Антиоксидантни и инхибиторни свойства на нишесте-хидролизиращите ензими на устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди

За повече информация се свържете с:tina.xiang@wecistanche.com

Резюме: Повечето от ползите за здравето, произтичащи от зърнените култури, се дължат на техните биоактивни съединения. Това проучване оценява нивата на биоактивните съединения иантиоксиданти нишесте-хидролизиращензимиинхибиторни свойства на шест устойчиви на тръбопровод Striga жълто-оранжеви царевични хибриди (кодирани AS1828-1, 4, 6,8, 9, 11) in vitro. Царевичните хибриди са отгледани в Международния институт по тропическо земеделие (ITA), Нигерия. Биоактивните съединения (общи феноли, танини,флавоноиди, и фитат) нива, антиоксидант (DPPH" и ABTS капацитет за почистване и редуцираща сила) и хидролизиране на нишестеензимиИнхибиторните активности на (-амилаза и х-глюкозидаза) на царевичните хибриди се определят чрез спектрофотометрия. В същото време каротеноидите се определят количествено с помощта на обратнофазова HPLC система. Диапазоните на биоактивните съединения са: 11.25-14.14 mg GAE/g (общо феноли), 3.62-4.67 mg QE/g (общо флавоноиди), 3.{{1{ {34}}}}.29 mg/g (танини),3.66-4.31 процента (фитат),8.92-12.11ug/g (общо ксантофили),2.{{19 }}.89 ug/g (общ -каротин) и 3.17-3.77ug/g (общ провитамин А каротеноиди). Екстракти от царевични хибриди, почистени от DPPH" (SC50: 9. 07-26.35 mg/mL) и ABTS*(2.{{30}}.68 TEACmmol/g), редуцира Fe3 плюс до Fe2 плюс (0,25±0.64-0 .43±0.01 mg GAE/g), и инхибирана -амилаза и -глюкозидаза, с IC50 диапазони от 26.28-52.55 mg/mL и 47.72-63.98 mg/mL, съответно. Сред шестте клона на царевичните хибриди AS1828-9 има най-висок (p<0.05)levels of="" tannins="" and="" phytate="" and="" the="" strongest="">антиоксиданти инхибиторни активности на нишесте-хидролизиращите ензими. Бяха наблюдавани значителни корелации между общите феноли и следното: ABTS*(p<0.01, r="0.757)," dpph"sc50=""><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase=""><0.01,r=-0.836) and="" α-glucosidase=""><0.05, r="-0.582).Hence," the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids(especially="" as1828-9)="" may="" be="" beneficial="" for="" alleviating="" oxidative="" stress="" and="" postprandial="">

Ключови думи: общи феноли; общи флавоноиди; танини; каротеноиди; фитинова киселина; тест за инхибиране на алфа-глюкозидаза; тест за инхибиране на алфа-амилазата

1. Въведение

Осигуряването на високодобивни, питателни и здравословни хранителни култури е от съществено значение за справяне с предизвикателствата, породени от недохранването и свързаните с него заболявания. Следователно различни систематични подходи, като развъждане на устойчиви на болести скоби с подобрено хранително качество, са използвани в изследователски програми за развъждане на растения, за да се отговори на диетичните нужди на бързо нарастващото глобално население. Това става все по-наложително, като се има предвид драстичното намаляване на количеството и качеството на глобалното предлагане на храни, причинено от замърсяването на околната среда, глобалното затопляне и развитието на

нови източници на биогорива [1]. В Субсахарска Африка е доказано, че царевицата (Zea mays L.) допринася за продоволствената сигурност и намаляването на бедността сред семействата с ниски доходи [2].

Жълто-оранжевите генотипове на царевицата са добре известни със своите отлични хранителни и здравословни качества поради биоактивните съединения, които съдържат, включително каротеноиди, полифенолни съединения, фитинова киселина [3-5] и токофероли [6]. Въпреки това, перспективата за продоволствена сигурност и подобрено хранене чрез увеличено производство на царевица в Африка на юг от Сахара е застрашена от кореновото полупаразитно растение, Striga hermonthica (Del.)Benth, което причинява загуби на добив до 100 процента при силно заразяване поради загуба на вода и хранителни вещества чрез паразитиране [7,8]. Следователно S. hermonthica представлява абиотично ограничение за производството на царевица в Африка на юг от Сахара, произтичащо от промяна на парадигмата от традиционната система за отглеждане на зърнени култури, която включва продължителни периоди на угар. Такава традиционна система за отглеждане на зърнени култури гарантира, че нивото на банката със семена на Striga в почвата е поносимо за растенията9]. За да се намалят загубите в добива и качеството на царевицата, причинени от заразяване с S.hermonthica, най-добрият метод за контрол е да се засадят устойчиви на Striga генотипове царевица. Тази стратегия е лесно адаптивна, особено в комбинация с други управленски практики [10].

