ДНК ваксинация, предизвикана защитен имунитет срещу SARS CoV-2 инфекция при хамстери

Фигура 2. Отговор на антитела при мишки след имунизация с SARS-CoV и SARS-CoV-2 S ДНК ваксини.

(A) BALB/c мишки (n=4 на група) бяха интрамускулно имунизирани два пъти на 3-седмичен интервал със 100 ug от посочения плазмид, последвано от електропорация. Серумните проби бяха събрани в посочените времеви точки след първата имунизация. (BD, F, G) Антитела срещу SARS-CoV-2 спайк протеин с пълна дължина, S2 регион и RBD бяха оценени чрез ELISA. (E, H) Индуцирано от ваксина неутрализиращо антитяло срещу SARS-CoV-2 беше оценено чрез неутрализационен анализ. Титрите на антителата са представени като средна стойност ± SEM, а неутрализационните титри са изразени като средна геометрична стойност с 95% доверителен интервал. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.

За да проучим допълнително дали замяната на водещата последователност може да увеличи секрецията на протеин, използвахме водеща последователност от активатор на тъканен плазминоген, за да слеем различни варианти на SARS-CoV-2 S протеина. Всички варианти съдържат RBD региона на SARS-CoV-2 S протеина. След две дози ДНК имунизация, серумите, събрани на седмица 4 и седмица 6, бяха анализирани за IgG антитяло и титри на неутрализиращи антитела. Имунизацията с ptSARS2-S индуцира по-високи титри на антитела срещу S протеин с пълна дължина на седмица 4, отколкото имунизацията с ptRBD, ptRBDTM и ptSdTM (S1A Фиг). Титрите на анти-RBD антитела при ptRBD имунизация са по-високи от тези при ptSARS2-S имунизация (1496,2 срещу 530,9, p=0.057) на седмица 4 (S1B Фиг). Въпреки това, имунизацията срещу ptRBD и ptSARS2-S индуцира подобни нива на неутрализиращи антитела на седмица 4 (S1C Фиг). Същите резултати се наблюдават при серумен анализ на седмица 6; Имунизацията с ptRBD индуцира по-високи нива на анти-RBD антитела в сравнение с имунизацията с ptSARS2-S (12589,3 срещу 1000,0, p=0.028), но същите нива на неутрализиращи антитела (9,3 спрямо 9,6 (log2)) (Фиг. 2F, 2G и 2H). Тъй като вариантите, слети с водеща последователност на tPA, не индуцират по-високи титри на неутрализиращи антитела от имунизацията с pSARS2-S, ние използвахме pSARS2-S за по-нататъшно изследване.

Конкурентно свързване на серумни антитела и ACE2 към SARS-CoV-2 RBD

За да изследваме способността на серумните антитела да се намесват във взаимодействието на ACE2-RBD, направихме конкурентен серологичен анализ на SARS-CoV-2. При този анализ серумните антитела бяха добавени към ELISA плаки, предварително покрити с SARS-CoV-2 RBD протеин, последвано от добавяне на човешки ACE2 протеин. Като еталон е използвано специфично неутрализиращо антитяло срещу SARS-CoV-2 RBD. Както е показано вФигура 3, серумни антитела от pSARS2-S имунизирани мишки се свързват с RBD и блокират свързването на ACE2, което е еквивалентно на приблизително 353 ug/mL референтно антитяло, докато pSARS-S серумът е еквивалентен на 56 ug/mL референтно антитяло. Следователно нашите данни предполагат, че имунизацията срещу pSARS2-S може да индуцира конкурентни антитела, които ефективно блокират свързването на SARS-CoV-2 RBD с ACE2 рецептора. Този резултат е в съответствие с титъра на ELISA срещу SARS-CoV2 RBD (Фиг. 2D), и подкрепено от проучването за разликата в RBD последователностите между SARS-CoV и SARS-CoV-2 [24].

