Инактивирането на RPX1 в Arabidopsis придава резистентност към Plutella Xylostella чрез натрупването на хомотерпена DMNT

Резюме

Вредителят по културите Lepidoptera Plutella xylostella причинява сериозни ограничения върху култивирането на Brassica. Тук съобщаваме за нова роля на RPX1 (резистентност към P. xylostella) в резистентността към този вредител в Arabidopsis thaliana. Мутантът rpx1-1 отблъсква ларвите на P. xylostella и храненето с мутанта rpx1-1 сериозно уврежда структурата на перитрофичния матрикс в средното черво на ларвите, като по този начин влияе отрицателно върху растежа и какавидирането на ларвите. Тази резистентност е резултат от натрупването на защитни съединения, включително монотерпена (3E)-4,8-диметил-1,3,7-нонатриена (DMNT), поради регулирането нагоре на ПЕНТАЦИКЛИЧНАТА ТРИТЕРПЕН СИНТАЗА 1 (PEN1), която кодира ключов DMNT биосинтетичен ензим. Заразяването с P. xylostella и нараняването предизвикват разграждане на протеина RPX1, което може да даде бърз отговор на заразяване с насекоми. Инактивирането на RPX1 и свръхекспресията на PEN1 не са свързани с отрицателни компромиси за растежа на растенията, но имат много по-високо производство на семена от дивия тип в присъствието на заразяване с P. xylostella. Това проучване предлага нова стратегия за молекулярно развъждане на растения срещу P. xylostella.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

  КЛЮЧОВИ ДУМИ

устойчивост на вредители, вторичен метаболизъм, летливи емисии

1|ВЪВЕДЕНИЕ

Насекомите вредители не само намаляват добива, но също така влияят върху качеството на растителните продукти (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). Сред тях диамантеният молец Plutella xylostella е широко разпространен и вреден лепидоптер, който се храни с кръстоцветни култури като карфиол и зеле, причинявайки огромни икономически загуби. Понастоящем в управлението на селското стопанство контролът върху вредителите с помощта на агрохимикали (напр. пестициди) е много успешен и широко прилаган, но този подход става проблематичен поради потенциално замърсяване на околната среда и заплахи за човешкото здраве (Shakeel et al., 2017). Алтернативен подход към производството на култури е използването на генетично модифицирани култури с повишена устойчивост на вредители, например в растителна експресия на Bacillus thuringiensis (Jouzani et al., 2017) или други хетероложни ентомотоксични протеини (Douglas, 2018). Бяха положени значителни усилия за идентифициране на нови подходи за контрол на P. xylostella в селското стопанство; обаче, ефективните гени, естествените пестициди и резистентната зародишна плазма остават ограничени (Zhou & Jander, 2021). Чрез постоянна надпревара във въоръжаването с насекоми вредители, растенията са развили различни способности за борба с атаките на насекоми. Съответно, растенията синтезират масиви от защитни метаболити като бензоксазиноиди (Handrick et al., 2016; Varsani et al., 2019), метил бензоат (Feng & Zhang, 2017) и серотонин (Lu et al., 2018) в отговор на нараняване от вредители. Жасмоновата киселина (JA), наричана още „хормон на рани“, играе централна роля в различни реакции на увреждане, свързани с рани, инициирани от заразяване с насекоми (Lortzing & Steppuhn, 2016). Все повече доказателства сочат, че JA функционира синергично и/или антагонистично с други фитохормони, като салицилова киселина (SA) и етилен (Costarelli et al., 2020; Ma et al., 2019). В допълнение към директната защита, растенията, увредени от атаки на насекоми, отделят различни летливи съединения, които привличат естествените врагове на тревопасните (Gols, 2014). От тези сложни летливи смеси хомотерпеновите съединения (3E)-4,8-диметил-1,3,7-нонатриен (DMNT) и (E, E) -4,8,12-триметил-1,3,7, Съобщава се за 11-тридекатетраен (TMTT) в множество растителни видове като Arabidopsis (Lee et al., 2010; Sohrabi et al., 2015), ориз (Li et al., 2018), царевица (Gouinguené et al., 2005). ; Richter et al., 2016) и памук (Liu et al., 2018). Няколко проучвания също така показват, че DMNT действа като сигнална молекула, която индуцира защита срещу тревопасни животни по време на комуникацията растение-растение (Arimura et al., 2000; Meents et al., 2019). Например, след нанасяне на щети от дъвчещи насекоми, някои сладки картофи отделят DMNT, което води до системна индукция на изкълчване на протеазния инхибитор в съседни растения сладки картофи и ги прави несмилаеми за насекоми (Meents et al., 2019). Подобни резултати са наблюдавани за чаени растения (Jing et al., 2020). Наскоро открихме, че DMNT играе роля в убиването на ларвите на P. xylostella чрез разрушаване на бариерата на перитрофичния матрикс (PM) в средното черво на насекомото (Chen et al., 2021).