Нашето скорошно проучване разкри, че устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди съдържат каротеноиди, полифеноли и фитинова киселина [3]. Известно е, че тези биоактивни съединения действат като антиоксиданти и потискат постпрандиалната хипергликемия, наред с други ползи за здравето [4,5,11,12]. Сред биоактивните съединения в зърното на оранжевата царевица се съобщава, че антиоксидантната [13,14] и инхибиторната активност на храносмилателните ензими [15] зависят от фенолните съединения, които съществуват главно в свързана форма. Освен това е известно, че фенолните съединения притежават няколко други биоактивности като инхибиране на ксантин оксидазата и ангиотензин 1-конвертиращите ензими, които са замесени в патогенезата на подаграта и ренин-зависимата хипертония, съответно [11], и анти- възпалителни, антимикробни, противоракови, анти-Алцхаймер и анти-алергични свойства наред с други биологични дейности [16]. Следователно фенолните съединения от хранителни източници привличат голямо внимание както от учени, така и от потребители поради ползите им за човешкото здраве [16].

Целта на това изследване беше да се оценят нивата на биоактивните съединения и инхибиторните свойства на антиоксидантите и нишесте-хидролизиращите ензими на шест тръбопроводно устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди in vitro. Проучването също така тества асоциациите между биоактивните съставки иантиоксиданти инхибиторни активности на нишесте-хидролизиращите ензими на шестте тръбопроводни устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди.

2. Резултати и дискусия

2.1. Биоактивни компоненти в шест тръбопроводни устойчиви на стрига жълто-оранжеви царевични хибриди

Биоактивните компоненти, определени в шестте тръбопровода, устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди (AS1828-1(AS1), AS1828-4(AS4), AS1828-6(AS6), AS{{ 8}} (AS8), AS1828-9(AS9), AS1828-11(AS11))в това проучване са включени общо феноли,флавоноиди, танини, каротеноиди и фитинова киселина. Нивата на общите феноли, общите флавоноиди, танините и фитиновата киселина са представени в таблица 1. Общите феноли варират от 11,25 до 14,14 mg GAE/g съответно в AS4 и AS9; общите флавоноиди варират от 3,62 до 4,67 mg QE/g съответно в AS11 и AS6; съдържанието на танин варира от 3,64 до 6,29 mg/g съответно в AS1 и AS9; и съдържанието на фитинова киселина варира от 3,66 процента в AS6 до 4,47 процента в AS1.

По този начин AS9 съдържа най-високата (стр<0.05)total phenolics="" and="" tannin="" levels,="" while="" as6="" had="" the="" highest="" total="" flavonoids="" content.="" the="" total="" phenolic="" concentrations="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" are="" higher="" than="" the="" values="" previously="" reported="" in="" yellow="" maize="" hybrids,="" including="" 2.15="" mg="" gae/g[15]and="" 2.08="" mg="" gae/g[17].="" similarly,="" the="" levels="" of="" total="" flavonoids="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" in="" this="" study="" are="" higher="" than="" the="" 0.93±="" 0.03="" mg="" oqe/g="" recently="" reported="" in="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour="" [17].="" although="" the="" tannin="" levels="" are="" within="" the="" range(2.1-7.3="" mg/g)previously="" reported="" in="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" [3],="" the="" values="">

сравнително по-високи от обхвата на кондензирани танини (33,70 до 158,55 mg/100g, еквивалентни на 0,34 до 1,59 mg/g), отчетени в пигментирани генотипове на царевица [13].

По-високите нива на общи феноли, общи флавоноиди и танини, наблюдавани в шестте конвейера Striga-устойчиви жълто-оранжеви царевични хибриди, спрямо стойностите в съществуващата литература за тези полифеноли в не-Striga-устойчиви генотипове на жълта царевица, могат да бъдат свързани с възможни разлики в техния генетичен състав [3]. Добре известно е, че биосинтезата на полифеноли и други растителни вторични метаболити се увеличава в присъствието на стресори като клетъчна защита и/или адаптивен механизъм от растението, за да издържа на неблагоприятни условия [16,18]. Освен това покълването на семената на Striga се стимулира от производството на стриголактони (растителни хормони) в корените на царевичното растение, които растението освобождава при стрес [19]. По този начин е възможно чертата за резистентност към S. hermonthica да е регулирала нагоре биосинтезата на полифенолни съединения в царевицата, за да устои на паразита. Това се подкрепя от по-ранен доклад, че резистентността след прикрепване към S. hermonthica включва удебеляване на растителната клетъчна стена и натрупване на много малки вакуоли и фенолни отлагания, които са плътно оцветени в растителната клетка [20].

