края на анализа, на 94 процента А и 6 процента Б. Приложено е 5 минути време за повторно еквилибриране преди последователния анализ, както е докладвано от [38]. Колоната, използвана за анализите, беше вода

сферична кълбовидна колона（C 18, субстрат от силициеви частици, ODS2 250 ×4,6 mm, 5 μm диаметър на частиците, 80 размер на порите） с предварителна колона беше използвана. В колоната се инжектира количество от 50 μL стандарти за калибриране или вино. Сигналите на абсорбция при 520 nm бяха открити. Чувствителността на детектора беше 0,01 абсорбционни единици пълна скала (AUFS). Всички проби бяха филтрирани през 0.45 um Durapore мембранни филтри (Millipore-Ireland) в стъклени флакони и незабавно инжектирани в HPLC системата.

Калибрационната крива е получена чрез инжектиране на 5 разтвора (в три екземпляра), съдържащи нарастващи концентрации на малвидин-3-моноглюкозид (Extrasynthese, Лион, Франция). Калибрирането се характеризира с коефициент на корелация (R')=0.996. Диапазонът на линейност на кривата на калибриране беше 2-200 mg/L. Прецизността на използвания метод беше тествана чрез шест повторни анализа на проба от червено вино, съдържаща 118,4 mg/L общи мономерни антоцианини. Коефициентът на вариация беше включен между 1,1 процента (за малвидин 3-моноглюкозид) и 9,1 процента (за малвидин 3-(6II-кумароил)-глюкозид) и демонстрира добрата възпроизводимост на HPLC анализа. Концентрациите на мономерните антоцианини бяха изразени като mg/L малвидин-3-моноглюкозид.

Фракционирането на вина RLO2, RMO2 и RHO2 беше извършено съгласно метода за анализ на OIV чрез използване на същия HPLC Shimadzu LC10 ADVP, както е докладвано по-горе. Бяха извършени три аналитични реплики за всяка експериментална реплика.

3.4.3. Йонизираща масова спектрометрия с електроспрей с висока разделителна способност (HR ESIMS) Анализи на червени вина

HPLC-разделянето на червени вина, проведено, както е описано по-горе, дава три фракции за всяко вино. Първата фракция се събира от 15 до 25 минути (фракция 1), втората от 25 до 30 минути (фракция 2), а третата фракция (фракция 3) от 30 минути до края на хроматографията бягане (45 минути). Всяка събрана фракция се изсушава, разтваря се в метанол и се анализира чрез HR-ESIMS при инжектиране на непрекъснат поток в режим на положителни йони. Експериментите с HR ESIMS бяха проведени на Agilent 1260 Infinity IⅡ HPLCкватернерна система, свързана с линеен йонен уловител LTQOrbitrap XL хибриден инструмент за трансформация на Фурие MS (FTMS), оборудван с източник ESI ION MAX (Thermo-Fisher). Бяха използвани следните настройки на източника (масов обхват m/z 100-2000): напрежение на пръскане 4,5 kV, капилярна температура 300 градуса, капилярно напрежение 15 V, обвивен газ 20 и спомагателен газ 21 (произволни единици), напрежение на тръбна леща 140 V и 25 процента енергия на сблъсък. Изчисляването на елементните формули беше извършено чрез използване на софтуер Xcalibur v 2.0.7 с ограничение на допустимото отклонение на масата от 5 ppm.

3.4.4. ЯМР експерименти

Количество от 2 mL от всяка проба от вино (RHO2, RMO2 и RLO2) беше лиофилизирано и разтворено в 700 μL CDOD（6H 3.31;5c49.0ppm）. ЯМР експериментите бяха проведени на спектрометър Varian Unity Inova 700, оборудван с 13C Enhanced HCN Cold Probe и с помощта на Shigemi 5 mm NMR тръби. Използва се H-NMR стандартна импулсна последователност Varian.

