Потенциалът на ваксините на базата на дендритни клетки да модулират популациите на вродени лимфоидни клетки тип 3

Резюме:

Ваксините с дендритни клетки (DC) са вид имунотерапия, която разчита на комуникацията на DC с други аспекти на имунната система. DC са мощни антиген-представящи клетки, участващи в активирането на вродени имунни отговори и образованието на адаптивен имунитет, което ги прави идеални мишени за имунотерапии. Вродените лимфоидни клетки (ILC) са сравнително наскоро идентифицирани в областта на имунологията и имат важна роля в здравето и болестите. Проучванията, описани тук, изследват комуникациите между тип 3 ILCs (ILC3s) и DCs, използвайки миши модел на базирана на DC ваксинация. Бяха наблюдавани локални и системни промени в ILC3 популациите след прилагане на DC ваксина и при заразяване с B16F10 меланомни клетки бяха наблюдавани промени в ILC3 популациите в белите дробове. Взаимодействията между DC и ILC3s трябва да бъдат допълнително проучени, за да се определи потенциалът, който техните комуникации биха могли да имат в здравето, болестите и развитието на имунотерапии.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Ключови думи:

дендритна клетка (DC); тип 3 вродена лимфоидна клетка (ILC3); вродени; комуникация

1. Въведение

Вродените лимфоидни клетки (ILCs) са хетерогенна група от левкоцити, получени от обикновени лимфоидни прогениторни клетки, които имат решаващи функции в развитието на тъканите, възстановяването и хомеостазата. ILC са свързани с различни възпалителни заболявания, включително възпалително заболяване на червата, псориазис, астма и различни автоимунни заболявания [1]. Те обикновено се разделят на три основни групи, тип 1 (ILC1), тип 2 (ILC2) и тип 3 (ILC3), въз основа на експресията на транскрипционни фактори, цитокинови профили и специфични фенотипни маркери [2]. Клетките естествени убийци (NK) понякога се групират като подгрупа на ILC1s поради техните прилики; въпреки това е доказано, че NK клетките имат различни характеристики от ILC1, като експресия на транскрипционен фактор и цитолитична активност, които ги отличават като техен собствен подтип на ILC [3]. Въпреки това, мнозина все още считат NK клетките за подгрупа на ILC1 [4]. Поради подобните си цитокинови профили, транскрипционни фактори и имунологични функции, ILCs (NK клетки, ILC1s, ILC2s и ILC3s) се считат за вродени двойници на компонентите на адаптивната имунна система, отразяваща цитотоксичните Т лимфоцити, Th1, Th2 и Th17 отговори, съответно [4]. Въпреки това, за разлика от Т клетките, те нямат антиген-специфични рецептори [5].

DC са вродени левкоцити, които са критични за индуцирането на имунни отговори и толерантност. Те имат рецептори за разпознаване на образи, които разпознават молекулярни модели, свързани с патогени и/или увреждания, и са най-ефективните антиген-представящи клетки [6]. Чрез представяне на антиген и секреция на цитокини, DCs могат да диктуват съдбата на наивните Т клетки и да индуцират провъзпалителни реакции или имуносупресия. Т клетките могат да бъдат обучени да разпознават антиген като опасен и да го атакуват или като безопасен и да приемат толерогенен фенотип [6]. DC също участват в активирането на вродения имунитет, както и в образованието на адаптивен имунитет. Чрез директен контакт или производството на различни цитокини и разтворими фактори, DC могат да активират други вродени левкоцити и да насърчат вродени имунни отговори [7].

Силата на DC е използвана в имунотерапии като DC ваксини. DC ваксините се приготвят чрез изолиране на DC от пациент или изолиране на DC прекурсори и извличане на DC. Тези DC се манипулират ex vivo, което включва съзряването на DC по имуногенен начин. DC също са заредени със специфични антигени, към които ваксината ще се стреми да развие имуногенни отговори, насочени към [8]. DC ваксините са имунотерапевтична платформа, която се възползва от способността на DC да обучават адаптивната имунна система да индуцира антиген-специфични отговори, особено антиген-специфични цитотоксични Т клетки. Следователно по-голямата част от изследванията на DC ваксините са фокусирани върху капацитета на DCs да образоват адаптивната имунна система. През последните години обаче е доказано, че връзката между DCs и NK клетките има силно влияние върху антитуморния имунитет, което е от решаващо значение за ефикасността на DC ваксинацията [9–11]. Това демонстрира важната необходимост от изследване на други връзки между DCs и различни вродени левкоцити и влиянието, което тези комуникации могат да окажат върху ефикасността на DC ваксините. Тъй като NK клетките са част от семейството на ILC и поради близкото сходство на ILC с Т клетките [5], целта на представените тук изследвания беше да се изследва потенциалната връзка между DC и друг член на семейството на ILC, ILC3s. Използвахме платформа за ваксина DC (moDC), получена от моноцити, където DC бяха генерирани ex vivo от прекурсорни клетки на миши костен мозък. MoDC ваксините са най-често срещаната форма на DC ваксини, тъй като в исторически план те са били най-лесните за производство [12].

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ILC3s имат важни функции в чревната хомеостаза, имунитет срещу извънклетъчни бактерии и развитието на лимфоидни тъкани [5]. ILC3 могат да бъдат подразделени на групи, които се различават по своята експресия на повърхностни маркери и производство на цитокини. Въпреки това, всички ILC3 експресират ROR t [13]. Една подгрупа на ILC3s са ILC3-клетки индуктори на лимфоидна тъкан, които са важни в органогенезата [14]. ILC3 могат също да бъдат подразделени въз основа на експресията на естествен рецептор за цитотоксичност (NCR), която при мишки е експресия на NKp46 [15,16], а при хора е NKp44 [17,18]. Следователно има NCR+ и NCR-ILC3s, които имат разлики в техния функционален капацитет и фенотипни характеристики. Например, предполага се, че NCR+ ILC3s произвеждат IL-22, но не и IL-17, докато NCR− ILC3s могат да произвеждат и двата цитокина [19]. Въпреки това, в скорошно проучване на Fiancette et al., беше показано, че NCR+ ILC3 могат да произвеждат малко количество IL-17 [20]. Ранкин и др. демонстрира при мишки, че NCR+ ILC3s изискват транскрипционния фактор T-bet. Следователно, NCR+/- ILC3s могат да бъдат диференцирани въз основа на NKp46 и T-bet експресия. В проучванията, описани тук, миши ILC3s бяха дефинирани чрез линия−CD45+DX5−ROR t +, като NCR+ ILC3s също бяха T-bet+NKp46+ и NCR−ILC3s бяха T-bet−NKp46 − (Таблица 1 и Приложение A Фигури A1–A3).