Фенолните съединения се отличават със своята антиоксидантна активност поради техните редокс свойства, които им позволяват да действат като гасители на синглетния кислород, донори на водород и редуциращи агенти [21]. Освен това се съобщава също, че фенолните съединения инактивират храносмилателните ензими, включително панкреатична липаза, -амилаза и a-глюкозидаза чрез неспецифично свързване с отделните ензими [22]. Както беше съобщено по-рано от Villiger et al [23], фенолните съединения притежават висок афинитет към протеини чрез водородно и хидрофобно свързване, повишавайки способността им да инхибират ензими като -амилаза и -глюкозидаза чрез денатуриране на протеин.

The phytic acid contents were comparable (p>0.05)сред шестте тръбопровода Устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди. Този диапазон е в съответствие с предишния ни доклад за съдържанието на фитинова киселина в устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди [3]. Фитиновата киселина притежава антиоксидантна активност, в допълнение към инхибиращия си ефект срещу развитието на камъни в бъбреците [24], както и противоракови свойства [25]. Антиоксидантните свойства на биоактивните компоненти, особено фенолните съставки (флавоноиди и танини) в устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди, могат също да предотвратят и/или да забавят окислителното разграждане на някои ендогенни хранителни вещества в царевицата, които са силно предразположени към окисление, като ненаситени мастни киселини и витамини [16]. Освен това биоактивните компоненти в устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди могат да намалят скоростта, с която се образуват някои токсични окислителни продукти, като по този начин поддържат хранителното качество и удължават срока на годност на хранителните продукти [26], произведени от тях.

The carotenoid content in the Striga-resistant yellow-orange maize hybrids is presented in Table 2. Total β-carotene (9-cis-β-carotene + 13-cis-β-carotene + all-trans-β-carotene) ranged from 2.42 to 2.89ug/g; total xanthophylls (lutein+zeaxanthin) ranged from8.92 to 12.11l ug/g; and total provitamin A carotenoids(β-cryptoxanthin+β-carotene+α-carotene） ranged from 3.17 to 3.77 μg/g,in AS6 and AS9,respectively. There were no significant differences(p>0.05) в съдържанието на каротеноиди в устойчивото на Striga жълто-оранжево

царевични хибриди. Диапазоните на каротеноидите, получени в това проучване, потвърждават тези, докладвани по-рано от Alamu et al. за биообогатени с провитамин А жълти царевични хибриди [27]. Освен това общите ксантофили са с по-висока стойност от общите каротеноиди на провитамин А в устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди, потвърждавайки констатациите на Ortiz et al. [28].

Каротеноидите може да са допълнили инхибиторните активности на антиоксидантите и нишесте-хидролизиращите ензими на фенолните съединения в устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди, в съответствие с техните отчетени биоактивности. Например, съобщава се, че каротеноидите притежават антиоксидантна активност като основен механизъм, който е в основата на техните ползи за здравето [29]. Те също така осигуряват защитни ефекти срещу незаразни хронични заболявания като рак[30] и сърдечно-съдови заболявания [31]. Също така се съобщава, че -криптоксантин значително намалява риска от диабет тип 2 (T2D) и смекчава инсулиновата резистентност [32,33].

2.2. Антиоксидантна активност на шест тръбопроводни устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди

