Механизмът на Cistanche Deserticola насърчава чревната функция

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Резюме

Фенилетаноидгликозиди(PhGs), клас полифенолни съединения, се считат за една от основните биоактивни съставки наЦистанчеdeserticolaYC Ma (CD), чийто екстракт се използва орално в традиционната китайска медицина. Въпреки че предишни фармакологични проучвания съобщават, че PhGs упражняват много дейности, техните чревни транспортни профили не са изяснени. В това проучване ние изследвахме чревната пропускливост на богат на PhG екстракт (PRE) отЦистанчеДезертиколакато интегрирана система в модела на Caco-2 клетъчен монослой, използвайки система за биоанализ. Резултатите показват, че PRE се транспортира предимно чрез слабо абсорбирана пасивна дифузия надолу по концентрационен градиент без ефлукс, което осигурява фармакокинетичната основа за клиничното приложение на PhGs вCistanche Deserticola. Определихме и чревната пропускливост на три основниPhGs[актеозид (AC), изоактеозид (IS) и ехинакозид (EC)]от HLPC. Освен това, ние разработихме нов метод за HPLC-флуоресцентно откриване за точно определяне на количеството на потока на AC и IS. Както се очакваше, транспортните характеристики на тритеPhGsса в съответствие с тези на PRE, което показва, че настоящата система за биоанализ е подходяща и надеждна за оценка на транспортните характеристики на групите активни съставки (AIG) в PRE. Освен това, тази система може да бъде подходяща и за други растителни екстракти, като се има предвид подходяща биоактивност.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Клетъчната линия Caco-2, която е получена от човешки аденокарциноми на дебелото черво, проявява ентероцитни характеристики. При нормални условия Caco-2 клетките спонтанно се диференцират от зрелите клетки и образуват непокътнати монослоеве [1]. Съседните клетки се придържат чрез плътни връзки, образувани от апикалната страна на монослоя, което може да разграничи пасивно и активно транспортираните лекарства през епителния слой [2]. Поради морфологичното и биохимичното сходство с нормалните ентероцити, клетъчните монослоеве Caco-2 служат като добре приет in vitro модел за изследване на потенциала за чревна абсорбция и транспортните характеристики на лекарства [3, 4].

За разлика от химикалите, растителните екстракти (PE) са смеси, чиято биологична активност и активни съставки често не са добре идентифицирани [5]. Освен това чревните транспортни свойства на PE, за разлика от свойствата на неговите съставки, са тясно свързани с клиничната употреба. Измерванията на потока за тестова проба през клетъчен монослой Caco-2 обикновено включват химически методи, като HPLC, LC/MS и др. Въпреки че тези методи са мощни инструменти, те са сложни, отнемат време, скъпи и понякога изискват сложно оборудване. По-важното е, че нито отделен, нито малцинствен компонент може да отразява PE като цяло. По този начин трябва да се установи нов подход, независим от определянето на съставките, за да се идентифицират и оценят транспортните характеристики на PE.

ЦистанчеdeserticolaYC Ma (CD), холопаразитно растение, е обичайна традиционна китайска медицина, използвана главно за лечение на бъбречна недостатъчност, телесна слабост и запек и тези употреби са официално записани в Китайската фармакопея [6]. Фенилетаноидните гликозиди (PhGs), включително ехинакозид (EC), актеозид (AC), изоактеозид (IS) и др., са клас полифенолни съединения [7]. Те се считат за една от основните биоактивни съставки наЦистанчевидове [8]. Фармакологичните изследвания показват, че биоактивността наPhGsе разнообразен и включва антиоксидантни [9], против умора [10], хепатопротективни [11], имуномодулиращи [12], противовъзпалителни [7, 13] и невропротективни ефекти [14]. Въпреки това характеристиките на чревния транспорт наPhGsне са изследвани. В това проучване изследвахме чревната пропускливост на богат на PhG екстракт (PRE) от CD като интегрирана система и пропускливостта на три основни PhG (AC, IS и EC) в диференцирани Caco-2 клетки. Нашите резултати показват, че PRE се транспортира предимно чрез слабо абсорбирана пасивна дифузия надолу по концентрационен градиент без изтичане, което осигурява фармакокинетичната основа за клиничното приложение на PhGs при CD.