Таблица 1. Подгрупи ILC3, определени чрез анализ на поточна цитометрия.

Целта на това изследване беше да помогне да се изясни дали има комуникация между DC ваксини и ILC3s и потенциала, който техните взаимодействия биха могли да имат в DC имунотерапиите. Доказано е, че ILC3 имат роля при различни заболявания и рак и следователно имат потенциал в различни имунотерапевтични контексти. ILC3 са сравнително нови за сцената на имунологията и в резултат на това влиянието им върху болестите и леченията е изследвано ограничено. ILC3 реагират на външни стимули, които ще диктуват техните дейности и дали насърчават прогресията или потискането на тумори [21,22]. Подобно на Th17 клетките, ILC3 имат транскрипционния фактор ROR t и произвеждат цитокини в отговор на Th17 като IL-17 и IL-22. IL-22 е важен за контролиране на бактериални инфекции в червата [16]. Въпреки това, в модел на индуциран от бактерии рак на дебелото черво, беше демонстрирано, че IL-17 и IL-22 от ILC в дебелото черво допринасят за развитието на рак на дебелото черво [23]. Освен това, ILC3s са свързани с отрицателни резултати при рак на гърдата [24]. Обратно, наблюдава се връзка между NCR+ ILC3s и третичните лимфоидни структури (TLS) и по-добри клинични резултати при недребноклетъчен рак на белия дроб [18]. Освен това, скорошно проучване изследва ILC3 при колоректален рак. Проучването наблюдава увеличение на ILC1s и намаление на ILC3s в проби от пациенти с резецирани колоректални тумори в сравнение със съвпадащи незлокачествени съседни тъкани. Секвенирането на РНК и транскрипционното профилиране разкриха, че ILC3s имат повишена пластичност и различен функционален капацитет в колоректалните тумори в сравнение с незлокачествените тъкани. Интересното е, че секвенирането на РНК също така предполага, че инфилтриращите тумора ILC3s имат повишена пластичност, за да преминат към ILC1 фенотип. Проучването наблюдава, че взаимодействията на ILC3 с Т клетки поддържат имунитет тип I, а при колоректален рак тези взаимодействия са ограничени, което възпрепятства антитуморните реакции. Това поддържа важна функция за ILC3s в антитуморния имунитет. Като цяло, документът демонстрира значителните роли, които ILC3 имат в регулирането на имунологичната хомеостаза и колоректалния рак [25]. Следователно се счита, че ILC3 имат двойна роля в здравето и болестта. Те могат да насърчат прогресията на рака [23,24,26], но също така могат да допринесат за противотуморни отговори [18,25,27,28]. Техният фенотип и принос към рака изглежда са контекстуални, което показва потенциал за манипулиране на ILC3s чрез имунотерапия, за да се получи фенотип, който подпомага противораковите реакции, вместо да поддържа прогресията на тумора. По този начин базираните на DC ваксини представляват възможен метод за повлияване на туморната микросреда чрез манипулиране на ILC фенотипове и тяхното производство на цитокини, което би позволило адаптиране на имунния отговор в зависимост от обстоятелствата и би могло да бъде полезно при изследване на рака.

Тъй като има ограничени изследвания на комуникациите между DCs и ILC3s, особено в контекста на DC ваксинация, проучванията, описани тук, изследват промените в ILC3 популациите след прилагането на ваксина, базирана на DC, на мишки. В тази статия се наблюдава комуникация между базирана на DC ваксина и ILC3s, което беше показано чрез продължително влияние на ваксината върху ILC3 отговорите за най-малко 10 дни след имунизацията.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

2. Резултати

2.1. Броят както на NCR+, така и на NCR− ILC3s се увеличава в локалния дрениращ лимфен възел след приложение на DC ваксини 

Беше приготвена DC ваксина чрез диференциране на DC от клетки, получени от миши костен мозък ex vivo. Тези DC бяха стимулирани да насърчават тяхното съзряване, така че да придобият имуногенен фенотип. След това DC бяха заредени с пептид. Тъй като това изследване се фокусира върху естеството на комуникацията между два вродени левкоцита, DCs и ILC3s, пептидът, избран за производството на ваксината, умишлено не е от значение за нашия биологичен модел, за да се избегне превръщането на антиген-специфични Т клетки в объркваща променлива. Следователно, DC ваксината е заредена с пептид, получен от пилешки овалбумин.

За да започнем да изследваме дали DC ваксинацията влияе върху популациите на ILC3, първо оценихме дали има разлики в клетъчността в близост до мястото на ваксинация. Имаше промени в локалния дрениращ лимфен възел след DC ваксинация, което включваше увеличаване на броя на ILC3s (Фигура 1). Кинетиката на нарастването на ILC3s показва, че ILC3s постепенно се увеличават след DC ваксинация (Фигура 1b, c). Броят на NCR+ и NCR− ILC3s в локалния дрениращ лимфен възел беше оценен и двете субпопулации се увеличиха след прилагането на DC ваксината. Въпреки че и NCR+, и NCR− ILC3 популациите достигнаха своя връх три дни след DC ваксинацията, NCR− ILC3s се върнаха към хомеостатични числа седем дни след имунизацията, докато броят на NCR+ ILC3s остана значително по-висок в сравнение с фиктивно третирани контролни мишки.

Фигура 1. Броят на естествените рецептори за цитотоксичност (NCR)+ и NCR− тип 3 вродени лимфоидни клетки (ILC3s) се увеличава в локалния дрениращ лимфен възел след DC имунизация. Женски C57BL/6 мишки бяха инокулирани с DC ваксини чрез инжекции в задната подложка. Подколенните лимфни възли бяха изследвани за ILC3 популации. ( а ) Определя се общият брой клетки в лимфния възел. Натрупване на (b) NCR− ILC3s и (c) NCR+ ILC3s в лимфния възел и процентът на CD{{10}} клетки в лимфния възел, които са били (d) NCR− ILC3s и (e) NCR+ ILC3s. Всяка лента представлява данни от четири подколенни лимфни възли. T-тест на Стюдънт беше използван във всяка времева точка за определяне на значителни разлики между контролните мишки, инокулирани с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и мишките, инокулирани с DC ваксина (p-стойности * < 0.{{ 21}}5, ** < 0.005, *** < 0,0005 и **** < 0,0001). Представителни точкови диаграми, показващи средния брой (f) NCR− ILC3s и (g) NCR+ ILC3s в дрениращия подколенен лимфен възел. Графиките показват средната стойност със стандартното отклонение.