Антиоксидантната активност на устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди (Таблица 3) разкрива, че всичките шест тръбопроводни клона проявяват антиоксидантна активност чрез извличане на свободни радикали (ABTS степен плюс и DPPH*) и редуциране на железни йони (Fe3 плюс) до железни йони (Fe2 плюс). Антиоксидантната активност варира значително (стр<0.05) among="" the="" hybrids,="" with="" as9="" having="" the="" strongest=""><0.05) free="" radicals="" scavenging="" abilities(7.28="" teac="" mmol/g="" and="" sc50,="" 9.07±="" 0.27="" mg/ml="" for="" abts+="" and="" dpph,="" respectively)and="" ferric-reducing="" power="" (0.43="" mg="" gae/g).="" it="" is="" pertinent="" to="" recall="" that="" as9-9="" also="" had="" the="" highest="" level="" of="" total="" phenolics="" and="" tannins,="" as="" presented="" earlier="" in="" table="" 1.="" the="" dpph°scavenging="" abilities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" obtained="" in="" this="" study="" (sc50:="" 9.07="" to="" 26.35="" mg/ml)="" are="" more="" potent="" than="" those="" reported="" by="" rodriguez-salinas="" et="" al.="" [13]="" for="" pigmented="" maize="" genotypes(ic50:="" 31="" to="" 52="" mg/ml)="" since="" a="" lower="" sc50="" or="" ic50="" is="" indicative="" of="" a="" stronger="" activity="" [34].="" however,="" vitamin="" c,="" a="" standard="" antioxidant="" with="" a="" lower="" sc50(4.63±0.28="" mg/ml),="" had="" a="" stronger="" dpph*scavenging="" activity="" than="" all="" of="" the="" six="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids.="" similarly,="" the="" abts·+="" scavenging="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" (2.65-7.68="" teac="" mmol/g)is="" higher="" than="" the="" value="" (294.81±="" 2.23="" umol="" teac/g)reported="" by="" irondi="" et="" al.[17]="" for="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour.="" the="" stronger="" antioxidant="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" over="" the="" non-striga-resistant="" pigmented="" maize="" genotypes="" may="" be="" attributed="" to="" the="" increased="" deposition="" of="" polyphenolic="" compounds="" in="" their="" defense="" against="" s.="" hermonthica="" [20],="" which="" may="" have,="" consequently,="" enhanced="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

Способността за поглъщане на свободните радикали и силата на намаляване на желязото на устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди предполагат, че те могат да бъдат полезни за защита на тялото от окислителните атаки, утаени от свободните радикали и реактивните кислородни видове. По този начин устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди могат да имат защитен ефект срещу окислителното увреждане на биомолекулите в тялото, включително нуклеинови киселини, протеини, липиди и въглехидрати [35] и хроничните заболявания, свързани с оксидативния стрес [36] .

2.3. Инхибиторни активности на нишесте-хидролизиращите ензими на шестте тръбопроводни устойчиви на стрига биообогатени жълто-оранжеви царевични хибриди

Инхибиторната активност на нишесте-хидролизиращите ензими (-амилаза и -глюкозидаза) на шестте тръбопровода Striga-устойчиви жълто-оранжеви царевични хибриди, изразена като IC50 (концентрация на екстракт, която инхибира ензимната активност с 50 процента), е представена в таблица 4. IC50 стойностите на устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди на -амилаза и -глюкозидаза варират от 26,28 до 52,55 mg/mL и 47,72 до 63,98 mg/mL съответно в AS9 и AS4. По този начин, сред шестте тръбопровода устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди, AS9 с най-ниските стойности на IC50 както за -амилазата, така и за -глюкозидазата, показва най-силните (p<0.05)inhibitory activity="" on="" these="" two="" enzymes.="" interestingly,="" there="" was="" no="" significant="" (p="">0.05) разлика в стойностите на IC50 на AS9 и акарбозата (стандартно антидиабетно лекарство) върху -амилазата, което показва, че инхибиторните способности на -амилазата на AS9 и акарбозата са сравними. Въпреки това, с изключение на способността за инхибиране на -амилазата на AS9, която е сравнима с тази на акарбозата, инхибиторните активности на -амилазата и -глюкозидазата на акарбозата са по-силни от тези на устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди. Способността на различни пигментирани (жълти, лилави, червени и черни) генотипове на царевица да инхибират активността на нишесте-хидролизиращия ензим (-глюкозидаза) е докладвана от Fabila-Garcia et al. [15]. Техните открития разкриват, че екстрактът от жълта царевица има най-високата инхибиторна активност на -глюкозидазата, изразена като процент (69,8 процента), сред царевичните генотипове. В допълнение, Irondi et al. [17] наскоро докладва стойности на IC50 за о-амилаза и -глюкозидаза съответно от 237,12±2,60 и 157,18±1,05 ug/mL за жълто царевично брашно от провитамин А. В сравнение с екстракта от царевична коприна, за който се съобщава [37], че инхибира а-амилазата и -глюкозидазата със средни стойности на IC50 съответно 218,4 и 221,4 ug/mL, шестте конвейерни устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибрида имат по-слаб инхибиторен ефект върху c-амилаза и x-глюкозидаза.