3.4.5. Стандартни химични анализи и спектрофотометрични измервания

Според „Компендиум на OIV за международен анализ на вино и мъст за анализ на вино и мъст 2007“ [37], стандартен химичен анализ (алкохолно съдържание, изчислено по обем, редуцираща захар, обща киселинност, рН, летлива киселинност, ябълчена киселинност и общо сухо вещество ) беше измерено.

Спектрофотометричните анализи бяха извършени със спектрофотометър Jenway 7305. Хроматичните характеристики, интензитетът на цвета и оттенъкът са определени съгласно методите на OIV [37]. Интензитетът на цвета се определя като сбор от abs 420 nm, abs 520 nm и abs 620 nm, а оттенъкът като съотношение abs 420 nm/abs 520 nm.

BSA-реактивните танини, късите полимерни пигменти (SPP), големите полимерни пигменти (LPP) и общите феноли са определени от Harbertson et al. анализ [22]. Къси полимерни пигменти (SPP) и големи полимерни пигменти (LPP) бяха получени чрез комбиниране на анализ на супернатанта, получена след утаяване на протеини, използвайки говежди серумен албумин BSA

(Sigma-Aldrich) с бисулфитно избелване на пигменти във вино. Комплексът BSA-танин в пелетата се разтваря отново, добавя се железен хлорид и се отчита при 510 nm. Общите феноли се определят количествено чрез отчитане на пробата при 510 nm, както следва∶ 50 μL вино се добавят към 825 μL буфер С и се отчитат на спектрофотометъра като празен разтвор. След добавянето на 125 μL железен хлорид, пробата се прочита отново, за да се определи количествено количеството феноли, реактивни с желязо.

Ванилин-реактивните флавани (VRF) се определят съгласно Gambuti et al. [39]. Накратко, 750 μL разтвор на ванилин (4 процента в метанол) се добавят към 125 μL разредено вино и след 5 минути се добавят 375 μL концентрирана солна киселина. След 15-минутно инкубиране на сместа при 20 градуса, абсорбцията се определя при 500 nm и се отчита спрямо празен разтвор, в който се използва чист метанол вместо разтвор на ванилин. Концентрациите се изчисляват като (плюс)-катехин (mg/L).

3.4.6. Статистически анализ

Количествените данни бяха сравнени с помощта на процедурата на Tukey за най-малко значими разлики, като цялата дисперсия беше хомогенна. Когато дисперсиите не са хомогенни, данните се анализират с помощта на теста на Kruskal-Wallis. Когато резултатите от теста на Kruskal-Wallis са значими (стр<0.05), the="" significance="" of="" between-group="" differences="" was="" determined="" by="" the="" bonferroni-dunn="" test="" (5%="" significance="" level).="" these="" analyses="" were="" performed="" using="" xlstat(version="" 2013.6.04;="" addinsoft,="" paris,="" france).="" all="" data="" are="" means="" of="" three="">

4. Изводи

Резултатите, получени в това проучване, потвърдиха, че различното съдържание на кислород в бутилираното вино оказва влияние върху стареенето и окисляването на виното.

Управлението на кислорода във виното Aglianico с помощта на контрактор с полипропиленова мембрана от кухи влакна установи след 11 месеца стареене по-ниско съдържание на свободен и общ SO2 в пробата с по-високо ниво на разтворен кислород. Същото поведение се наблюдава при виното Falanghina с повишаване на съдържанието на ацеталдехид в пробата с по-високи нива на кислород.

По отношение на фенолните съединения се наблюдава по-голяма загуба на общи естествени антоцианини в червените вина. Съдържанието им е по-високо във виното с по-ниска концентрация на кислород. Въпреки това, загубата на общите местни антоцианини не се отразява на цветовите параметри на вината, като интензитет на цвета и тоналност.