2.2. DC ваксините повишават производството на ILC3 цитокини в далака, без да променят общия брой ILC3s на далака

След това системните промени в популациите на ILC3 бяха изследвани чрез оценка на далака, който е най-големият вторичен лимфоиден орган [29], една седмица след DC ваксинацията, което е стандартната времева точка на нашата лаборатория за системна оценка на промените в левкоцитите. Не се наблюдава значителна разлика в общия брой на NCR+ или NCR− ILC3s в далака (Фигура 2).

Фигура 2. Няма промени в броя на ILC3s на далака след DC имунизация. Женски C57BL/6 мишки (n=8 [PBS] или 10 [DC]) бяха инокулирани с DC ваксини чрез инжекции в задните крака. Далаците се събират една седмица след инокулацията и се изследват за ILC3 популации. Общият брой на (a) NCR− ILC3s в далака и (b) NCR+ ILC3s (и средната геометрична флуоресцентна интензивност на T-bet за NCR+ ILC3s) и процентът CD45+ клетки на далака, които са (c) NCR− ILC3s и (d) NCR+ ILC3s бяха наблюдавани и количествено определени чрез анализ на поточна цитометрия. Използван е t-тест на Student за определяне на значимостта между популациите в контролните мишки, инокулирани с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и мишките, инокулирани с DC. Средствата не се различават значително. Представителни точкови графики, показващи средния брой на далака (e) NCR− ILC3s и NCR+ ILC3s. Стандартното отклонение и средната стойност са представени от лентите на графиката и лентите за грешки.

Тъй като ILC3 цитокиновите профили могат да бъдат повлияни от фактори на околната среда, производството на ILC3 на IL-22 и IL-17 в далака беше измерено една седмица след DC ваксинация. Имаше увеличение на ILC3s, произвеждащи IL-17 или IL-22 или и двата цитокина при мишки, третирани с DC ваксини, в сравнение с контролните мишки (Фигура 3).

Фигура 3. Имаше увеличение на ILC3s на далака, произвеждащи IL-17 и IL-22 след DC имунизация. Женски C57BL/6 мишки (n=12–18) бяха инокулирани с DC ваксини чрез инжектиране на задната подложка. Контролните мишки бяха третирани с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Една седмица след имунизацията, далаците бяха събрани и изследвани за IL-17- и IL{{10}}продуциращи ILC. Броят на линията-CD127+DX5- клетки, произвеждащи (a) IL-17, (b) IL-22, и (c) както IL-17, така и IL{{ 16}} и съответните им средни геометрични флуоресцентни интензитети бяха определени с помощта на вътреклетъчно оцветяване с цитокини и поточна цитометрия. Данните бяха анализирани с помощта на двупосочен ANOVA тест (p-стойности * < 0.05, ** < 0.005). (d) Представителните точкови диаграми показват средния брой CD45+ линия-CD127+DX5− клетки на далака, произвеждащи IL-17 и/или IL-22. Графиките показват средната стойност със стандартното отклонение.

2.3. ILC3 субпопулации след DC имунизация и заразяване с B16F10 меланомни клетки

ILC3 могат да играят двойна роля в прогресията на рака, като допринасят както за про-, така и за антитуморогенни отговори [22]. Следователно е изследвано влиянието на DC ваксинацията върху ILC3 отговорите в контекста на рак. Мишките бяха третирани с DC ваксини и една седмица по-късно те бяха заразени интравенозно с B16F10 меланомни клетки, което доведе до засяване на белите дробове. Както бе споменато, тъй като бяха оценени само компоненти на вродения имунитет, антиген-специфичното образование от ваксината не трябваше да бъде оценено в нашите експерименти и следователно, използваният модел на меланома не експресира овалбумин, което прави пептида зареден върху DCs неуместен. Кинетичният експеримент (Фигура 1) показа, че локалните отговори на ILC3s могат да бъдат наблюдавани в рамките на три дни. Следователно, три дни след предизвикването, броят на ILC3 субпопулациите и тяхната способност да произвеждат цитокини бяха изследвани в далака и белите дробове. Подобно на това, което се наблюдава в далаците на нелекувани мишки, няма значителна разлика в общия брой NCR+ и NCR− ILC3s на далака между контролната група и DC-имунизираната група (Фигура 4). Въпреки това, за разлика от наивния модел, в далака вече няма промени в производството на IL-17 и/или IL-22 (Фигура 5).

Фигура 4. Няма промяна в общия брой ILC3 на далака след DC ваксинация и заразяване с B16F10 меланомни клетки. Женски C57BL/6 мишки (n=10) бяха инокулирани с DC ваксини чрез инжектиране на задна подложка и една седмица по-късно на мишките бяха приложени 3 × 105 B16F10 клетки чрез инжекция в опашната вена. Далаците бяха събрани и изследвани за натрупване на ILC3 популации три дни след прилагането на B16F10. Броят на далачните (a) NCR− ILC3s и (b) NCR+ ILC3s (и средната геометрична флуоресцентна интензивност на T-bet за NCR+ ILC3s) и процентът на далачните CD45+ клетки, които са (c) NCR− ILC3s и (d) NCR+ ILC3s бяха наблюдавани и количествено определени чрез поточна цитометрия. Използван е t-тест на Student за определяне на значимостта между популациите в контролните мишки, третирани с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и DC-инокулираните мишки. Средствата не се различават значително. Представителни точкови диаграми показват средния брой на далака (e) NCR− ILC3s и NCR+ ILC3s. Средното и стандартното отклонение са представени с лентови графики и ленти за грешки.