И c-амилазата, и o-глюкозидазата участват в храносмилането на хранителните въглехидрати. Докато -амилазата в тънките черва хидролизира нишестето -1,4 връзки за освобождаване на олигозахариди и дизахариди, -глюкозидазата в четката на тънките черва завършва храносмилането чрез допълнително хидролизиране на олигозахаридите и дизахаридите, за да се получат абсорбируеми монозахариди, включително глюкоза и фруктоза [38]. Следователно, инхибирането на тези два храносмилателни ензима е добре установен терапевтичен подход за облекчаване на постпрандиалната хипергликемия при управление на T2D и ключов механизъм на действие

на много антидиабетни средства [39], включително лекарства, природни продукти и функционални храни. Освен това, устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди имат по-съществен инхибиторен ефект върху -амилазата, отколкото върху -глюкозидазата. Този модел на инхибиране на нишесте-хидролизиращите ензими има благоприятни терапевтични последици и е в съответствие с модела, докладван в предишни проучвания [17,A0]. По този начин шестте тръбопроводни устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди, особено AS9, могат да имат някои предимства при контролирането на постпрандиалната хипергликемия.

2.4. Корелации между биоактивните компоненти, антиоксидантните и инхибиторните активности на нишесте-хидролизиращите ензими на шестте тръбопроводни устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди

Сред биоактивните компоненти общите феноли значително корелират с ABTS· plus (стр<><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase="" ic50=""><0.01,r=-0.836)and α-glucosidase="" ic50=""><0.05,r=-0.582) (table="" 5).="" as="" earlier="" stated,="" lower="" dpph"="" scs0="" and="" enzyme="" ics0="" values="" are="" indicative="" of="" stronger="" scavenging="" and="" inhibitory="" activities="" of="" a="" given="" sample="" on="" dpph*="" and="" enzymes,="" respectively="" [34].="" thus,="" when="" taken="" together,="" the="" negative="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" dpph·sc50,="" α-amylase="" ic50="" and="" α-glucosidase="" ic50,="" as="" well="" as="" the="" positive="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" abts="" scavenging="" ability="" and="" reducing="" power,="" suggest="" that="" phenolic="" compounds="" may="" have="" contributed="" majorly="" to="" the="" observed="" antioxidant="" and="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

3. Материали и методи

3.1. Химикали и реактиви

Тролокс, кверцетин, L-аскорбинова киселина, галова киселина, ABTS (2,2'-азино-бис-(3-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина)), DPPH(2,2-дифенил -2-пикрилхидразил), -глюкозидаза от Bacillus stearothermophillus, р-нитрофенилглюкопиранозид (PNPG), -амилаза, разтворимо нишесте и акарбоза са закупени от Sigma (Сейнт Луис). Използвани са аналитични степени на всички други химикали и разтворители.

3.2. Колекция от проби

Сухи проби от семена от шест устойчиви на тръбопровод Striga жълто-оранжеви царевични хибриди (кодирани AS1828-1,4,6,8,9,11), всички отгледани в Saminaka (8 градуса 39'E, 10 градус 34' N; надморска височина от 760 m; годишни валежи от 1149 mm; температура от 18.1-37.3 градуса; тип почва, Dystric Nitosols) и Зария (7 градуса 45'E, 11 градуса 8'N ; надморска височина 622 m; годишни валежи 1076 mm; средна температура 13.9-35.5 градуса ; тип почва, Ferric Luvisols) са събрани от Програмата за подобряване на царевицата на Международния институт за тропическо земеделие (IITA), Ибадан, Нигерия. Хибридите бяха засадени през май за два сезона, в произволен пълен блоков дизайн в три повторения, по време на дъждовния сезон. Пробите се смилат в брашно (размер на ситото 0,50 mm) с Perten Laboratory Hammer Mill (3102, САЩ) и се опаковат херметически в непрозрачни торбички за проби за по-нататъшни лабораторни анализи.

3.3. Приготвяне1 на екстракт от проби

За да се приготви екстракт от устойчиво на Striga брашно от жълто-оранжеви царевични хибриди, 1 g от брашното се накисва в 10 mL метанол в покрита 50 mL центрофужна епруветка за една нощ (12 часа) с периодично разклащане. След това сместа се центрофугира при 3000 rpm за 10 минути и след това супернатантата (метанолов екстракт) се събира и съхранява при -4 градуса С до анализ [41].

3.4. Определяне на общо фенолно съдържание

Методът на Folin-Ciocalteu, описан от Singleton et al. [42] беше приет за определяне на общото съдържание на феноли в екстракта от брашно от жълто-оранжеви царевични хибриди, устойчиви на Striga. Част (300 uL) от екстракта беше разпределена в епруветка (в три екземпляра). След това се добавят 1,5 mL реагент Folin-Ciocalteu (изходен реагент Folin-Ciocalteu, разреден 10 пъти с дестилирана вода) и 1,2 mL разтвор на Na2CO3 (7,5 процента w/v) и сместа се инкубира на тъмно в продължение на 30 минути при стайна температура. След това се отчита абсорбцията при 765 nm спрямо празна проба. Общото фенолно съдържание се изчислява с помощта на калибрационна крива на галова киселина и се изразява като еквивалент на галова киселина (GAE) в mg/g проба.