Фигура 3. Конкурентна активност на имунизирани миши серуми срещу взаимодействието RBD/ACE2.

BALB/c мишки (n=4 на група) бяха интрамускулно имунизирани два пъти на 3-седмичен интервал със 100 ug вектор, pSARS-S или pSARS2-S, последвано от електропорация. Серумни проби бяха събрани на 8-та седмица след първата имунизация. Серумните антитела, които се конкурират с ACE2 за свързване с RBD, бяха оценени чрез конкурентен серологичен анализ на SARS-CoV-2. Конкурентната активност на миши серуми се изразява като еквивалентно ниво на анти-RBD (SARS-CoV-2 шипов протеин) антитяло (референтно антитяло). Титрите на антителата са представени като средна стойност ± SEM. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.

SARS-CoV-2 S ДНК ваксина, индуциран дългосрочен хуморален имунитет и предлага кръстосана защита срещу SARS-CoV-2 с D614G мутация

Трябва да се отбележи, че дългосрочно поддържане на титри на IgG антитела срещу S с пълна дължина се наблюдава на 20-та седмица след първата имунизация (Фигура 4А). Средните геометрични титри (log2) за SARS-CoV-2 неутрализиращи антитела достигнаха 10,8 на седмица 8 след pSARS2-S имунизации, леко намалявайки до 9,1 на седмица 12 и до 8,8 на седмица 20 (Фигура 4B). Тези резултати предполагат, че имунизацията срещу pSARS2-S осигурява дълготраен хуморален отговор срещу SARS-CoV-2. Освен това pSARS2-S ДНК ваксината с генотип D614 индуцира отговор на неутрализиращи антитела срещу вируса, съдържащ D614G мутация (Фигура 4C), което е подобно на неутрализационните титри срещу D614 генотипа. Следователно pSARS2-S е в състояние да предостави кръстосана защита срещу най-разпространения и доминиращ вариант D614G на SARS-CoV-2.

Фигура 4. SARS-CoV-2 S ДНК ваксина индуцира дългосрочен хуморален имунитет и кръстосана защита срещу SARS-CoV-2 с D614G мутация.

BALB/c мишки (n=4 на група) бяха интрамускулно имунизирани три пъти на 3-седмичен интервал със 100 ug вектор, pSARS-S или pSARS2-S, последвано от електропорация. Серумните проби бяха събрани в посочените времеви точки след първата имунизация. (A) Антителата срещу SARS-CoV-2 спайк протеин с пълна дължина бяха оценени чрез ELISA. (B, C) Индуцирана от ваксина неутрализираща активност срещу SARS-CoV-2 с генотипове D614 или G614 беше оценена чрез неутрализационен анализ. Титрите на антителата са представени като средна стойност ± SEM, а неутрализационните титри са изразени като средна геометрична стойност с 95% доверителен интервал. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.