Фигура 5. Няма промяна в броя на далачните IL-17 и/или IL-22-продуциращи ILCs след DC ваксинация и заразяване с B16F10 меланомни клетки. Женски C57BL/6 мишки (n=10) бяха инокулирани с DC ваксини чрез инжектиране на задната подложка и една седмица по-късно 3 × 105 B16F10 клетки бяха приложени интравенозно. Три дни по-късно далаците бяха събрани и изследвани за производство на ILC3 цитокини. Броят на родословните CD127+DX5- клетки, произвеждащи (a) IL-17, (b) IL-22, и (c) както IL-17, така и IL-22 и съответните им средни геометрични флуоресцентни интензитети бяха определени с помощта на вътреклетъчно оцветяване с цитокини и поточна цитометрия. Данните бяха анализирани с помощта на двупосочен ANOVA тест и не беше открита значителна разлика между мишките, ваксинирани с DC и третираните с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) контроли. (d) Представителни точкови диаграми показват средния брой CD45+линея CD127+DX5- клетки на далака, произвеждащи IL-17 и/или IL-22.

Интравенозното инжектиране на B16F10 клетки през опашната вена е често срещан миши модел на синтетични меланомни метастази в белите дробове [30]. Следователно, белите дробове също бяха изследвани, за да се определи броят на ILC3 субпопулациите и да се оцени тяхното производство на цитокини.

Имаше намаляване на броя на NCR− ILC3s със съпътстващо увеличение на броя на NCR+ ILC3s (Фигура 6). Въпреки това, не е наблюдаван ефект от DC ваксинацията върху ILC3-медиираната продукция на цитокини в белите дробове (Фигура 7).

Фигура 6. След DC имунизация и предизвикване с B16F10 клетки, имаше числени промени в ILC3 субпопулациите в белите дробове. Женски C57BL/6 мишки (n=10) получиха DC ваксини чрез инжектиране на задна подложка и една седмица по-късно 3 × 105 B16F10 клетки бяха приложени интравенозно. Три дни след предизвикването, белите дробове бяха изследвани с помощта на поточна цитометрия за броя на (a) NCR− ILC3s и (b) NCR+ ILC3s (и средната геометрична флуоресцентна интензивност на T-bet за NCR+ ILC3s) и процента на CD{ {18}} клетки, които са (c) NCR− ILC3s и (d) NCR+ ILC3s. Използван е t-тест на Student за определяне на значимостта между субпопулациите в контролните мишки, третирани с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и DC-инокулираните мишки (p-стойности *<0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

Фигура 7.Нямаше промяна в броя на ILC3s, произвеждащи IL-17 и/или IL-22 в белите дробове след DC ваксинация и заразяване с B16F10 меланомни клетки. Женски C57BL/6 мишки (n=10) бяха инокулирани с DC ваксини чрез инжектиране на задна подложка и една седмица по-късно им бяха приложени интравенозно 3 × 105 B16F10 клетки. Три дни по-късно белите дробове бяха събрани и изследвани за ILC3-медиирано производство на цитокини. Броят линии-CD127+DX5− клетки, произвеждащи (a) IL-17, (b) IL-22 и (c) както IL{{0}}, така и IL-22 и техните съответни средни геометрични флуоресцентни интензитети бяха определени с помощта на вътреклетъчно оцветяване с цитокини и поточна цитометрия. Данните бяха анализирани с помощта на двупосочен ANOVA тест (p-стойности *** <0,0005). Няма значителна разлика в общия брой на IL-22-произвеждащи, IL-17-продуциращи и IL-22 и IL-17 мулти-цитокин-продуциращи линии-CD{{ 12}}DX5− клетки. (d) Представителни точкови диаграми, показващи средния брой белодробни CD45+ линия−CD127+DX5− клетки, произвеждащи IL-17 и/или IL-22. Стандартното отклонение и средната стойност са представени от лентите на графиката и лентите за грешки.

3. Дискусия

Проучванията, описани тук, се стремят да изследват потенциални комуникации между ILC3 и DC в контекста на DC ваксина. Имаше увеличения в броя както на NCR+, така и на NCR− ILC3 субпопулациите в дрениращите лимфни възли (Фигура 1) след DC ваксинация, което предполага локална комуникация между DC ваксината и ILC3 субпопулациите. Въпреки това, комуникацията между DCs и NCR+ ILC3 има по-дълготрайно влияние върху общия брой на NCR+ ILC3s от наблюдаваното между DCs и NCR− ILC3s. Това показва, че DC могат да имат уникални взаимодействия с ILC3 в зависимост от тяхната експресия на NCR. Не се наблюдава промяна в броя на ILC3 субпопулациите в далака седем дни след DC ваксинация (Фигура 2) или десет дни след DC ваксинация и три дни след предизвикване на B16F10 меланомни клетки (Фигура 4). Нашите методи за анализ на ILC3s за тяхното производство на IL-17 и IL-22 имат ограничение, тъй като те показват както транслационните, така и транскрипционните отговори, дължащи се на in vitro рестимулация на клетките. Ние обаче добавихме експериментална контрола във всички експерименти, което би било лечението без стимулация in vitro, за да се открие какво произвеждат ILC3s в отговор на сигнала, получен in vivo. Както е показано на фигури 3d, 5d и 7d, клетките, които не са получили in vitro стимулация, произвеждат IL-17 и IL-22. В допълнение, въпреки че броят на ILC3 клетките на далака не се променя (Фигура 2), производството на цитокини от ILC3 субпопулациите е различно седем дни след DC ваксинацията (Фигура 3). Това предполага, че DC ваксинацията може да повлияе на функционалността на ILC3 отговорите, без да ги засяга числено. Тъй като са компоненти на вродената имунна система, трафикът на ILC3s в и извън тъканите може да е настъпил в рамките на няколко дни, следователно предотвратявайки откриването на модулирани от лечението числени разлики седем до десет дни след DC ваксинацията. Доказателство за това се наблюдава в дрениращия DC-ваксина лимфен възел, където броят на ILC3s се увеличава в продължение на три дни и след това започва да намалява (Фигура 1). По този начин може да е имало числени промени в ILC3 субпопулациите в далака, които са били пропуснати, защото са се върнали към хомеостатични числа от седмия ден след имунизацията с DC. Независимо от това, проучванията бяха фокусирани върху по-дълготрайни реакции, за разлика от краткосрочните преходни реакции и следователно не изследваха допълнително този път. Интересно е, че въпреки че броят на субпопулациите ILC3 на далака не се различава от контролните групи, техните цитокинови профили са променени (Фигура 3). Производството на IL-22 и IL-17 беше повишено в ILC3s на далака, като по този начин демонстрира, че DC ваксинацията има системен ефект върху ILC3s. В обобщение, DC ваксинацията не е повлияла на количеството ILC3 на далака, но е повлияла на тяхната функционалност.