Във висшите растения пътищата на биосинтеза на DMNT и TMTT са добре характеризирани чрез обратна генетика и биохимични анализи. В царевицата DMNT и TMTT се произвеждат от окислителното разграждане на (E)-неролидол и (E, E)-геранил линалол от две P450 монооксигенази, CYP92C5 и CYP92C6 (Richter et al., 2016). При памука два CYP гена (GhCYP82L1 и GhCYP82L2) са отговорни за превръщането на (E)-неролидол в DMNT и (E, E)-геранил линалоол в TMTT (Liu et al., 2018). В корените на Arabidopsis DMNT се катализира от прекурсора C30 тритерпенов диол, канабидиол, от цитохром P450 монооксигеназа, кодирана от специфичния за корена ген CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). Проучване, използващо дрожди като модел на организъм, представи доказателства, че канабидиолът се произвежда от 2,3-оксидосквален от канабидиол синтазата PEN1 (Xiang et al., 2006) и чиято експресия е синергично свързана с CYP705A1 (Sohrabi et al. ., 2015). Независимо от това, регулирането на ключовите гени в биосинтезата на DMNT остава до голяма степен неизвестно. Генът RPX1, описан в това изследване, кодира нов кап-свързващ протеин (CBP), който е член на фамилията гени на еукариотния инициационен фактор 4E (eIF4E). В растенията семейството eIF4E се състои от eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E и nCBP, които играят съществена роля в инициирането на cap-зависима иРНК транслация (Rhoads, 2009). Членовете на семейството eIF4E са основните източници на рецесивна резистентност към картофения вирус Y (PVY) – най-вредният патоген, засягащ добива и качеството на картофите, а използването на технологията CRISPR-Cas9, насочена към гена eIF4E1, разширява спектъра на резистентност към картофения вирус Y на Solanum tuberosum (Lucioli и др., 2022 г.). По подобен начин медиираното от CRISPR/Cas9 редактиране на eIF4E изоформите на маниока nCBP-1 и nCBP-2 намалява тежестта и честотата на симптомите, причинени от болестта на кафявите ивици на маниоката (Gomez et al., 2019). Освен това, проучванията при Arabidopsis показват, че дефицитът на nCBP играе роля в ограничаването на движението на растителни вируси от клетка към клетка (Keima et al., 2017). Независимо от това, функцията на nCBPs в защитата на тревопасните не е докладвана. Тук използваме интегративен подход за функционално характеризиране на гена RPX1 на Arabidopsis, който играе важна роля в устойчивостта на растенията към P. xylostella. Нашите резултати показват, че събарянето на RPX1 води до диференциално експресирани гени (DEG) и натрупване на съединения. Един от регулираните гени е PEN1, който е ключов за биосинтезата на DMNT. Инвазията на rpx1 мутанта и натрупването на DMNT засягат структурата на PM на P. xylostella и причиняват дефекти в развитието на ларвите и смърт. Допълнителни доказателства показват, че заразяването с P. xylostella и нараняването предизвикват разграждане на протеина RPX1, което от своя страна може да доведе до устойчивост на растенията към насекоми.

2|МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1|Растителни материали и условия на растеж

Семената на Arabidopsis бяха поръчани от Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC, http://Arabidopsis.info/). Семената бяха повърхностно стерилизирани, засети върху среда Murashige и Skoog (MS) и стратифицирани при 5 градуса в камера за растеж при краткодневен фотопериод (8 часа светлина, 16 часа тъмно) в продължение на 3 дни. След това те бяха прехвърлени на 22 градуса в оранжерията при дълъг фотопериод (16 часа светлина, 8 часа тъмнина) с нормална поддръжка на растенията.

2.2|Експерименти с избор (предпочитание) и без избор и биотестове

Яйцата на P. xylostella бяха закупени от Henan Jiyuan Baiyun Company (кат.: HJB004, разработено през 2009 г., размножено за научни изследвания в контролирана среда) и инкубирани в камера за растеж, настроена на 26 градуса, 16 часа светлина/8 часа тъмно. За изборни експерименти прехвърлихме 3-седмични растения Arabidopsis (съответно осем диви и мутантни растения) в тестови резервоари, които бяха свързани към всеки край на стъклената епруветка, а останалите експериментални стъпки бяха извършени, както е описано по-горе ( Чен и др., 2021). Използвани са ларвите от четвърта възраст и 15 ларви са включени във всяка експериментална реплика.

За експеримента без избор, 3-седмични растения от див тип и мутантни растения бяха прехвърлени в отделни и полуотворени петриеви панички, съдържащи същия брой 15 ларви на s-instar P. xylostella. Следващите стъпки бяха извършени, както е описано по-горе (Chen et al., 2021).

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

2.3|Скрининг на резистентни Arabidopsis мутанти срещу P. xylostella

Събрахме 179 T-DNA вмъкнати мутанти на Arabidopsis за скрининг на резистентност към P. xylostalle. Мутантите се отглеждат на MS среда и се трансплантират в саксии P7 (размер: 7 × 7 cm) при условия на растеж с дълъг ден (22 градуса, 16 часа светлина/8 часа тъмно). За да избегнем потенциално влияние върху околната среда, местихме и въртяхме саксиите ежедневно. За първоначалния скрининг на мутанти, ние създадохме две реплики, като отгледахме всеки мутант в две саксии, с Col-0 растения като контрола. След 2 седмици растеж след трансплантацията, всички мутанти бяха подложени на тест за предпочитание на ларви на P. xylostella от трети етап чрез сравняването им с Col-0, както е описано по-горе. Мутантите, които показват различни ларвни предпочитания от Col-0, се считат за кандидат-устойчиви или чувствителни мутанти и са избрани за по-нататъшно експериментално валидиране и функционални изследвания.