Индуциране на Th1- или Th2-предубедени реакции

Ефекторните CD4+ Т клетки могат да бъдат подразделени на две основни функционални подгрупи, Th1 и Th2, въз основа на секретираните цитокини при активиране. Th1 клетките произвеждат възпалителни цитокини (IFN-) и участват в клетъчно-медиираните имунни отговори срещу вътреклетъчни бактерии и вируси, докато Th2 клетките секретират главно помагат на В клетките да произвеждат антитела, но също така насърчават еозинофилно-медиирания имунитет (IL-5 и IL{ {9}}), което води до хуморални или алергични реакции [25, 26]. Нещо повече, зависимите от Th2 клетки механизми могат да допринесат за свързаното с ваксината усилено респираторно заболяване (VAERD), както показват проучвания на кандидати за ваксина срещу SARS-CoV [27, 28], които подчертават, че балансираният Т-клетъчен отговор е от решаващо значение за безопасното разработване на ваксина срещу COVID-19 [29]. За да се реши този проблем, BALB/c и C57BL/6 мишки бяха имунизирани с вектор, pSARS-S и pSARS2-S два пъти на 3-седмичен интервал. Мишките бяха умъртвени 7 дни след втората имунизация и спленоцитите бяха стимулирани с SARS-CoV-2 S протеин (5 ug/mL) в продължение на 3 дни. При BALB/c мишки (Фиг. 5A–5D), секрецията на Th1 тип цитокини IFN- (19641,3 pg/mL ± 8823,5) и IL-2 (599,5 pg/mL ± 37,7) е висока след стимулиране със S протеин в pSARS2-S имунизационна група, но бяха открити много ниски нива на Th2 тип цитокини IL-5 (18,1 pg/mL ± 11,8) и IL-13 (567,2 pg/mL ± 166,2). Подобни резултати са наблюдавани при C57BL/6 мишки, pSARS2-S имунизирана група индуцира по-високо количество IFN- (33918.8 pg/mL ± 11646.1) и IL-2 (800.3 pg/mL ± 109.5) от тази на IL-5 (4,6 pg/mL ± 2,9) и IL-13 (545,7 pg/mL ± 117,4) (Фиг. 5E–5H). Тези данни предполагат, че pSARS2-S може да индуцира Th1-предубедени имунни отговори.

Фигура 5. Т клетъчен отговор при мишки след имунизация с pSARS-S и SARS2-S ДНК ваксини.

BALB/c (AD) и C57BL/6 (EH) мишки (n=4 на група) бяха интрамускулно имунизирани два пъти на 3-седмичен интервал със 100 ug вектор, pSARS-S или pSARS{{ 8}}S, последвано от електропорация. Спленоцитите бяха събрани на седмица 4 след първата имунизация и нивата на секретирания IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G) и IL -13 (D, H) бяха оценени след повторно стимулиране с рекомбинантен SARS-CoV-2 S протеин. Титрите на антителата са представени като средна стойност ± SEM. *стр<0.05 by the Mann-Whitney test.

Профилактична ефикасност на ДНК ваксините срещу SARS-CoV-2 Challenge

За да се проучи защитната ефикасност на ваксинацията срещу pSARS2-S, сирийски хамстери бяха имунизирани два пъти със 100 ug ДНК на интервал от 3-седмици и интраназално провокирани с вируса SARS-CoV-2 на седмица 7 (Фигура 6А). След имунизация, серуми на седмица 4 и седмица 6 бяха събрани за анализи на титъра на анти-пик антитяло (IgG) и титър на неутрализиращи антитела. Имунизацията с pSARS2-S предизвиква по-високи нива на титри на анти-Spike антитела, отколкото имунизацията с ptRBD на седмица 4 (1584,9 спрямо 50,1) и седмица 6 (1995,3 спрямо 63,1) при хамстери (Фигура 6B). В съответствие с титрите на анти-Spike антитела, серумите на pSARS2-S-имунизирани хамстери повишават много високи титри на неутрализиращи антитела (6,5 на седмица 4 и 6,4 на седмица 6 (log2)), но серумите на вектор- или ptRBD-имунизирани хамстери не (Фигура 6C). След предизвикателството със SARS-CoV-2, телесното тегло на хамстера се наблюдава всеки ден. Предишни проучвания разкриха, че вирусният титър в белите дробове на хамстер достига високо ниво 3 дни след заразяването [30]. Следователно, половината от хамстерите от всяка група бяха умъртвени на ден 3 и беше анализирано вирусното натоварване в белия дроб. Телесното тегло на хамстери, ваксинирани с вектор, намалява постепенно и процентът на загубеното телесно тегло е 11,1% на 6 дни след заразяването. Обратно, имунизацията срещу pSARS2-S предпазва хамстерите от загуба на телесно тегло (Фигура 6D). Освен това титрите на инфекциозния вирус и броят на копията на вирусната РНК в pSARS2-S групата показаха 2,29 и 1,37 log10 намаления в сравнение с векторната контролна група (Фиг. 6E и 6F). Тези резултати предполагат, че имунизацията срещу pSARS2-S осигурява защита срещу SARS-CoV-2 инфекция при сирийски хамстери.