Въпреки че имаше продължителен ефект върху производството на цитокини, получени от ILC3-, седем дни след DC имунизация в далаците на мишки без тумор, това влияние върху ILC3s в далака беше неоткриваемо три дни след интравенозно заразяване с B16F10 меланомни клетки ( Фигура 5). Изглежда, че DC ваксината подхранва популациите ILC3 в модела без тумор, който е потиснат при предизвикване на тумор. Тъй като ILC са силно повлияни от тяхната среда, това може да предполага, че комуникациите между DC във ваксината и ILC3s са били ограничени до модела без тумор. Обратно, това може да се дължи и на мобилизирането на първични ILC3s към други места в тялото, където B16F10s може да са се събрали и да са създали микросреда, която индуцира набиране на левкоцити.

Имаше промяна в ILC3 субпопулациите, наблюдавани в белите дробове десет дни след DC ваксинация и три дни след B16F10 клетъчно провокиране в сравнение с не-DC-ваксинирани контролни мишки, които получиха само приложение на B16F10 клетки. По-конкретно, има увеличение на броя на NCR+ ILC3s и намаляване на NCR− ILC3s в белите дробове (Фигура 6). T-bet е транскрипционен фактор, който е свързан с Th1 отговорите [31]. Следователно увеличението на NCR+ ILC3s, които експресират T-bet, показва потенциално насърчаване на имунитет тип 1. Това може да бъде полезен ILC3 отговор в контекста на рак, където обикновено са желани имунни отговори от тип 1.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Показано е, че NCR+ ILC3s могат да произлязат от подгрупа на NCR− ILC3s [16]. Следователно, увеличаването на NCR+ ILC3s и намаляването на NCR− ILC3s може да се отдаде на стимулация, която индуцира превключване в NCR− ILC3s, за да стане NCR+ ILC3s. Ако ILC3s са били подложени на фенотипно превключване от NCR− към NCR+, те може да не са успели да произведат цитокини по време или малко след превключването и докато се приспособяват към околната среда и новия си фенотип. Следователно тяхното производство на цитокини може да е било спряно или забавено, докато е настъпвала смяна на фенотипа, което би могло да обясни защо няма промени в ILC3-медиираната продукция на IL-17 и/или IL-22 в белите дробове (Фигура 7). Възможно е също така, че DC ваксинацията просто не е повлияла на производството на цитокини от ILC3s в белите дробове в този момент.

4. Материали и методи

Етично одобрение

Всички изследвания върху мишки са извършени в съответствие с протокола за използване на животни #3807 под наблюдението на персонала, който се грижи за животните в университета на Гуелф.

мишки

Женски C57BL6 мишки бяха получени от Charles River Laboratories на възраст от пет до осем седмици. Мишките бяха настанени в контролирана среда в отделението за изолация на животни на университета в Гуелф и им беше дадена една седмица да се аклиматизират преди началото на експериментите. Мишките се хранят и им се дава вода ad libitum.

Дендритни клетъчни култури

Бедрените кости и пищялите на женски мишки C57BL6 бяха събрани и краищата на костите бяха отрязани. Като се използва спринцовка, костният мозък на пищялите и бедрените кости се промива с PBS в петриево блюдо. Костният мозък се ресуспендира в едноклетъчна суспензия и се преброява с помощта на хемоцитометър. След това клетките се ресуспендират в среда (RPMI [HyClone Cat# SH30027.01] с 2-меркаптоетанол [Gibco Ref# 21985-023], 1% пеницилин/стрептомицин [HyClone Cat# SV30010] и 10% фетален говежди серум [VWR Cat#97068-085]) до концентрация от 1,25 × 106 клетки на mL, допълнен с 20 ng/mL гранулоцитно-макрофагов колониостимулиращ фактор (GM-CSF) (Biolegend Cat#576308) и аликвотирани в 25 cm2 културални колби, 5 mL на колба. Културите се поставят във влажни инкубатори при 37 ◦C с 5% CO2 и се оставят да растат в продължение на 7 дни. На втория ден от култивирането се добавят 5 mL свежа среда с 20 ng/mL GM-CSF. На петия ден 5 mL от всяка култура се центрофугират и супернатантата се отстранява. Клетките бяха ресуспендирани в 5 mL прясна среда с 20 ng/mL GM-CSF и повторно добавени към колбите за култура. Културите се събират на 7-ия ден и се подготвят за ваксиниране.

Препарат за ваксиниране на дендритни клетки

Културите на дендритни клетки (DC) се прехвърлят в 50 mL конична епруветка и се преброяват с помощта на хемоцитометър. Клетките бяха стимулирани със 100 ng/mL липополизахарид (LPS) от Escherichia coli O55:B5 (Sigma Cat#L2880) и 1 µg/mL пилешки овалбумин (OVA) 257–264 (SIIN) (PepScan Systems, Lelystad, Холандия) за 1 час в инкубатор при 37 ◦C с 5% CO2. След това клетките се промиват с PBS три пъти и се ресуспендират до концентрация от 5 × 105 клетки на 30 µL. Ваксините се прилагат в дози от 5 × 105 клетки на 30 µL PBS.

Обработка на тъкани

Лимфните възли и далаците бяха събрани и поставени в петриеви панички с 2 mL буфериран физиологичен разтвор на Hanks (HBSS). Те бяха пресовани в едноклетъчни суспензии с помощта на гърба на 3 ml запушалка на спринцовка. Едноклетъчните суспензии се филтруват в 50 mL конична епруветка с помощта на клетъчна цедка с размер на порите 70 µm. Лимфните възли се преброяват с помощта на хемоцитометър. Далаците се центрофугират, супернатантата се отстранява и клетките се ресуспендират в ACK лизисен буфер (8,29 g NH4Cl [0.15 M], 1 g KHCO3 [10,0 mM], 37,2 mg Na2EDTA [0,1 mM] в 1 ml Milli Q вода) и се оставя да престои пет минути, за да се лизират еритроцитите. Клетките бяха промити с HBSS два пъти преди да бъдат ресуспендирани в среда и преброени с помощта на хемоцитометър.