3.5. Определяне на общо съдържание на флавоноиди

Протоколът, описан от Kale et al. [43] е използван за определяне на общото съдържание на флавоноиди в екстракта от брашно от жълто-оранжеви царевични хибриди, устойчиви на Striga. Накратко, 0.5 ml от екстракта се разпределят в епруветки; това беше последвано от добавяне на 1,5 mL метанол, 0.1 ml алуминиев хлорид (10 процента), 0,1 mL 1 М калиев ацетат и 2,8 mL дестилирана вода. Реакционната смес се разбърква на вортекс и се инкубира при стайна температура в продължение на 30 минути, след което се отчита абсорбцията при 514 nm. Общото съдържание на флавоноиди в екстрактите се изразява като еквивалент на кверцетин (QE) в mg/g проба.

3.6. Определяне на съдържанието на танин

Съдържанието на танин в екстрактите от брашно от жълто-оранжеви царевични хибриди, устойчиви на Striga, се определя количествено чрез колориметричния метод, описан по-рано от Joslyn [44], с лека модификация. Част от пробата (0.5 g) се диспергира в 5 mL 1% HCI в метанол и се оставя за 15 минути. След това сместа се центрофугира при 3{{10}}00 rpm за 10 минути. Порция от 0,1 mL от супернатантата се разпределя в епруветката, съдържаща 7,5 mL дестилирана вода, след което се добавят 0,5 mL реагент на Фолин-Денис и 1 mL разтвор на Na2CO3 (35 процента) и обемът се довежда до 10 mL с 0,9 mL дестилирана вода След смесване реакционната смес се инкубира в продължение на 30 минути при стайна температура и абсорбцията се отчита при 760 nm. Съдържанието на танин, изразено като еквивалент на танинова киселина (TAE) в mg/g проба, се изчислява от стандартна крива на танинова киселина.

3.7. Количествено определяне на съдържанието на каротеноид в пробата

Съдържанието на каротеноиди в брашното от жълто-оранжеви царевични хибриди, устойчиви на Striga, се определя чрез възприемане на метода, описан от Howe и Tanumihardjo [45]. Каротеноидите се екстрахират от брашната чрез смесване на 0.6 g от пробата с 6 mL етанол (съдържащ 0.1 процента бутилиран хидроксил толуен). Сместа се поставя във водна баня при 85 градуса за 5 минути. След това интерфериращото масло в сместа се осапунява с калиев хидроксид (80 процента w/v) при 85 градуса във водна баня в продължение на 5 минути. След това суспензията се смесва с помощта на вихрова машина и се връща във водната баня за още 5 минути. Незабавно се прехвърля в баня с лед и се добавят 3 mL студена дейонизирана вода. Съдържанието на каротеноид от сместа се отделя три последователни пъти с 3 mL n-хексан чрез центрофугиране при 1000 rpm за 10 s. Горният слой от сместа се разпределя в епруветка за концентратор от 50 ml. Обединената хексанова фракция се промива три пъти с дейонизирана вода, завихря се и се центрофугира за 10 s при 1000 rpm. Фракцията n-хексан се изсушава с помощта на концентратор TurboVap (LIV) под азотен газ за 25 минути. Изсушеният екстракт се разтваря с метанол/дихлорометан (1 mL, 50:50 v/v) и аликвотна част от 100 μL се инжектира в HPLC системата за количествено определяне на каротеноидите. HPLC системата (Water Corporation, Милфорд, Масачузетс, САЩ) се състои от предпазна колона, C30 YMC каротеноидна колона（4,6 × 250 mm, 3 μM）, бинарна HPLC помпа（Waters 626）, автоматичен пробоотборник (Waters 717) и фотодиоден решетъчен детектор (Waters 2996). Системата работи със софтуер Empower 1 (Waters Corporation). Подвижната фаза се състои от разтворител А, съдържащ метанол:вода (92:8 обем/обем) с 10 mmol/L амониев ацетат и разтворител В, съдържащ 100 процента метил третичен бутилов етер. Градиентното елуиране се извършва при скорост на потока 1 mL/min при следните условия: 29 минути линеен градиент от 83 процента до 59 процента А; 6 минути линеен градиент от 59 процента до 30 процента А; 1 минута задържане при 30 процент A; 4 min линеен градиент от 30 процента до 83 процента A и 4-min задържане при 83 процента. Хроматограмите на каротеноидите бяха генерирани при 450 nm и специфичните каротеноиди бяха идентифицирани и количествено определени с помощта на метода на външни стандарти, базиран на кривата на калибриране от чисти стандарти и сравнение на абсорбционния спектър и ко-елуиране със стандартни каротеноиди.