Фигура 6. Профилактична ефикасност на SARS-CoV-2 S ДНК ваксина при заразени със SARS-CoV-2-хамстери.

(A) Времеви ход на ДНК ваксинация и SARS-CoV-2 предизвикателство. Сирийските хамстери бяха интрамускулно имунизирани два пъти на 3-седмичен интервал със 100 ug контрола, pSARS-S или pSARS2-S, последвано от електропорация. Серумните проби бяха събрани чрез ретроорбитално вземане на кръвни проби на седмици 4 и 6 след първата имунизация. На 4-та седмица след втората имунизация сирийските хамстери бяха заразени интраназално със 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Антитела срещу SARS-CoV-2 спайк протеин с пълна дължина бяха оценени чрез ELISA. (C) Индуцираната от ваксината неутрализираща активност срещу SARS-CoV-2 беше оценена чрез неутрализационен анализ. (D) Промяната на телесното тегло (%) на хамстерите се записва всеки ден след заразяването със SARS-CoV-2. Вирусни титри (E) и вирусни РНК копия (F) в белите дробове на SARS-CoV-2-инфектирани хамстери на 3 дни след провокацията бяха определени съответно чрез TCID50 анализ и qRT-PCR. Титрите на антителата са представени като средна стойност ± SEM, а неутрализационните титри са изразени като средна геометрична стойност с 95% доверителен интервал. *стр<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Дискусия

Стартираха повече от 80 клинични изпитвания на ваксина срещу COVID-19, а проучванията за имуногенност и вирусно предизвикателство при животни са критични стъпки в процесите на разработване на ваксини. Интензивно са разработени ДНК ваксини за инфекция със SARS-CoV-2 за различни подходи на доставяне. Електропорацията е обещаващ подход, който може да подобри доставката на ДНК и антигенността на имуногените in vivo. Докладвани са две проучвания за ДНК ваксина от Yu et al. [13] и Smith et al. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 log10 намаления на вирусното натоварване в бронхоалвеоларен лаваж след провокация в сравнение с контролите. Смит и др. установи, че имунизирането на мишки и морски свинчета с INO-4800 (кодиращ S протеин в пълна дължина) с електропорация може да предизвика неутрализиращи антитела срещу SARS-CoV-2 инфекция и да блокира свързването на S протеин към ACE2 рецептора, но го направи не предоставя данни за заразяване с животни. В този доклад ние оценихме различни варианти за кандидати за ДНК ваксина и установихме, че S протеинът с пълна дължина (pSARS2-S) е най-подходящият за по-нататъшно имунологично изследване. Въпреки че SARS-CoV и SARS-CoV-2 споделят 76% хомология в техните S протеини [31, 32], pSARS-S имунизацията не може да индуцира антитела срещу RBD на SARS-CoV-2 S протеин или неутрализиращи титри на антитела срещу SARS-CoV-2 инфекция (Фиг. 2). Действително, анти-RBD антителата играят важна роля в блокирането на вирусна инфекция. Въпреки това, имунизацията само с RBD (ptRBD) генерира високи титри на неутрализиращи антитела при мишки, но не и при хамстери (фиг.2Hи6C). Спекулирахме, че този резултат може да се дължи на сигналния пептид (тъканно-плазминогенен активатор), който не успява да улесни секрецията на RBD протеина в хамстери. Подробният механизъм изисква допълнително проучване в бъдеще. Ние също така отбелязахме, че имунизацията с ptRBDTM (кодиращ фрагмент от RBD към трансмембранния домен на S) индуцира по-ниски титри на неутрализиращи антитела, отколкото имунизацията с ptRBD (фиг.2HиS1C). Резултатите може да отразяват нестабилната структура на протеина RBD-TM. За по-нататъшно изследване на Th1/Th2 имунните отговори, спленоцитите от имунизирани мишки бяха стимулирани с SARS-CoV-2 S протеин. Установихме, че имунизацията срещу pSARS2-S индуцира силни Th1-предубедени имунни отговори с по-високи нива на IFN- -секреция след стимулация (Фигура 5), но имунизацията срещу pSARS-S индуцира само ниски нива на IFN- -секреция. Тези данни показват, че кръстосаната реактивност на Т-клетъчните отговори между шиповия протеин на SARS-CoV и SARS-CoV-2 не е висока (Фигура 5). Освен това анализът IFN-ELISPOT разкри, че са открити по-малко Т-клетъчни отговори срещу S1 региона в C57BL/6 и BALB/c мишки, имунизирани с pSARS-S (S2 Фиг), което също се подкрепя от проучването на Смит [12]. Тези данни показват, че ваксината срещу SARS може да не осигури пълен защитен ефект срещу SARS-CoV-2 инфекция. Разработването на ДНК ваксини е важно за бърз отговор на пандемията от коронавирусна инфекция. Следователно успехът на ДНК ваксината срещу SARS-CoV-2 може да се приложи към други възникващи инфекциозни заболявания.