Белите дробове бяха събрани и претеглени преди да бъдат поставени в епруветка gentleMACSTM, съдържаща 1 mg/mL колагеназа IV (Gibco Ref#17104-019) и 5 ​​µg/mL DNase I (Roche Ref#11284932001) в HBSS. Използвайки gentleMACSTM дисоциатор, пробите бяха прекарани през белодробен протокол А и след това инкубирани в продължение на 20 минути в инкубатор при 37 ◦C с 5% CO2. След това пробите бяха прекарани през белодробен протокол B на gentleMACSTM дисоциатора. Двойният обем на пробата от HBSS се добавя към пробите за неутрализиране на ензимната реакция. Пробите се филтруват в 50 mL конична епруветка през клетъчна цедка с размер на порите 70 µm. След това клетките се промиват два пъти с HBSS и се ресуспендират в ACK лизисен буфер. След пет минути в ACK лизисен буфер, клетките се промиват два пъти с HBSS и се ресуспендират в среда.

Анализ на цитокиновия отговор

Едноклетъчните суспензии от тъканните проби се посяват в 96-плаки с ямки в два екземпляра, където една ямка се третира като контрола без стимулация, а другата ямка се третира със стимулант. Нестимулираните ямки получават само среда, а третираните със стимуланти ямки получават 10 ng/mL форбол миристат ацетат (PMA) и 1500 ng/mL йономицин в среда. Клетките се поставят в инкубатор при 37 ◦C с 5% CO2 за един час. След това, Brefeldin A (GolgiPlug, Biolegend Cat#420601) (×100 разреждане) се добавя към всички ямки с пробата и плаката се поставя обратно в инкубатора за още четири часа. След това клетките се промиват два пъти с PBS и се оцветяват за анализ чрез поточна цитометрия.

B16F10 меланомни клетки

Клетките B16F10 се размразяват от течен азот и се преброяват с помощта на хемоцитометър. След това клетките се ресуспендират в среда (среда Eagles, модифицирана с високо съдържание на глюкоза на Dulbecco [HyClone Cat#SH3002201] с 1% пеницилин/стрептомицин [HyClone Cat# SV30010] и 10% говежди телешки серум [VWR Cat#10158-358]), за да концентрация от 1 × 105 клетки на ml. След това клетките B16F10 се разделят на аликвотни части в колби за култура и се поставят в инкубатор при 37 °C с 5% CO2. За да се подготвят клетките B16F10 за администриране, клетките се прехвърлят от колбите за култура в 50 mL конична епруветка, промиват се с PBS и след това се ресуспендират в PBS. Клетките бяха преброени с помощта на хемоцитометър и ресуспендирани в PBS, за да се получат дози от 3 × 105 клетки на 200 µL.

Оцветяване на вътреклетъчни цитокинови антитела

Клетките се посяват в {{0}}плаки с ямки и се ресуспендират в Fc блок (анти-CD16/CD32, BioLegend Cat#101320) и се инкубират при 4 ◦C за 15 минути. Клетките се промиват два пъти с буфериран с фосфат физиологичен разтвор, съдържащ 0,5% говежди серумен албумин (FACS буфер), след което се суспендират повторно в основна смес от антитела, оцветяващи клетъчната повърхност (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46, BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat #108919; CD127, BioLegend Cat #135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat #133311) и се инкубира при 4 градуса за 20 минути. Клетките бяха промити с фосфатно буфериран физиологичен разтвор два пъти и ресуспендирани в Zombie Aqua Fixable viability dye (FVD) (BioLegend Cat#423101) и инкубирани при 4 ◦C за 30 минути. Фосфатно буфериран физиологичен разтвор се използва за промиване на клетките два пъти преди повторно суспендиране във фиксиращ буфер (BioLegend Cat#420801). Клетките се инкубират при 4 ◦C за 20 минути. След фиксиране, клетките се промиват два пъти с пермеабилизиращ буфер (BioLegend Cat#421002). Клетките се ресуспендират в основна смес от вътреклетъчно оцветяващи антитела (IL-22, BioLegend Cat#516404; IL-17A, eBioscience Cat# 17-7177-81) и се инкубират при 4 ◦C за 20 мин. Клетките се промиват два пъти с пермеабилизиращ буфер, след това се ресуспендират в FACs буфер и след това се обработват с BD FACSCantoTM II поточен цитометър и се анализират с помощта на BD FACSDivaTM софтуер.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Оцветяване на антитела на транскрипционен фактор

Клетките се посяват в {{0}}плаки с ямки и се ресуспендират в FC блок (анти-CD16/CD32 BioLegend Cat# 101320) и се инкубират при 4 ◦C за 15 минути. Клетките се промиват два пъти с FACs буфер (0,5% в говежди серумен албумин [HyClone Cat# SH30574.02] в PBS), след което се ресуспендират в основна смес от антитела, оцветяващи клетъчната повърхност (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46 , BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat#108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311), и се инкубира при 4 ◦C за 20 минути. След това клетките се промиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор два пъти, ресуспендиран в FVD (BioLegend Cat # 423101) и се инкубират при 4 ° С за 20 минути. Клетките се промиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор два пъти и се ресуспендират в миши FoxP3 буфер за фиксиране (BD Pharmingen BD Sciences Cat#51-9006124) и се инкубират при 4 ◦C за 30 минути. След фиксиране, клетките се промиват с миши FoxP3 пермеабилизиращ буфер (BD Pharmingen BD Sciences Cat# 51-9006125), ресуспендиран в FoxP3 пермеабилизиращ буфер, и се инкубират при 37 ◦C за 30 минути. Клетките бяха ресуспендирани в антитела на транскрипционен фактор (ROR gamma(t), eBioscience Cat#17-6988-82; T-bet, eBioscience Cat# 12-5825-82) и инкубирани при 4 ◦C за 20 минути. Клетките се промиват два пъти с пермеабилизиращ буфер, след това се ресуспендират в FACs буфер и се анализират с помощта на BD FACSCantoTM II поточен цитометър и BD FACSDivaTM софтуер.