2.4|Плазмидна конструкция и генна трансформация

За конструкцията RPX1pro: RPX1 геномният кодиращ регион RPX1 с 1,6 kb последователност нагоре и 1 kb последователност надолу беше PCR-амплифициран от геномна ДНК, извлечена от Col-0. Сглобеният ДНК фрагмент беше клониран във вектора pGreenII-0179 и трансформиран в rpx1-1 мутант, използвайки метода на флорално потапяне (Clough & Bent, 1998). За конструиране на RPX1pro: RPX1-GFP, RPX1 промотор (1,6 kb), кодиращ регион и 1 kb 3' нетранслирани последователности бяха PCR-амплифицирани от Col-0 геномна ДНК. GFP фрагмент се амплифицира от плазмид, съдържащ GFP последователности. Тези ДНК фрагменти бяха сглобени във вектора pGreenII-0179 с помощта на метода на рязане и лигиране и след това трансформирани в rpx1-1 мутант. За 35Spro: RPX1-FLAG конструкт, RPX1 кодиращите последователности бяха PCR-амплифицирани от сДНК, обратно транскрибирана от Col-0 иРНК. PCR фрагментът се клонира във вектор pCambia1300-FLAG, като се използва методът на инфузия (Clontech) и се трансформира в Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) и 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): Кодиращите последователности на тези гени бяха PCR-амплифицирани от Col-0 cDNA и лигирани във вектора pLGNL-35S. Изкуствена микроРНК (amiR), насочена към PEN1, е проектирана, както е описано по-горе (Schwab et al., 2006), амплифицирана с помощта на плазмид pRS300 като матрица и лигирана в модифицирана версия на вектора pCambia1300m. Всички праймерни последователности са изброени в поддържаща информация: Таблица S1.

2.5|Анализи на активността на глутатион s-трансфераза (GST) и цитохром Р450 (CYP450) в ларвите на P. xylostella

След като ларвите на P. xylostella от второ поколение бяха хранени с Col-0 или rpx1-1 разсад в продължение на 72 часа, те бяха събрани и смлени на фин прах в течен азот. Анализите бяха извършени с помощта на GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, cat: A004) и комплекти за анализ на активността на CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company, cat: P450), съгласно инструкциите на производителя. Всеки анализ имаше три биологични реплики и всяка реплика включваше 30 ларви на P. xylostella.

2.6|Смърф анализи

Разсад Col-0 или rpx1-1 на три седмици се използва за хранене на ларви на P. xylostella от втори етап. Анализът беше извършен, както е описано по-рано с незначителни модификации (Chen et al., 2021). Бяха използвани шест биологични реплики и всяка реплика съдържаше 15 ларви на P. xylostella.

2.7|Микроскопско наблюдение на структурата на ПМ на ларви

Анатомичният анализ на структурата на ларвния PM и парафиновият анализ на напречното сечение на червата на ларвата бяха извършени, както е описано по-горе (Chen et al., 2021).

2.8|Анализ на генната експресия и секвениране на транскриптоми (RNA-seq)

Col-{{0}} и rpx1-1 разсад се отглеждат при условия на растеж с дълъг ден (16 часа светлина, 8 часа тъмно) при 22 градуса. Двуседмични Col-0 и rpx1-1 разсад бяха използвани за секвениране на транскриптоми. Всяка проба съдържа три биологични реплики. Общата РНК се екстрахира с помощта на RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN, каталожен номер: DP441). Първоверижните сДНК се синтезират чрез обратна транскрипция, като се използва едноетапна RT система (Takara Bio) съгласно инструкциите на производителя. qRT-PCR беше проведена с генно-специфичните праймери, изброени в Подкрепяща информация: Таблица S1 на инструмент Roche Light Cycler 480. Конструирането и секвенирането на RNA-seq библиотеки бяха извършени с помощта на Biomarker (Пекин, Китай) на платформа Illumina HiSeq. И накрая, използвахме edgeR, за да извършим диференциален анализ на експресията (прагът на значителна разлика беше зададен:|log2foldchange|По-голямо или равно на 1, p <0.05). Бяха извършени три биологични реплики за Col-0 и rpx1-1, а диференциално експресираните гени са изброени в набор от данни S1.