Различните конструкции, използвани в SARS-SoV-2 ДНК ваксините, индуцират различни нива на титри на неутрализиращи антитела. Водещата последователност на tPA се използва за увеличаване на експресията и секрецията на антиген в ДНК ваксини [21, 33–35]. Въпреки това, лидерната последователност на tPA не повишава значително титрите на антителата в този доклад. За по-нататъшно повишаване на ефикасността на ваксината могат да се използват различни лидерни последователности, за да се замени нативната лидерна последователност на шиповия протеин. Водещата последователност на IgE беше използвана във ваксината INO-4800 ДНК и ваксината MERS-CoV [5, 12]. В допълнение, модифицираната шипова протеинова последователност може също да повиши имуногенността на ваксината. Стабилизиран шипов протеин е проектиран чрез мутиране на мястото на фурин и други региони за генериране на структура на предварително сливане (S-2P), която може да увеличи експресията на шиповия протеин ~10-кратно [36]. Идеалната ДНК ваксина трябва да оптимизира конструкцията на плазмидна ДНК и системата за доставяне, за да повиши нивото на експресия на протеин.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Животинските модели са критични за разработването на ваксина срещу COVID{0}}. Няколко животински модела са използвани за оценка на ефикасността на ваксините срещу COVID-19, включително нечовекоподобни примати [13, 37], човешки ACE2 трансгенни мишки [38] и сирийски хамстери [39]. ACE2 на сирийски хамстер има голямо сходство с човешкия ACE2 и неговият афинитет на свързване към S протеина на SARS-CoV-2 се прогнозира по-висок от този на миши ACE2 [40]. Това е причината, поради която човешки ACE2 трансгенни мишки са използвани като модели за предизвикване на SARS-CoV-2, но не и мишки от див тип. Проучванията за предаване на SARS-CoV-2 показват, че вирусът може ефективно да зарази наивни хамстери чрез директен контакт или чрез аерозоли [41]. Интраназалната инфекция на SARS-CoV-2 може да репликира и индуцира патогенеза в белите дробове на сирийски хамстери [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>5% намаление от изходното ниво), което е свързано с по-голяма продължителност на заболяването [42]. Тези открития показват, че сирийският хамстер също е подходящ животински модел за оценка на ваксини срещу COVID-19. Въз основа на наличието на животински модели, ние избрахме хамстери като модел на предизвикателство SARS-CoV-2, за да оценим ефикасността на ваксината. Нашите данни показват, че имунизацията с pSARS2-S, но не и с ptRBD, може да индуцира високи титри на анти-Spike IgG антитела и титри на неутрализиращи антитела (Фиг. 6B и 6C). Съответно pSARS2-S-имунизираните хамстери, но не и ptRBD-имунизираните хамстери, генерират имунен отговор срещу SARS-CoV-2 предизвикателството. Ние отбелязахме, че ptRBD имунизацията може да индуцира високи нива на титри на неутрализиращи антитела при мишки, но не и при хамстери. Противоречивите резултати може да се дължат на това, че само RBD не се експресира стабилно в хамстери. Моделът на хамстер също беше използван за оценка на аденовирусната серотип 26 (Ad26) векторна ваксина срещу COVID-19. Единична имунизация с ваксина, базирана на вектор Ad26, експресираща стабилизиран SARS-CoV-2 спайков протеин, който предизвиква неутрализиращи реакции на антитела и защитава срещу SARS-CoV-2 инфекция, предизвиква загуба на тегло, частична смъртност и вирусна репликация в белия дроб [39]. Тези резултати показват, че моделът на хамстер е подходящ за оценка на ефикасността на ваксините срещу COVID-19.