Статистически анализ

Далачните и белодробните популации на NCR+ и NCR− ILC3s бяха анализирани с помощта на несдвоени t-тестове. Анализът на популацията на кинетичния експеримент беше сравнен с помощта на обикновен еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) и теста за множествено сравнение на Tukey. Анализът на цитокини в далака и белите дробове беше изследван с помощта на двупосочен ANOVA и теста за множество сравнения на Šidák. Средните стойности за групите на лечение бяха определени като значително различни с p-стойност < 0.05.

Гейт стратегия

Първо, използвайки зоната на разсейване напред (FSC-A) и зоната на странично разсейване (SSC-A), лимфоцитите бяха затворени. След това дублетните клетки бяха изключени с помощта на FSC-A и FSC-височина (FSC-H). Живите клетки бяха затворени чрез вземане на клетки, отрицателни за FVD. След това бяха взети CD127+ и клетки от коктейлни линии, за да се стеснят ILC. След това клетките CD45+ бяха затворени. За да се гарантира, че всички NK клетки са изключени, DX5− след това се включва. За идентифициране на транскрипционен фактор на ILC3s, ROR t + клетки след това бяха затворени и от тези клетки NCR+ ILC3s бяха T-bet+ и NKp46+ и NCR− ILC3s бяха T-bet− и NKp46. За идентифициране на цитокини, след стробиране на лимфоцити, единични клетки, живи клетки и CD127+ линия-CD45+, IL-17 и IL-22 бяха след това стробирани като се произвеждат от ILC3s, тъй като ILC3s биха били единствените клетки в тази последна врата, които биха могли да произвеждат IL-22 и IL-17.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

5. Изводи

Въпреки че повишеното производство на IL-17 и IL-22, получено от ILC3- в далака, наблюдавано в модела без тумор, беше загубено в модела на туморно предизвикателство, имаше противоположна промяна в NCR+ и NCR− ILC3 популации в белите дробове. Това предполага, че DC ваксинацията може да е повлияла на ILC3s в модела на туморно предизвикателство, както и в мишки без тумор. Въпреки това, ефектът от тази връзка между DCs във ваксината и ILC3s върху антитуморните отговори остава неизвестен и е бъдеща посока на изследване. По този начин, описаните тук проучвания показват, че има комуникации, възникващи между базирани на DC ваксини и ILC3 субпопулации, както при мишки без тумор, така и при мишки, носещи тумор. Тези комуникации и техните последващи въздействия върху имунните отговори изглеждат сложни. Тези наблюдения допринасят за обема от литература, която се стреми да дешифрира връзката между DC ваксини и ILC3s в опит да се разработят подобрени стратегии за DC ваксинация. Препоръчваме допълнителни проучвания, изследващи потенциала за проектиране на стратегии за ваксиниране, които могат да модулират тези комуникации, за да оптимизират ILC3 отговорите, за да подпомогнат антитуморните отговори и да ограничат подкрепата на протуморните отговори.

Препратки

1. Криние, А.; Vivier, E.; Bléry, M. Хелпер-подобни вродени лимфоидни клетки и имунотерапия на рак. Семин. Immunol. 2019, 41, 101274. [CrossRef] [PubMed]

2. Салими, М.; Wang, R.; Яо, X.; Ли, X.; Уанг, X.; Hu, Y.; Чанг, X.; Фен, П.; Донг, Т.; Ogg, G. Активираните вродени лимфоидни клетъчни популации се натрупват в човешки туморни тъкани. BMC Cancer 2018, 18, 341. [CrossRef] [PubMed]

3. Спитс, Х.; Bernink, JH; Lanier, L. NK клетки и тип 1 вродени лимфоидни клетки: Партньори в защитата на гостоприемника. Нац. Immunol. 2016, 17, 758–764. [CrossRef] [PubMed]

4. Bruchard, M.; Ghiringhelli, F. Дешифриране на ролите на вродените лимфоидни клетки при рак. Преден. Immunol. 2019, 10, 656. [CrossRef]

5. Мазурана, Л.; Рао, А.; Ван Акер, А.; Mjösberg, J. Ролята на вродените лимфоидни клетки в човешката имунна система. Семин. Имунопатология. 2018, 40, 407–419. [CrossRef]

6. Solano-Gálvez, SG; Товар-Торес, SM; Трон-Гомез, MS; Weiser-Smeke, AE; Álvarez-Hernández, DA; Франюти-Кели, Джорджия; Tapia-Moreno, M.; Ибара, А.; Gutiérrez-Kobeh, L.; Vázquez-López, R. Човешки дендритни клетки: онтогенеза и техните подгрупи в здравето и болестта. Med. Sci. 2018, 6, 88. [CrossRef]

7. Steinman, RM; Hemmi, H. Дендритни клетки: Превеждане на вроден към адаптивен имунитет. Curr. Връх. Microbiol. Immunol. 2006, 311, 17–58. [CrossRef]

8. Fu, C.; Ма, Т.; Джоу, Л.; Mi, QS; Jiang, A. Дендритни клетъчни ваксини срещу рак: Предизвикателства, напредък и бъдещи възможности. Immunol. разследване. 2022, 51, 2133–2158. [CrossRef]

9. Карими, К.; Boudreau, JE; Фрейзър, К.; Liu, H.; Delanghe, J.; Gauldie, J.; Xing, Z.; Брамсън, JL; Wan, Y. Подобреният антитуморен имунитет, предизвикан от дендритни клетъчни ваксини, е резултат от способността им да ангажират както CTL, така и IFN-продуциращи NK клетки. Mol. Там. 2008, 16, 411–418. [CrossRef]

10. Бауър, Алабама; Saunderson, SC; Колдуел, FJ; Дамани, TT; Pelham, SJ; Дън, AC; Джак, RW; Stoitzner, P.; McLellan, AD NK клетки са необходими за имунотерапия на базата на дендритни клетки по време на туморно предизвикателство. J. Immunol. 2014, 192, 2514–2521. [CrossRef]

11. Пампена, MB; Levy, EM Естествени клетки убийци като помощни клетки във ваксини срещу рак на дендритни клетки. Преден. Immunol. 2015, 6, 13. [CrossRef] [PubMed]

12. Гарднър, А.; де Минго Пулидо, А.; Ruffell, B. Дендритни клетки и тяхната роля в имунотерапията. Преден. Immunol. 2020, 11, 924. [CrossRef] [PubMed]