Материали и методи

Материали

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS and EC (>98 процента) са закупени от Must Biotechnology Co. (Chengdu, Китай). Модифицираната среда на Eagle на Dulbecco (DMEM), фетален говежди серум (FBS) и неесенциални аминокиселини (NEAA) са произведени от Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). Плаки с 6-ямки TranswellTM (площ на растеж на вмъкната мембрана 4,67 cm2) са получени от Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Колагенът от опашка на плъх е получен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Всички реагенти и химикали за HPLC анализа са с аналитичен клас.

Приготвяне на PRE от Cistanche deserticola

Изсушеният на въздух CD материал се стрити на прах и се екстрахира чрез перколация със 70 процента етанол. Богатата на PhG фракция се приготвя, както е описано по-горе [10] и се екстрахира с наситен с вода n-бутилов алкохол. Екстрактът се концентрира и изсушава при понижено налягане. Спектрофотометрията на макропореста смола-UV [15] измерва съдържание на PhG от 78,4 процента. Крайната проба представлява 1,75 процента добив на суровина от сухо тегло. Получената проба се съхранява при -20 градуса до следваща употреба.

Определяне на AC, IS и EC чрез HPLC

Система Shimadzu HPLC, оборудвана със софтуер за LC разтвор, беше използвана за анализ на съдържанието на AC, IS и EC в PRE. Използва се колона Intersil C18 с обратна фаза (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) и се поддържа при стайна температура. Подвижните фази бяха ацетонитрил и вода, съдържащи 0.1 процента фосфорна киселина (v/v) с градиентно елуиране (Таблица 1) при скорост на потока от 1,0 ml/min. UV спектрофотометърният детектор беше настроен на 334 nm. За да определим точно потока на AC и IS, ние разработихме нов метод за HPLC-флуоресцентно откриване (HPLC-FLD). След структурен анализ и сканиране на дължина на вълната на флуоресценция (данните не са показани), ние получихме оптималните условия за откриване на флуоресценция за AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) и IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

HPLC аналитичният метод беше валидиран с помощта на следните характеристики на ефективност: стабилност, линейност, чувствителност, прецизност (променливост в рамките на деня и между дните) и точност. Аналитите в транспортния буфер се съхраняват при 25 градуса на тъмно в продължение на 24 часа и тяхната стабилност се измерва. Аналитите бяха силно стабилни в присъствието на витамин С (0.4 процента), тъй като стойностите на относителното стандартно отклонение (RSD) в пиковите области бяха < 3,5="" процента.="" уравнението="" на="" линейната="" регресия,="" коефициентът="" на="" корелация,="" диапазонът="" на="" линейност,="" lod="" и="" loq="" за="" ac,="" is="" и="" ec="" са="" показани="" в="" таблица="" 2.="" lods="" (18–30="" nm)="" и="" loqs="" (60–100="" nm)="" стойностите="" показват,="" че="" методите="" hplc-fld="" и="" hplc-uv="" са="" силно="" чувствителни.="" стойностите="" на="" rsd,="" които="" изразяват="" прецизността="" на="" метода,="" са="">< 2="" процента="" за="" вътрешно-="" и="" междудневна="" променливост,="" което="" показва="" добра="" прецизност.="" за="" оценка="" на="" възстановяването,="" ac,="" is="" и="" ec="" се="" добавят="" към="" транспортния="" буфер,="" за="" да="" се="" получат="" три="" (високи,="" средни="" и="" ниски)="" нива="" на="" концентрация.="" стойностите="" на="" възстановяване="" на="" метода="" за="" аналитите="" са="" обобщени="" в="" таблица="" 3.="" средните="" възстановяване="" варират="" от="" 90,0="" процента="" до="" 96,4="" процента,="" което="" показва="" добра="" точност.="" в="" заключение,="" установените="" hplc="" методи="" са="" задоволителни="" по="" отношение="" на="" линейността,="" чувствителността,="" прецизността="" и="" точността="" за="" количественото="" определяне="" на="" ac,="" is="" и="" ec="" в="" транспортния="">

Определяне на PRE чрез система за биотест

Биологичният анализ (общ антиоксидантен капацитет) се основава на FRAP (желязоредуцираща/антиоксидантна мощност) анализ, който описахме по-рано [16] и валидиран по отношение на линейност и прецизност (променливост в рамките на деня и между дните). Линейността на метода за биоанализ се определя въз основа на калибровъчните криви. Концентрационният обхват на линейност беше 0.{0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x плюс 0.0968, R2=0.996). Прецизността на установения метод за биоанализ се определя по отношение на вариабилността в рамките на деня и между дните за анализ на PRE (10,0 ug/ml). Повторяемостта на метода в рамките на деня беше определена въз основа на пет последователни определяния в един и същи ден. Междудневната повторяемост беше измерена въз основа на пет последователни определяния в три различни дни. Стойностите на RSD за точността на метода бяха съответно 1,014 процента и 4,72 процента за променливост в рамките на деня и между дните, което показва добра точност. По този начин, установеният метод за биоанализ е задоволителен по отношение на линейността, прецизността и точността за количественото определяне на PRE в транспортния буфер.