Много от усилията за разработване на ваксина срещу SARS-CoV-2 се основават на изследователския опит на MERS-CoV и SARS-CoV. В световен мащаб няколко ваксини срещу COVID-19 бяха одобрени за спешна употреба през декември 2020 г., включително базирани на РНК и аденовирус векторни ваксини срещу COVID-19. Бяха обсъдени предимствата и недостатъците на различните платформи за ваксини [43]. Аденовирусните векторни ваксини могат да предизвикат по-силен имунен отговор от ДНК и иРНК ваксините, но тяхната ефикасност на ваксината може да бъде намалена чрез съществуващ имунитет срещу Ad вектори [44]. В сравнение с ДНК ваксината, иРНК ваксината се нуждае от свръхниска температура за съхранение и транспорт [45]. Следователно ДНК ваксината може да бъде потенциална платформа за ваксина, особено при спешна употреба.

Нашето проучване предполага възможността за ДНК ваксина за употреба от хора. По-нататъшни проучвания биха могли да изследват ефикасността на тази ДНК ваксина, доставена чрез интрадермално (ID) инжектиране, което е по-удобно за клинично приложение, тъй като иглата за IM инжектиране е приблизително 18 mm дълбока при хора и засяга повече тъкани, отколкото ID инжектирането чрез EP. Освен това ефикасността на ваксината трябва да се тества при възрастни мишки като модел за възрастни хора, тъй като тази популация е особено силно засегната, когато е заразена от SARS-CoV-2. Предишни проучвания показват, че Th2 клетъчният отговор е свързан с усилено респираторно заболяване (VAERD) след ваксиниране на инактивирани вирусни ваксини срещу RSV [46], вирус на морбили [47] и SARS-CoV [27, 48]. Обратно, има докладвани по-малко тежки случаи на SARS-CoV в резултат на индукция на Th1 клетъчен отговор [49]. Следователно силните Th1-предубедени имунни отговори, предизвикани от ДНК ваксината, предполагат, че е малко вероятно страничните ефекти да бъдат сериозен проблем [50]. Освен това, бяха повдигнати опасения относно базираните на протеини ваксини поради използването на алуминиева сол или адюванти тип емулсия масло във вода, които водят до Th2-предубедени имунни отговори и увеличават потенциалните странични ефекти [51, 52]. В обобщение, ДНК ваксината срещу COVID-19 може да играе основна роля в контролирането на пандемията COVID-19 в близко бъдеще.