2.9|Анализ чрез екстракция и газова хроматография и масова спектрометрия (GC-MS) на DMNT и DMNT-2 H в Arabidopsis

Извличането и анализът на DMNT бяха извършени, както е описано по-горе с незначителни модификации (Sohrabi et al., 2015). В анализите 2 g 3-седмични разсад на Arabidopsis бяха използвани за екстракция и измерване на DMNT.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|Приготвяне и характеризиране на DMNT

DMNT беше синтезиран, както е описано по-горе, с незначителни модификации (HJ Huang & Yang, 2007). Накратко, колба с кръгло дъно от 500 ml, снабдена с магнитна бъркалка с тефлоново покритие, се зарежда с 1 g (6,48 mmol) алилов алкохол и 50 ml дихлорометан. Разтворът се разбърква енергично и се третира с 3,6 g активен манганов диоксид, последвано от добавяне на 1-2 g окислител на всеки 2-3 часа до завършване на реакцията. След това продуктът се използва за генериране на желаното съединение чрез реакция на ум. Структурата и чистотата на DMNT бяха потвърдени чрез 1Н ядрено-магнитен резонанс (NMR) и 13C NMR спектроскопски подходи.

2.11|DMNT лечение на P. xylostella

Анализите бяха извършени в петриеви панички, покрити с прозрачни пластмасови филми с множество дупки. DMNT се разрежда в парафиново масло (Sigma-Aldrich) до желаната доза (2,5 nmol/L−25 μmol/L) и се инжектира във фуража, както е описано в текста. Всички анализи бяха извършени в шест биологични реплики, като всяка реплика се състоеше от 15 ларви. Растежът на ларвите е записан чрез фотографска документация. Като контрола се използва фураж, инжектиран със същия обем разтворител парафиново масло.

2.12|Измерване на съдържанието на JA и SA в разсад на Arabidopsis

Анализите са проведени от Nanjing Convinced-test Technology Company. Двуседмични разсад Col-{{0}} и rpx1-1 бяха заразени с 15 s-instar ларви на P. xylostella, с незаразени разсад като контрола. Поставихме две ларви на всяко растение от заразената група, за да гарантираме, че всички растения са заразени. След 24 часа бяха събрани растителни проби и бързо замразени в течен азот за определяне на JA и SA. Пробите се стриват до фин прах в течен азот и се екстрахират с екстракционен разтвор на изопропанол-вода-солна киселина, последвано от добавяне на 8 ul деутерирана салицилова киселина (D-SA) и дихидро жасмонова киселина (2HJA) (1 ug /ml всеки) като вътрешни стандарти. След това се добавя дихлорометан и разтворът се разбърква добре на ротатор за 30 минути. След като долната органична фаза беше получена чрез центрофугиране при 13,{{1{{20}}} rpm за 5 минути, тя беше изсушена с продухване с азот, повторно разтворена в метанол (0 .1% мравчена киселина) и след това се центрофугира при 13,000 g за 10 min. Накрая, супернатантата се филтрува през 0,22 μm органична филтърна мембрана и се анализира чрез високоефективна течна хроматография, съчетана с масспектрометрия (HPLC-MS/MS). Всички етапи на екстракция се извършват при 4 градуса. Идентичностите на JA и SA бяха определени въз основа на пиковото време на целевите вещества и съотношението маса към заряд (m/z) на съответните йони. Количественото определяне на JA и SA беше монтирано с помощта на уравнение на линейна регресия, получено от вътрешни стандартни криви. За получаване на кривата на вътрешния стандарт се приготвят стандартни разтвори на SA и JA с градиенти от 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 и 200 ng/ml, като се използва метанол (0,1% мравчена киселина) като разтворител, и вътрешни стандартни разтвори с крайна концентрация от 20 ng/ml бяха добавени към действителната графика. Аномалиите на линейността бяха премахнати от уравненията на стандартните криви. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|Анализ на транспортирането на DMNT в Arabidopsis

DMNT се разтваря в DMSO и се добавя към MS среда без глюкоза. Триседмични растения Arabidopsis бяха прехвърлени в епруветки и техните корени бяха потопени в MS среда с DMNT или DMSO (контрола). За да се предотврати замърсяване, епруветките бяха покрити с два слоя парафилм и във филма беше направен малък отвор, през който корените на растението бяха позиционирани в MS среда за по-нататъшен растеж. След 24 часа корените на третираните растения бяха отстранени и листата им бяха използвани за хранене на P. xylostella, след което бяха анализирани оцеляването на ларвите и степента на какавидиране. Същият експеримент се повтаря с растежна среда, съдържаща или 2H-белязан DMNT или DMSO като контрола. След 24 часа инкубация, листата се събират и обработват за GC-MS анализ. За да се изключи възможността DMNT да се изпари от DMNT среда към въздушните части и да причини проследяване на замърсяване, беше създадена контролна група по същия начин, но корените на растението бяха заровени с влажен памук и не бяха потопени в DMNT среда. След 24 часа надземните части бяха събрани за по-нататъшен биоанализ или откриване на DMNT с помощта на GC-MS.

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

2.14|Екстракция на протеин и имуноблотинг анализ на RPX1 в Arabidopsis след заразяване с P. xylostella и лечение на рани

Създадохме два вида третиране на трансгенен RPX1pro: RPX1-GFP и 35Spro: RPX1-FLAG разсад на Arabidopsis: заразяване и нараняване с P. xylostella. За заразяване с ларви отглеждахме разсад на Arabidopsis в продължение на 2 седмици и ги хранихме с ларви от второ поколение (поставете поне една ларва върху всеки разсад), след 15-120 минути ларвите бяха отстранени и заразените разсад бяха избрани и събрани за допълнителни експерименти. За да имитираме нараняване, използвахме игла от спринцовка от 1 ml, за да създадем дупка във всяко листо на Arabidopsis. След 15-120 минути растеж, разсадът се събира.