Клетъчна култура

Caco{{0}} клетки се култивират при 37 градуса и 95 процента относителна влажност в атмосфера, съдържаща 5 процента CO2 и среда, състояща се от DMEM, 10 процента FBS, 1 процент NEAA, 1 процент L-глутамин, пеницилин ( 100 U/ml) и стрептомицин (100 ug/ml). Средата се сменя през ден по време на клетъчния растеж и диференциация. Клетките се отглеждат в 75- cm2 пластмасови колби и се събират на всеки 3–5 дни с 0,05 процента EDTA-трипсин. За транспортните експерименти, клетките се посяват при плътност от 1 × 105 клетки/cm2 върху Transwell вложки, покрити с колаген. Приблизително 21 дни след посяването, монослоевете бяха използвани за транспортните експерименти. Тяхната цялост се определя чрез измерване на трансепителното електрическо съпротивление (TEER) през монослоевете с EVOM, оборудван с ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., САЩ). Стойностите на TEER на клетъчния монослой Caco-2 трябваше да надхвърлят 500 O∙cm2.

Транспортни експерименти

Монослоят се промива с транспортен буфер (Р-буфер, съдържащ 10 mM HEPES, 1 mM натриев пируват, 10 mM глюкоза, 3 mM CaCl2 и 145 mM NaCl, рН 7,4) и след това се инкубира предварително за 20 минути при 37 градуса. След отстраняване на транспортния буфер, пресен транспортен буфер, съдържащ тестови проби, беше добавен към апикалната (AP) камера (1,5 ml) в AP към базолатерални (BL) насочени изследвания или BL камера (2,5 ml) в BL към AP насочени изследвания. За AC, IS и EC анализи с помощта на HPLC, аликвотна част (300 ul) беше отстранена от всяка приемна камера на различни интервали от време (30, 60, 90 и 120 минути). Приемната камера се допълва със същия обем прясно загрят (37 градуса) транспортен буфер след всяко вземане на проби. Събраните проби се съхраняват при -20 градуса за по-нататъшна употреба. За определяне на PRE с помощта на биотест, бяха взети само пробите на 120 min. Поради нестабилността на PRE, AC, IS и EC, беше добавен 0,4 процента (w/v) витамин С за стабилизиране на пробите, за да се определи съдържанието на AC, IS и EC чрез HPLC и пробите за PRE биоанализ са анализирани веднага след вземане на проба. Стойността на видимия коефициент на пропускливост (Papp или 'Papp) на всяка проба се изчислява.

Анализ на данни

Стойностите на Papp в посоките AP BL или BLAP на AC, IS и EC бяха изчислени въз основа на следното уравнение: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), където Papp е привидният коефициент на пропускливост (cm/s), определен чрез HPLC. (4Q/4t) е скоростта на поява на изпитваното съединение (AC, IS или EC) от страната на приемника (μmol/s); A е повърхността на вложката (cm2); C0 е първоначалната концентрация на тестваното съединение от страната на донора (μmol/ml). По-конкретно, единицата за маса "ug" беше използвана вместо "μmol", когато бяха изчислени стойностите на Papp. Данните са изразени като средни стойности ± SD.

Резултати

Състав на актеозид, изоактеозид и ехинакозид в PRE от Cistanche Deserticola

Тъй като AC, IS и EC се считат за основните биоактивни PhG на видовете Cistanche [8], ние анализирахме тяхното съдържание в PRE чрез HPLC-UV. Представителната хроматограма е показана на Фиг. 1. Идентифицирането на тези съставки се основава на сравняване на времето на задържане и UV спектъра с тези на автентични стандарти при дължина на вълната 334 nm. Съдържанията на AC, IS и EC в PRE бяха съответно 26,60 процента, 1,84 процента и 32,83 процента. Така тези три съединения представляват 61,27 процента от PRE; освен това, горните резултати показват, че съдържанието на PhG в PRE е 78,4 процента. Следователно AC, IS и EC представляват приблизително 80 процента от PhGs в PRE.