BSA-реактивните танини и ванилин-реактивните флавани са по-ниски в проби, съдържащи средни и ниски нива на кислород по отношение на пробите с по-високо съдържание на кислород. Това се дължи на факта, че кислородът, участвайки в окислителни реакции, участва в образуването на полимерни пигменти. Както се очакваше, в червени вина с най-високо съдържание на разтворен кислород след третиране с мембранен контактор, витизин B, димери с етилиден мост и ацеталдехид са по-изобилни в сравнение с вината, третирани с по-ниско съдържание на кислород във фазата преди бутилиране .

В заключение, деоксигенирането на вино от мембранни изпълнители може да бъде подходяща техника за винарската индустрия за предотвратяване на всички онези окислителни явления, които биха могли да променят крайното качество на червените и белите вина, засягайки съдържанието на серен диоксид и ацеталдехид (особено в белите вина) . Въпреки това, енолозите трябва да имат предвид, че намаляването на съдържанието на кислород може да повлияе на стабилността на цвета на червените вина.

Допълнителни материали: Следните са достъпни онлайн. Фигура S1: Увеличения на H-NMR спектрите на вина RHO, RMO2 и RLO, регистрирани в CD: OD. Фигура S2: Структура на малвидин 3-O-глюкозид и относителна HR ESIMS в режим на положителни йони. Фигура S3: Структура на витизин B и относителна HR ESIMS в режим на положителни йони. Фигура S4: Структура на димер с етилиденов мост, съставен от една единица малвидин 3-O-глюкозид (отдолу) и една единица (епи)катехин (отгоре) с относителния HR ESIMS в режим на положителни йони. Фигура S5: Структура на димер с етилиденов мост, съставен от две единици на малвидин 3-O-глюкозид, от които тази в долната част е в своята флавилиева форма, а тази в горната част в своята псевдо основна форма, заедно с относителната HR ESIMS в режим на положителни йони.

Препратки

1. Уотърхаус, Алабама; Laurie, VF Окисляване на винени феноли: Критична оценка и хипотези. Am. J. Enol. Витич. 2006, 57, 306–313.

2. Danilewicz, JC Механизъм на автоокисляване на полифеноли и участие на сулфит във виното: Ключова роля на желязото. Am. J. Enol. Витич. 2011, 62, 319–328. [CrossRef]

3. Николантонаки, М.; Waterhouse, AL Метод за количествено определяне на скоростта на реакцията на хинон с нуклеофили, подходящи за вино: Ключ към разбирането на окислителната загуба на сортови тиоли. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8484–8491. [CrossRef] [PubMed]

4. Елиас, RJ; Andersen, ML; Skibsted, LH; Waterhouse, AL Идентифициране на междинни съединения на свободните радикали в окислено вино чрез улавяне на въртене на електронен парамагнитен резонанс. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 4359–4365. [CrossRef] [PubMed]

5. Оливейра, CM; Ферейра, ACS; De Freitas, V.; Silva, AM Окислителни механизми, възникващи във вината. Food Res. Вътр. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

6. Mouls, L.; Fulcrand, H. UPLC-ESI-MS изследване на маркерите за окисление, освободени от деполимеризацията на танин: Към по-добро характеризиране на еволюцията на танина при обработката на храни и напитки. J. Mass Spectrom. 2012, 47, 1450–1457. [CrossRef] [PubMed]

7. Waterhouse, AL Винени феноли. Ан. NY Acad. Sci. 2002, 957, 21–36. [CrossRef]

8. Розенфелд, Е.; Schaeffer, J.; Beauvoir, B.; Salmon, JM Изолиране и свойства на промитохондриите от анаеробни дрождеви клетки в стационарна фаза. Антони Ван Льовенхук 2004, 85, 9–21. [CrossRef]

9. Жараута, И.; Cacho, J.; Ferreira, V. Едновременни явления, допринасящи за формирането на аромата на вино по време на стареене в дъбово дърво: Аналитично изследване. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 4166–4177. [CrossRef]

10. Сингълтън, VL; Trousdale, E.; Зая, Дж. Окисляване на вина. 1. Млади бели вина, периодично изложени на въздух. Am. J. Enol. Витич. 1979, 30, 49–54.