За да определим дали заразените с P. xylostella растения могат да предизвикат разграждане на RPX1, заразихме Col-0 разсад с P. xylostella за 15−120 минути и тествахме влиянието му върху RPX1-GFP в трансгенни растения. Всички проби бяха смлени на прах в течен азот и след това равни количества заразени и неинвазирани Col-0 бяха отделно смесени със същото количество RPX1-GFP тъкани и инкубирани в разтвор при 4 градуса за 15 минути. Накрая, сместа се центрофугира и супернатантата се подлага на имуноблотинг анализ. За Western blot анализ общите протеини се екстрахират с буфер за протеинова екстракция [50 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 2.5 mmol/L EDTA pH8.0, 150 mmol/L NaCl, 1/1000 IGPAL ( v/v), 10% глицерол (v/v), 7% 2-меркаптоетанол (v/v), 1 mmol/L PMSF и 1 × протеиназен инхибиторен коктейл (Roche)]. След това протеиновият екстракт се използва за PAGE разделяне и имуноблотинг анализ с антитела срещу GFP (Roche, разреждане: 1/1000) и FLAG (Abcam, разреждане: 1/2000). Изображенията бяха заснети с помощта на система за хемилуминесцентен анализ Tanon 5200.

3|РЕЗУЛТАТИ

3.1|Мутантът Arabidopsis rpx1 има подобрена резистентност към P. xylostella

За да идентифицираме гени, участващи в резистентността на P. xylostella, ние събрахме 179 мутанта на Arabidopsis и ги отгледахме в контролирана оранжерия. Две седмици след трансплантацията, ние проведохме тест за предпочитание на ларви на P. xylostella от трети етап в отговор на всеки мутант и див тип Col-0. В този експеримент за скрининг 15 мутанта показаха различни влияния върху предпочитанията на ларвите (данните не са показани) и един от тях беше избран за това изследване и обозначен като rpx1-1 (резистентност към P. xylostella). RPX1 кодира нов cap-свързващ протеин (nCBP) (Ruud et al., 1998). Мутантът за вмъкване на Т-ДНК беше SALK_131503 и генната експресия на RPX1 беше значително понижена в сравнение с дивия тип Col-0 (Фигура 1a, Подкрепяща информация: Фигура S1a, Подкрепяща информация: Таблица S1). Когато са засадени наблизо, растенията rpx1-1 показват значително по-ниско ниво на увреждане от ларвите на P.xylostella в сравнение с растенията от див тип (Подкрепяща информация: Фигура S1b).

ФИГУРА 1 Инактивирането на RPX1 придава устойчивост на Plutella xylostella в Arabidopsis. ( а ) Генна структура на RPX1 (At5g18110). Оранжевите кутии показват екзони, а плътните линии представляват интрони и нетранслирани региони. Вмъкването на Т-ДНК в SALK_131503, наречено rpx1-1, е на четвъртия екзон. (b) Ларвите на P. xylostella преференциално се движат към дивия тип Col-0 и RPX1 допълващи линии (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1com), в сравнение с rpx1-1. (c) Сравнение на Col- 0, rpx1-1 и RPX1com листа, заразени с P. xylostella. (d) Ларвите на P. xylostella бяха силно засегнати от rpx1-1, в сравнение с тези от дивия тип Col-0 и линиите RPX1com, по отношение на ръста, размера и цвета на ларвите. (e, f) Ларвите на P. xylostella, хранени с rpx1-1, показват по-висока смъртност (e) и по-ниски нива на какавидиране (f) в сравнение с линиите Col-0 и RPX1com от див тип. (g, h) Ларвите на P. xylostella, хранени с растения rpx1-1, имат повишена активност на глутатион S-трансфераза (GST, g) и цитохром P450 (CYP450, h), докато при ларвите, хранени с RPX1com, дейностите не показват разлика от тези на Col-0. В (b, e–h) данните са представени като средно ± sem Различните букви при всяко третиране показват значителна разлика (еднопосочен анализ на дисперсията, n=3 за b, g, h, n {{ 36}} за e, f).

За да определим механизма, лежащ в основата на резистентността на rpx1-1 към заразяване с P. xylostella, ние проведохме тестове за предпочитания и без избор. В предпочитаните експерименти ларвите на P. xylostella бяха поставени в центъра на стъклената епруветка на еднакво разстояние от Col-0 и rpx1-1 разсад, след 10–6{{11} } min, значително повече ларви се събраха от страната Col-0, отколкото тези от страната rpx1-1 (Фигура 1b). В експериментите без избор, ние хранихме Col-0 и rpx1-1 разсад поотделно с ларвите на P. xylostella и наблюдавахме, че Col-0 губи повече листни тъкани, отколкото rpx1-1 мутанта (Фигура 1c). За да потвърдим, че RPX1 е причинителният ген за наблюдаваната резистентност, ние въведохме комплементарна конструкция на RPX1 в rpx1-1 мутанта. Тези RPX1 допълващи линии (RPX1pro: RPX1/rpx1-1, RPX1com) са податливи на заразяване с P. xylostella, както е определено от тестовете за предпочитания и без избор (Фигура 1b,c), които предполагат, че RPX1 участва в резистентността на Arabidopsis към P. xylostella.