Общ антиоксидантен капацитет на PRE, AC, IS и EC

Докладвани са проучвания на антиоксидантната активност на PhGs от CD [9], а AC, IS и EC представляват приблизително 80 процента от PhGs в PRE. По този начин общият антиоксидантен капацитет на PRE, AC, IS и EC беше анализиран и се изрази с помощта на стойностите на FRAP (× 10–6 mmol). Както е показано на фиг. 2, когато стойността на FRAP е 8 × 10–6 mmol, крайните концентрации на PRE, AC, IS и EC са 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml и 4,89 ug/ ml, съответно, което показва, че общият антиоксидантен капацитет на тези четири проби е класиран както следва: AC > EC > PRE > IS. Биоактивността на PRE се дължи на неговите групи активни съставки (AIG). За приблизително 60 процента от PRE, AC и EC показват по-силна обща антиоксидантна активност от PRE и IS. Тъй като IS (1,84 процента) представлява много малка част от PRE, други компоненти, като слабо антиоксидантния IS, също са ясно активни в PRE. Изненадващо, общата антиоксидантна активност се различава с почти 7-кратно между AC и неговия изомер IS, което показва не само броя на фенолните хидроксилни групи [9], но и позицията на фенолните хидроксилни групи в молекулата, повлияла анти -оксидативен ефект.

Валидиране на монослоевете Caco-2

За валидиране на Caco-2 клетъчната монослойна система, Papp стойностите на пропранолол (добре транспортиран маркер) и Lucifer yellow (лошо транспортиран маркер) от AP до BL през Caco-2 монослоевете бяха определени съответно като 1,51 × 10–5 cm/s и 2,8 × 10–7 cm/s и тези стойности съвпадат с тези, публикувани в предишни доклади [17, 18]. Анализът на активността на алкалната фосфатаза също потвърди, че клетъчните монослоеве Caco-2 са качествено сравними с епитела на тънките черва [19]

Пропускливостта на актеозид, изоактеозид и ехинакозид

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), докато тези на слабо абсорбираните лекарства са ниски (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

Пропускливостта на PRE

Горните резултати показват, че общият антиоксидантен капацитет на PRE се дължи поне на 61,27 процента AIG от PRE. По този начин, ние оценихме TR на PRE въз основа на неговата крива концентрация-ефект на общия антиоксидантен капацитет и изчислихме стойностите на Papp, за да отразим транспортните характеристики на PRE. Стойностите на Papp за PRE за AP!BL и BL!AP бяха (2,16 ± 0.26) × 10–7 cm/s и (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, съответно, което показва, че това съединение е слабо пропускливо. Освен това, ефлуксът или активният транспорт не са очевидни, тъй като съотношението на „Papp BL към AP / „Papp AP към BL за PRE е 1,45 [20]. Нещо повече, двупосочният TR на PRE нараства линейно между приблизително 300 и 900 ug/ml (фиг. 5). Липсата на предпочитание на посоката на резултатите предполага, че пасивната дифузия е основният транспортен механизъм на PRE.

Дискусия

В сравнение с високо пречистените лекарствени продукти, PE обикновено е смес, която се състои от стотици съставки с много различни физикохимични свойства. Следователно PE упражнява систематично, многоцелево и многоканално синергично действие поради техния комплекс AIG [21], което възпрепятства анализа на транспортните характеристики на PE. За да оценят по-научно транспортните свойства на PE, някои изследователи са идентифицирали множество компоненти, а не един компонент в PE [22–24]. Въпреки това, ограничен брой съставни части не могат да отразяват PE като цяло. Определянето на всички компоненти в PE обаче е невъзможно. Освен това, ако различни компоненти в PE показват напълно различни транспортни характеристики, холистичните транспортни характеристики на PE ще бъдат трудни за идентифициране.

През 90-те години на миналия век бяха използвани системи за биоанализ за оценка на TR на антимикробни агенти [25]. До 2005 г. Егучи и колегите му [26] са оценили антиоксидантната активност на екстракта от моркови чрез използване на BL среда от диференцирани Caco-2 клетки; този подход е по-подходящ за отразяване на in vivo ситуации.