Препратки

1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Икономически последици от огнището на COVID{0}}: необходимостта от готовност за епидемия. Front Public Health. 2020; 8: 241. pmid:325743072. Център за системни науки и инженерство (CSSE) [Интернет]. Табло за управление на COVID-19. Университет Джон Хопкинс. [цитирано 11 февруари 2021 г.]. Достъпен от:
2. 3.Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K, et al. Принос на структурните протеини на коронавирус на тежък остър респираторен синдром към защитния имунитет. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid: 15210961
3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, et al. ДНК ваксина предизвиква неутрализиране на SARS коронавирус и защитен имунитет при мишки. Природата. 2004;428(6982):561–4. pmid: 15024391
4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, et al. Синтетична консенсусна анти-спайк протеинова ДНК ваксина предизвиква защитен имунитет срещу коронавирус на респираторния синдром в Близкия изток при нечовекоподобни примати. Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid: 26290414
5. 6. Krammer F. SARS-CoV-2 ваксини в процес на разработка. Природата. 2020; 586 (7830): 516–27. pmid:32967006
6. 7. Khalaj-Hedayati A. Защитен имунитет срещу кандидати за ваксина за подединица SARS, базиран на Spike Protein: Уроци за разработване на ваксина срещу коронавирус. J Immunol Res. 2020;2020:7201752. pmid:32695833
7. 8. Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z и др. Хуморални и клетъчни имунни отговори, индуцирани от 3а ДНК ваксини срещу тежък остър респираторен синдром (SARS) или подобен на SARS коронавирус при мишки. Clin Vaccine Immunol. 2009; 16 (1): 73–7. pmid:18987164
8. 9. Бауър JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Извличане на неутрализиращи антитела с ДНК ваксини, експресиращи разтворими стабилизирани гликопротеинови тримери на обвивката на човешки имунодефицитен вирус тип 1, конюгирани към C3d. J Virol. 2004;78(9):4710–9. pmid: 15078953
9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Оптимизиране на ДНК ваксина срещу SARS. DNA Cell Biol. 2007; 26 (10): 721–6. pmid:17665998
10. 11. Gary EN, Weiner DB. ДНК ваксини: най-добрият момент е сега. Curr Opin Immunol. 2020; 65: 21–7. pmid:32259744
11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J, et al. Имуногенност на кандидат за ДНК ваксина срещу COVID-19. Nat Commun. 2020; 11 (1): 2601. pmid:32433465
12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH, et al. Защита с ДНК ваксина срещу SARS-CoV-2 при макаци резус. Наука. 2020; 369 (6505): 806–11. pmid:32434945
13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Методи за доставяне за увеличаване на клетъчното усвояване и имуногенността на ДНК ваксини. Ваксина. 2016; 34 (46): 5488–94. pmid: 27742218
14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M, et al. Бърз отговор на нововъзникващо инфекциозно заболяване - Поуки от разработването на синтетична ДНК ваксина, насочена срещу вируса Zika. Микробите заразяват. 2018; 20 (11–12): 676–84. pmid: 2955534516.Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C, et al. Вродена молекулярна и клетъчна сигнатура в кожата, предшестваща дълготрайни Т-клетъчни отговори след електропорирана ДНК ваксинация. J Immunol. 2020; 204 (12): 3375–88. pmid:32385135
15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV, et al. Ново прототипно устройство за доставяне на ДНК ваксина с електропорация едновременно към кожата и мускулите. Ваксина. 2011; 29 (39): 6771–80. pmid: 21199706
16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS, et al. Повишена имуногенност и защитна ефикасност на тетравалентна ДНК ваксина срещу денга с помощта на електропорация и интрадермално доставяне. Ваксина. 2019; 37 (32): 4444–53. pmid:31279565
17. 19. Рамакришнан MA. Определяне на 50% титър на крайна точка с помощта на проста формула. Световен J Virol. 2016; 5 (2): 85–6. pmid: 27175354
18. 20. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al. Откриване на нов коронавирус 2019 (2019-nCoV) чрез RT-PCR в реално време. Евро наблюдение. 2020 г. pmid: 31992387
19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q и др. Сигналната последователност на тъканния плазминогенен активатор (tPA) повишава имуногенността на базираната на MVA ваксина срещу туберкулоза. Immunol Lett. 2017; 190: 51-7. pmid: 28728855
20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y и др. Механизъм на сливане на 2019-nCoV и инхибитори на сливане, насочени към HR1 домейна в шиповия протеин. Cell Mol Immunol. 2020; 17 (7): 765–7. pmid:32047258