13. Кортез, VS; Robinette, ML; Colonna, M. Вродени лимфоидни клетки: Нови прозрения за функцията и развитието. Curr. мнение Immunol. 2015, 32, 71–77. [CrossRef] [PubMed]

14. Монталдо, Е.; Юелке, К.; Romagnani, C. Група 3 вродени лимфоидни клетки (ILC3s): Произход, диференциация и пластичност при хора и мишки. Евро. J. Immunol. 2015, 45, 2171–2182. [CrossRef]

15. Вака, П.; Chiossone, L.; Мингари, MC; Moretta, L. Хетерогенност на NK клетки и други вродени лимфоидни клетки в човешки и миши децидуа. Преден. Immunol. 2019, 10, 170. [CrossRef] [PubMed]

16. Ранкин, LC; Girard-Madoux, MJ; Seillet, C.; Миелке, Луизиана; Kerdiles, Y.; Фенис, А.; Wieduwild, E.; Putoczki, T.; Мондо, С.; Ланц, О.; et al. Допълване и излишък на IL-22-продуциращи вродени лимфоидни клетки. Нац. Immunol. 2016, 17, 179–186. [CrossRef] [PubMed]

17. Хоорвег, К.; Peters, CP; Cornelissen, F.; Апарисио-Доминго, П.; Папазян, Н.; Kazemier, G.; Mjösberg, JM; Spits, H.; Cupedo, T. Функционални разлики между човешки NKp44(-) и NKp44(+) RORC(+) вродени лимфоидни клетки. Преден. Immunol. 2012, 3, 72. [CrossRef]

18. Карега, П.; Лояконо, Ф.; Ди Карло, Е.; Scaramuccia, A.; Мора, М.; Конте, Р.; Бенели, Р.; Spaggiari, GM; Cantoni, C.; Кампана, С.; et al. NCR(+)ILC3 се концентрира върху човешки рак на белия дроб и е свързан с интратуморни лимфоидни структури. Нац. Общ. 2015, 6, 8280. [CrossRef]

19. Спитс, Х.; Артис, Д.; Колона, М.; Diefenbach, A.; Ди Санто, Япония; Eberl, G.; Коясу, С.; Локсли, РМ; McKenzie, AN; Мебиус, RE; et al. Вродени лимфоидни клетки - предложение за единна номенклатура. Нац. Rev. Immunol. 2013, 13, 145–149. [CrossRef]

20. Годеница, Р.; Finlay, CM; Willis, C.; Bevington, SL; Soley, J.; Ng, STH; Бейкър, SM; Андрюс, С.; Hepworth, MR; Withers, DR Мрежи от реципрочни транскрипционни фактори управляват функцията и идентичността на подмножеството на ILC3 в тъканта. Нац. Immunol. 2021, 22, 1245–1255. [CrossRef]

21. van Beek, JJP; Мартенс, AWJ; Bakdash, G.; de Vries, IJM Вродени лимфоидни клетки в туморния имунитет. Biomedicines 2016, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

22. Mattner, J.; Вирц, С. Приятел или враг? Двусмислената роля на вродените лимфоидни клетки в развитието на рак. Тенденции Immunol. 2017, 38, 29–38. [CrossRef]

23. Кирхбергер, С.; Ройстън, DJ; Boulard, O.; Торнтън, Е.; Franchini, F.; Szabady, RL; Харисън, О.; Powrie, F. Вродените лимфоидни клетки поддържат рак на дебелото черво чрез производство на интерлевкин -22 в миши модел. J. Exp. Med. 2013, 210, 917–931. [CrossRef] [PubMed]

24. Иршад, С.; Флорес-Борха, Ф.; Lawler, K.; Monypenny, J.; Evans, R.; Мале, В.; Гордън, П.; Cheung, A.; Газинска, П.; Noor, F.; et al. RORgammat(+) вродени лимфоидни клетки насърчават метастазите в лимфните възли на рак на гърдата. Cancer Res. 2017, 77, 1083–1096. [CrossRef] [PubMed]

25. Goc, J.; Lv, М.; Бесман, Ню Джърси; Фламар, Алабама; Сахота, С.; Сузуки, Х.; Teng, F.; Putzel, GG; Eberl, G.; Уидърс, DR; et al. Дисрегулацията на ILC3s отприщва прогресията и имунотерапевтичната резистентност при рак на дебелото черво. Клетка 2021, 184, 5015–5030.e16. [CrossRef]

26. Лиу, Й.; Песен, Й.; Лин, Д.; Лей, Л.; Mei, Y.; Джин, З.; Gong, H.; Zhu, Y.; Hu, B.; Джан, Й.; et al. NCR(-) група 3 вродени лимфоидни клетки оркестрират IL-23/IL-17 оста за насърчаване на развитието на хепатоцелуларен карцином. EBioMedicine 2019, 41, 333–344. [CrossRef] [PubMed]

27. Bruchard, M.; Geindreau, М.; Perrichet, A.; Truntzer, C.; Балот, Е.; Boidot, R.; Racoeur, C.; Барсак, Е.; Чалмин, Ф.; Hibos, C.; et al. Набирането и активирането на тип 3 вродени лимфоидни клетки насърчават антитуморни имунни отговори. Нац. Immunol. 2022, 23, 262–274. [CrossRef]

28. Rethacker, L.; Момче, М.; Бисио, В.; Русин, Ф.; Denizeau, J.; Винсент-Саломон, А.; Боркоман, Е.; Sedlik, C.; Пиаджо, Е.; Toubert, A.; et al. Вродени лимфоидни клетки: NK и цитотоксични ILC3 подгрупи инфилтрират метастатични лимфни възли на рак на гърдата. Онкоимунология 2022, 11, 2057396. [CrossRef]

29. Cesta, MF Нормална структура, функция и хистология на далака. Токсикол. Патол. 2006, 34, 455–465. [CrossRef]

30. Ишигуро, Т.; Накаджима, М.; Найто, М.; Муто, Т.; Tsuruo, T. Идентифициране на гени, диференциално експресирани в B16 миши меланомни сублинии с различни метастатични потенциали. Cancer Res. 1996, 56, 875–879.

31. Szabo, SJ; Ким, ST; Коста, GL; Джан, X.; Фатман, CG; Glimcher, LH Нов транскрипционен фактор, T-bet, насочва ангажимента за Th1 линия. Cell 2000, 100, 655–669. [CrossRef] [PubMed]