3.2|Растежът на ларвите на P. xylostella е отрицателно повлиян от rpx1-1 мутацията

За да изследваме физиологичния отговор на P. xylostella при хранене с rpx1-1 мутанти, ние инспектирахме развитието на ларвите след хранене с 3-седмични растения от Col-0, rpx1-1 и RPX1com линии. Ларвите, хранени с растения rpx1-1, показват силно компрометирано развитие по отношение на размера на тялото. Цветът на тялото на ларвите също е различен от този на ларвите, хранени с Col‐0 растения. Ние обаче не наблюдавахме такива промени в ларвите, хранени с разсад RPX1com (Фигура 1d). Допълнителен фенотипен анализ показа, че ларвите на P. xylostella, хранени с rpx1-1, имат значително по-висока смъртност и по-ниски нива на какавидиране от тези, хранени с Col-0 или RPX1com (Фигура 1e,f). В допълнение, ларвите, хранени с rpx1-1, показват по-високи ензимни активности на GST и CYP450, които са биомаркери за увреждане на органи или тъкани (Cheng et al., 2018; Mikstacki et al., 2015), отколкото тези на Col-0 и RPX1com (Фигура 1g, h), което предполага, че тъканта на ларвата може да бъде наранена от храненето на rpx1-1.

3.3|Средното черво на ларвите на P. xylostella се уврежда след хранене с растения rpx1-1

Ние наблюдавахме, че ларвите, хранени с rpx1-1, консумират по-малко растителни тъкани и произвеждат много по-малко изпражнения, отколкото тези, хранени с Col-0 от див тип; следователно предположихме, че храносмилането на ларвите, хранени с rpx1-1, може да бъде засегнато. За да проверим дали се е случило изтичане в червата на ларвите, хранени с rpx1‐1, ние проведохме „смърф теста“. Ларвите, хранени с линии Col-0 и RPX1com от див тип, дефекираха багрилото и в тялото на ларвите визуално не беше останало багрило, докато ларвите, хранени с rpx1-1, задържаха значително количество багрило в средното черво и околните тъкани, а ларвите стават сини (Фигура 2а). Количествен анализ на сини („смърф“) и нормални („без смърф“) ларви показа, че храненето с растения rpx1-1 води до повече от три пъти индивиди, показващи „смърф“ в сравнение с тези, хранени с див тип Col-{{ 14}} или RPX1com (Фигура 2b). Тези резултати предполагат, че храненето с rpx1-1 може да причини лезии и по-висока пропускливост в средното черво на ларвите.

3.4|Перитрофичният матрикс на P. xylostella е повреден от хранене на rpx1-1 разсад

Освен това дисектирахме и изолирахме перитрофична матрица (PM) от ларвите, хранени с Col-{{0}}, rpx1-1 и RPX1com разсад за структурен анализ под стереомикроскоп. В сравнение с непокътнатия и отвесен PM на ларвите, хранени с Col-0 и RPX1com, ларвите, хранени с rpx1-1, показват характеристики на увреждане и са тънки, хлабави и прекъснати (Фигура 2c-f). За по-нататъшно потвърждаване на характеристиките на увреждане на PM, получихме напречни сечения на пробите от ларви. Резултатите от оцветяването с хематоксилин-еозин (HE) разкриха, че PM на ларвите, хранени с Col-0, е дебел и непокътнат и че има ектоперитрофно пространство (ES) между PM и епидермалните клетки на средното черво (Фигура 2g). Обратно, РМ в средното черво на ларвите, хранени с rpx1-1, беше силно нарушен и чревното съдържание беше близо до чревната стена (не, Фигура 2h). Когато ларвите бяха хранени с разсад RPX1com, техните PM и ES не бяха значително променени (Фигура 2i,j). Тези резултати потвърждават, че нокдаунът на RPX1 уврежда PM на ларвите на P. xylostella.

3.5|Натрупването на съдържание на DMNT в rpx1-1 придава резистентност към ларвите на P. xylostella