3.8. Определяне съдържанието на фитинова киселина

За определяне съдържанието на фитинова киселина в брашната е използван методът на Wheeler и Ferrel [46]. Екстракцията се извършва чрез механично разклащане на смес от 1 g брашно и 25 mL 3 процента трихлороцетна киселина (TCA) в продължение на 1 час и суспензията се центрофугира в продължение на 15 минути при 3500 rpm. Аликвотна част от 10 mL от супернатантата се смесва с 4 mL разтвор на железен хлорид и сместа се нагрява в кипяща водна баня в продължение на 45 минути. Получената суспензия се центрофугира при 3500 rpm за 15 минути и супернатантата се декантира внимателно. След това утайката се промива два пъти чрез диспергиране в 25 mL 3 процента ТСА, нагряване във вряща водна баня за 10 минути и центрофугиране при 3500 rpm за 10 минути. Обемът на утайката се довежда до 30 mL с дестилирана вода и сместа се нагрява в кипяща водна баня в продължение на 30 минути. Горещата суспензия се филтрира с помощта на филтърна хартия Whatman (№ 2) и утайката се промива с 60 mL гореща дестилирана вода, за да се осигури пълно филтруване. След това утайката, задържана върху филтърната хартия, се разтваря с 40 mL горещ 3,2 M HNO3 в мерителна колба от 100 mL. Аликвотна част от 0,5 mL се прехвърля в центрофужна епруветка и се разрежда със 7 mL дестилирана вода, след което се добавят 2 mL 1,5 М KSCN и обемът се довежда до 10 mL с 0,5 mL дестилирана вода. Абсорбцията се отчита (в рамките на 1 минута) при 480 nm. Съдържанието на фитинова киселина в брашната се изчислява, като се използва атомно съотношение Fe/P 4:6.

3.9. 2,2-Азинобис(3-етил-бензотиазолин-6-сулфонова киселина) Радикален катион (ABTS· плюс) ScaOenging Assay/

Способността на екстрактите от брашно от жълто-оранжеви царевични хибриди, устойчиви на Striga, да поемат ABTS" е изследвана чрез приемане на процедурата, докладвана от Reet al. [47]. ABTS* плюс работен реагент се приготвя чрез старателно смесване на равен обем водни разтвори на ABTS плюс (7 милимола/L) и K2S2Os (2,45 милимола/L) и инкубиране на сместа

в тъмен шкаф на стайна температура за 16 часа. След това абсорбцията на реагента се коригира до 0.70±0.02 с етанол (95 процента) при 734 nm. След това 0,2 ml от екстракта и 2,0 ml от ABTS* реагента се разпределят в епруветката, разбъркват се добре и се инкубират при стайна температура за 15 минути на тъмно. Накрая, абсорбцията се отчита в UV-видим спектрофотометър (Milton Roy Company, САЩ) при 734 nm. ABTSe ​​плюс способността за почистване на екстрактите от брашно по-късно беше изчислена от стандартна крива на Trolox и беше изразена като Trolox еквивалентен антиоксидантен капацитет (TEAC).

3.10. 2,2-Дифенил-2-пикрилхидразил радикал (DPPH“) Тест за отстраняване

Протоколът, докладван от Cervato et al. [48] ​​е използван за определяне на способността на екстрактите от брашно да пречистват DPPH", като се използва витамин С (аскорбинова киселина) като референтен антиоксидант. Накратко, реакционна смес, съдържаща 1.0 mL различни концентрации (8, 16 , 24, 32 mg/mL） от екстракта （или витамин C） и 3.0 ml DPPH градусов разтвор （60 μM） се инкубират при стайна температура на тъмно за 30 минути. След това абсорбцията се отчита при 517 nm и DPPH "почистващата способност (процент) на екстрактите се изчислява и изразява като концентрация на екстракт, който поглъща 50 процента от DPPH" (SC50).

3.11. Тест за намаляване на мощността

Способността на екстрактите от брашно да редуцират Fe3 плюс до Fe2 плюс беше тествана чрез приемане на протокола, описан от Oyaizu [49]. Накратко, смес от екстракт (2,5 mL), 200 mM натриев фосфатен буфер (рН 6,6) (2,5 mL) и 1 процент калиев ферицианид (2,5 mL) се инкубира при 50 градуса за 20 минути , след което се добавят 2.5 mL 10 процента трихлороцетна киселина. След това сместа се центрофугира при 650 × g за 10 минути. Порция от 2,5 mL от супернатантата се разпределя в епруветка и се добавят 2,5 mL дестилирана вода и 1 mL 0,1 процента ферихлорид и се разбъркват старателно и абсорбцията се отчита при 700 nm. Накрая се изчислява редуциращата сила на екстрактите и се изразява в еквивалент на милиграм галова киселина на грам проба.