Въз основа на предишен доклад за активността на PhGs [9] и нашите резултати (фиг. 2), TR на AIG в PRE може да бъде оценен чрез определяне на общия антиоксидантен капацитет на средата в приемната камера. След транспортните експерименти открихме, че TR на PRE е подобен и в двете посоки и този транспорт е ненаситен и слабо абсорбиран ('Papp < ​​1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" и="" не="" показва="" ефлукс,="" което="" предполага,="" че="" пасивната="" дифузия="" надолу="" по="" концентрационния="" градиент="" е="" основният="" транспортен="" механизъм="" на="" pre="" (фиг.="" 5).="" освен="" това="" транспортните="" характеристики="" на="" pre="" са="" в="" съответствие="" с="" тези="" на="" ac,="" is="" и="" ec,="" ефективните="" компоненти,="" които="" проявяват="" антиоксидантна="" активност="" в="" pre="" (фиг.="" 4="" и="" таблица="" 4).="" този="" резултат="" беше="" очакван="" и="" показа,="" че="" настоящата="" система="" за="" биоанализ="" е="" подходяща="" и="" надеждна="" за="" оценка="" на="" транспортните="" характеристики="" на="" aig="" в="" pre="" в="" диференцирани="" caco-2="">

За разлика от каноничната стойност на Papp, която обикновено се използва за отразяване на транспорта на едно съединение, стойността на Papp, получена от TR въз основа на кривата концентрация-ефект, може не само да отразява компонентите, които проникват в монослоеве с непокътната структура, но също включват други фактори, свързани с целевата активност, като метаболитите на компонентите, химически разградени продукти и дори някои цитокини, секретирани от Caco-2 клетки в отговор на стимулация, която може да повлияе на целевата биоактивност. По този начин многофакторният фактор, споменат по-горе, а не само транспортираните непокътнати компоненти, определят стойността на Papp. Следователно „Papp може да корелира по-силно в ситуации на Vivo, отколкото каноничната стойност на Papp [26]. В това проучване ние изяснихме пасивно дифузираното и слабо абсорбирано естество на PRE въз основа на неговата стойност на Papp и това естество може да бъде свързано с високата доза и дългия период на клинично лечение на CD [27]. Независимо от това, тези открития ще осигурят по-систематични насоки за клиницистите при прилагането на CD, когато са идентифицирани само транспортните характеристики на повечето AIG в CD, а не само PhGs.

Въпреки това, избраният елемент за биоактивност трябва да бъде достатъчно чувствителен, за да бъде открит в средата на приемната камера, което представлява предизвикателство за създаването на система за биоанализ за оценка на транспортните характеристики на PE. Освен това, биоактивността също трябва да зависи от възможно най-много компоненти. В нашето проучване анализът на общия антиоксидантен капацитет беше по-подходящ от няколко други метода (S1 Фиг.). Но дори и така, нашият анализ може да открие TR на PRE само на 120 минути.

Взети заедно, настоящото проучване създаде нова система за биоанализ за оценка на чревната пропускливост на PRE в диференцирани Caco-2 клетки. Получените резултати показват, че слабо абсорбираната пасивна дифузия надолу по концентрационен градиент без ефлукс е основният транспортен механизъм на PRE (фиг. 5), който осигурява фармакокинетичната основа за клиничното приложение на PhGs при CD. Използването на нова система за биотест за оценка на TR и по този начин за изчисляване на стойностите на Papp за оценка на чревния транспорт на AIG в PE е очевидно осъществимо. Този подход може да бъде подходящ и за други РЕ при подходяща биоактивност

подкрепяща информация

S1 Фиг. Ефекти на PRE върху (A) супероксиден анион, (B) хидроксилен радикал, (C) продукт на липидна пероксидация и (D) DPPH радикал. Процедурите за анализ бяха извършени съгласно предишни доклади [1, 2] без използване на транспортен буфер. Стойностите IC50 (50 процента концентрация на инхибиране) и SC50 (50 процента концентрация на прочистване) се изчисляват въз основа на стандартните криви концентрация-отговор. (DOCX)

Авторски принос

Замислил и проектирал експериментите: YG XC YQ. Проведе експериментите: YG CZ FL LF RC YS. Анализира данните: CZ YG YQ. Допринесени реактиви/материали/инструменти за анализ: RC. Написа статията: YG YQ

Отдел за изследователски център по фармакология и токсикология, Институт за развитие на лечебни растения, Китайска академия на медицинските науки и Медицински колеж на Пекинския съюз, Пекин, НР Китай,

Университет по китайска медицина Хейлундзян, Харбин, Хейлундзян, НР Китай