За да проучим дали нокдаунът на RPX1 променя метаболитите на Arabidopsis и води до резистентност към ларвите на P. xylostella, ние сравнихме летливите органични съединения (ЛОС), освободени от растения rpx1-1 и Col-0 от див тип. Четири летливи органични съединения (хексанол, 3-етил-5-метил, октанс, 2,6-диметил, нонан, 2,6-диметил и DMNT) се натрупват различно между rpx1-1 и Col-0 (Фигура 3а). За по-нататъшна дисекция на молекулярния механизъм на rpx1-1 в P. xylostella резистентност, ние извършихме RNA-seq анализ. В сравнение с Col-0, мутантът rpx1-1 показва 211 диференциално експресирани гена (DEG) (Подкрепяща информация: Набор от данни S1). Анализът на обогатяване на KEGG показа, че тези DEG принадлежат към повече от 2 0 различни метаболитни пътя, включително биосинтеза на сесквитерпеноиди и тритерпеноиди, метаболизъм на алфа-линоленова киселина и пътища на метаболизъм на тирозин (Фигура 3b, Подкрепяща информация: Таблица S2). Трябва да се отбележи, че най-значително обогатеният път е биосинтезата на сесквитерпеноиди и тритерпеноиди, която се състои от три DEG: At4g15340, At5g42600 и At5g48010 (Фигура 3b, Поддържаща информация: Фигура S2a–c). Съобщава се, че At4g15340 кодира PEN1, оксидосквален циклаза, която превръща 2,3-оксидосквален в арабидиол и води до синтеза на биоактивен DMNT чрез CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi et al., 2015). At5g42600 кодира минерална синтаза 1 (MRN1), която е ключов компонент в минералната биосинтеза. At5g48010 кодира талианол синтазата (THAS), ензим, участващ в биосинтезата на талианол. Съобщава се, че марнерал и талианол участват в поддържането на развитието на растенията (Field & Osbourn, 2008; Go et al., 2012) (Подкрепяща информация: Фигура S3). Изследвахме потенциалните роли на MRN1 и THAS в резистентността към насекоми, като изследвахме предпочитанията, смъртността и нивата на какавидиране на P. xylostella, като ги хранихме с трансгенни разсади на Arabidopsis, свръхекспресиращи MRN1 (35Spro: MRN1) и THAS (35Spro: THAS) (Поддържащи Информация: Фигура S4a,b). Не беше открита значителна разлика между двата трансгена и дивия тип Col-0 (Подкрепяща информация: Фигура S4c–n), което предполага, че устойчивостта на насекоми на rpx1-1 вероятно не зависи от тези два гена.

ФИГУРА 2 Инактивирането на RPX1 уврежда структурата на перитрофичния матрикс (PM) в средното черво на ларвите. (a) Представителни изображения на ларви, хранени с линии Col-0, rpx1-1 и RPX1com, показващи задържане на багрилото, както се вижда от техния син външен вид, като анимационния герой на Смърф. (b) Количественото определяне на резултатите е показано в (a). Данните са представени като средно ± sem; различните букви показват значителна разлика (еднопосочен анализ на дисперсията, n=6). (c–f) PM ултраструктура на ларви, хранени с Col-0 (c), rpx1-1 (d) и RPX1com линии (e, f). Имайте предвид, че PM на ларвите, хранени с Col-0 и RPX1com, е плътен и непокътнат, но PM на ларвите, хранени с rpx1-1, е тънък, деликатен и прекъснат в някои региони. (g–j) Напречен разрез и оцветяване с хематоксилин-еозин показват увреждане на PM от ларвите, хранени с Col-0 (g), rpx1-1 (h) или RPX1com линии (i, j). [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

Обогатяването на терпеноидната биосинтеза в KEGG анализа (Фигура 3b) и различното натрупване на DMNT, открито в rpx1-1 (Фигура 3a), предполагат, че DMNT може да бъде едно от съединенията, участващи в резистентността на растенията към P. xylostella. Подобно на предишни доклади, които едва откриват DMNT чрез GC-MS анализ в Col-0 (Liu et al., 2018; Sohrabi et al., 2015), бихме могли да открием следи от DMNT в незаразени Col-0 (Фигура 4a,b). Обратно, нивата на DMNT бяха силно обогатени (~8 ng/g) в rpx1-1, а линиите RPX1com показаха много ниски нива на DMNT, подобни на тези в Col-0 растения (Фигура 4). В допълнение, при заразяване с P. xylostella, нивата на DMNT се повишават (~20 ng/g) в rpx1-1, което е по-високо от това в линиите Col-0 и RPX1com (Фигура 4) . Ние синтезирахме DMNT in vitro, използвайки модифициран метод (Chen et al., 2021). В съответствие с предишни наблюдения (Chen et al., 2021), DMNT потиска растежа на P. xylostella, както се вижда от предпочитанията (2,5 μmol/L) и ефективността без избор (0,25–25 μmol/L) ( Поддържаща информация: Фигура S5a,b). Освен това, резултатите от оцветяването с HE разкриват, че PM на контролните ларви е дебел и непокътнат (Подкрепяща информация: Фигура S5c), докато PM на ларви, третирани с 2,5 μmol/L DMNT в продължение на 48 часа, е тънък и прекъснат в някои региони (Подкрепяща информация: Фигура S5d). Взети заедно, нашите открития предполагат, че мутацията rpx1-1 причинява натрупване на DMNT, което допринася за убиването на ларвите на P. xylostella в Arabidopsis. JA и SA са растителни вторични метаболити, които са тясно свързани с биотичния стрес. За да определим дали тези вещества допринасят за устойчивостта на насекоми на rpx1-1, ние проверихме нивата на JA и SA на Col-0 и rpx1-1 преди и след заразяване с P. xylostella. При нетретирани условия няма значителна разлика в нивата на JA и SA между растенията rpx1-1 и Col-0 (Подкрепяща информация: Фигура S6) и нивата на двата хормона се повишават значително 24 часа след заразяване с P. xylostella . Трябва да се отбележи, че след заразяване съдържанието на SA е значително по-ниско в rpx1-1 в сравнение с Col-0, докато съдържанието на JA е много по-високо в rpx1-1, отколкото в Col-0 (Подкрепяща информация: Фигура S6).