3.12. Тест за инхибиране на алфа-амилаза

Тестът за инхибиране на алфа-амилаза се провежда чрез приемане на процедурата, описана от Kwon et al. [50]. Свински панкреас -амилаза (EC3.2.1.1) и разтворимо нишесте (субстрат) бяха използвани в този анализ. Различни разреждания на екстрактите от брашно, общо 500μL и 500μL от 0.02 M натриев фосфатен буфер (pH6,9 с 0.006 М NaCl), съдържащ 0.5 mg/mL разтвор на -амилаза, се смесват и се инкубират при 37 градуса за 10 минути. След това се добавят 500 μL 1% разтвор на нишесте в 0,02 М натриев фосфатен буфер и реакционната смес се инкубира при 37 градуса за 15 минути. Впоследствие, катализираната от -амилаза хидролиза на нишестето се прекратява чрез добавяне на 1,0 mL оцветяващ реагент DNSA (1 процент 35-динитросалицилова киселина и 12 процента натриево-калиев тартарат в 0,4 М NaOH). По-късно реакционната смес се инкубира в продължение на 5 минути във вряща водна баня, охлажда се до стайна температура и се разрежда с 10 mL дестилирана вода. Абсорбцията на сместа се отчита при 540 nm. В експеримента е включен референтен тест, който изключва екстракта от брашна. След това процентното инхибиране на амилазата се изчислява, както следва:

(A540R - A540S) × 100 процента инхибиране =A540R

където A540R е показанието на абсорбцията на референтния материал; A540S е показанието на абсорбцията на пробата.

3.13. Тест за инхибиране на алфа-глюкозидаза

Alpha-glucosidase inhibitory activity of the flours extracts was conducted by adopting the procedure reported by Kim et al. [39], using Bacillus stearothermophillus α-glucosidase (EC3.2.1.20) and para-nitrophenylglucopyranoside (PNPG) as the substrate. Five (5)units of an aliquot of α-glucosidase were incubated with 20 μg/mL of the extract for 15 min. The hydrolytic reaction was initiated by adding 3 mM PNPG prepared in 20 mM phosphate buffer, pH6.9, which served as a substrate. The hydrolytic reaction was allowed to proceed for 20 min at37°C, after which 2 mL of 0.1 M Na>СО: беше добавен за прекратяване на реакцията. В експеримента беше включен референтен тест без екстракт от брашно. Абсорбцията на жълтия р-нитрофенол, освободен от -глюкозидаза-катализирана хидролиза на PNPG, се отчита при 400 nm и процентът на инхибиране на о-глюкозидазата се изчислява по следния начин:

(A400R - A400S) × 100 процента инхибиране =A400R

където A400R е показанието на абсорбцията на референтния материал; A400S е показанието на абсорбцията на пробата.

3.14. Анализ на данни

Данните, получени в това изследване (от трикратни определяния) бяха изразени като средни стойности ± стандартно отклонение (SD). Използвайки пакета за статистически софтуер SPSS (16-та версия), върху данните беше извършен еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) и средните стойности бяха сравнени с помощта на post hoc теста на Tukey при p<0.05. the="" associations="" between="" the="" bioactive="" components,="" the="" antioxidant,="" and="" the="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" were="" calculated="" using="" the="" pearson="" correlation="" test.="" column="" representations="" of="" the="" mean="" values="" were="" done="" using="" graphpad="" prism="" (5th="">

4. Изводи

Шестте устойчиви на Striga жълто-оранжеви царевични хибрида съдържат важни биоактивни съставки (общо феноли, общо флавоноиди, танини, фитинова киселина и каротеноиди). Техните екстракти показват силна антиоксидантна активност и инхибират нишесте-хидролизиращите ензими (-амилаза и -глюкозидаза). Сред устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди, AS1828-9 има най-мощните антиоксидантни и инхибиторни активности на нишесте-хидролизиращия ензим. Бяха наблюдавани значителни корелации между общото фенолно съдържание и ABTS* плюс, способност за очистване на степен DPPH, редуцираща мощност, инхибиторна активност на -амилаза и -глюкозидаза на устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди. Инхибиторните активности на антиоксиданта и нишесте-хидролизиращите ензими предполагат, че устойчивите на Striga жълто-оранжеви царевични хибриди (особено AS1828-9) могат да бъдат полезни за предотвратяване и/или облекчаване на оксидативния стрес и постпрандиална хипергликемия.