ФИГУРА 3 Сравнение на летливи съединения и генна експресия, различно обогатена между Col-0 и rpx1-1. (a) Диференциално обогатени летливи съединения в Col-0 и rpx1-1 бяха открити чрез метода на газова хроматография-масспектрометрия (GC-MS). Данните са представени като средно ± sem; звездичките показват значителна разлика (*p < 0.05, **p < 0.01, двустранен нечифтен t-тест). ( b ) Транскриптомичен анализ на Col-0 и rpx1-1. KEGG анализ на обогатяване на пътя от различно експресирани гени между Col-0 и rpx1-1 мутанта. Един обогатен път (червена стрелка) е свързан със сесквитерпеноидната и тритерпеноидната биосинтеза и се състои от три гена, както е показано на фигурата. [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

3.6|RPX1 регулира натрупването на DMNT в зависимост от PEN1

За да изследваме приноса на PEN1 в rpx1-1 регулираното натрупване на DMNT, ние генерирахме конструкция, съдържаща изкуствена miRNA (PEN1amiR) и я трансформирахме в rpx1-1 мутанти. Ние също така генерирахме конструкция за свръхекспресия на PEN1, която беше трансформирана в Col-0 (35pro: PEN1/Col-{{10}}). Анализът на генната експресия показа, че PEN1 е свален (4-7 пъти) в PEN1amiR/rpx1-1 в сравнение с този на rpx1-1 и е свръхекспресиран (~2,5 пъти) в 35Spro: PEN1 в сравнение с Col-0 (Фигура 5а). В тези трансгенни линии, експресията на RPX1 не е повлияна от PEN1 нокдаун или свръхекспресия (Фигура 5b). При заразяване с P. xylostella за 6-24 часа, експресията на PEN1 беше значително повишена в Col-0 и rpx1-1 и много по-висока експресия на PEN1 беше постигната в rpx1-1 след 24 часа заразяване (Фигура 5в) . След това измерихме съдържанието на DMNT в Col-0, rpx1-1, PEN1amiR/rpx1-1 и 35Spro: PEN1/Col-{{50}}. Без заразяване с P. xylostella, rpx1-1 произвежда по-високи нива на DMNT от Col-0 (Фигура 5d,e,f,k,l), а когато PEN1 е повален от изкуствена микроРНК в rpx1-1 (PEN1amiR /rpx1-1), нивата на DMNT бяха регулирани надолу, показвайки много по-ниско ниво от това в rpx1-1 (Фигура 5d,g,h,m,n). При заразяване с ларви, нивата на DMNT в Col-0 и rpx1-1 разсад бяха значително повишени, но в PEN1amiR/rpx1-1 разсад, нивото на DMNT не можеше да бъде индуцирано и беше много по-ниско от това в rpx1-1 (Фигура 5d, g, h, m, n), което предполага, че PEN1 може да играе важна роля в RPX1-регулираната DMNT биосинтеза, както е илюстрирано в поддържаща информация: Фигура S3. В съответствие с това, DMNT беше силно натрупан в 35Spro: PEN1/Col-0 разсад (Фигура 5d, i,j,o,p).

ФИГУРА 4 Загубата на RPX1 увеличава натрупването на диметил-1,3,7-нонатриен (DMNT). (a) анализ с газова хроматография-масспектрометрия (GC-MS) на DMNT в линии Col-0, rpx1-1 и RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1). Стандартът DMNT е показан в долната част. (b) Обща йонна хроматография (TIC) на DMNT, уловен от Col-0, rpx1-1 и RPX1com. (c) Съдържанието на DMNT се увеличава в мутанта rpx1-1, но се връща към нивата от див тип в трансгенните растения RPX1com. Данните са представени като средно ± sem; различните букви показват значителна разлика (еднопосочен анализ на дисперсията, n=3). [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

3.7|PEN1 допринася за унищожаването на P. xylostella в rpx1-1

Като се има предвид наблюдението, че нокдаунът на PEN1 може да намали натрупването на DMNT, предизвикано от инактивирането на RPX1 (Фигура 5), ние проведохме биотестове на нокдаун на PEN1 и свръхекспресия на трансгенен Arabidopsis, за да демонстрираме неговата биологична роля. Ние открихме, че ларвите на P. xylostella не показват предпочитание към растения amiR-PEN1/rpx1-1 в сравнение с Col-0 (Подкрепяща информация: Фигура S7). Междувременно ларвите на P. xylostella, хранени с PEN1-amiR/rpx1-1, показват значително по-ниска смъртност и по-високи нива на какавидиране в сравнение с rpx1-1, докато ларвите, хранени с 35Spro: PEN1/Col-0, показват по-висока смъртност и по-ниско образуване на какавиди от тези, хранени с Col-0 (Фигура 6a,b). В съответствие с тези резултати, по-нататъшни „Smurf тестове“ и експерименти с трансекция показват, че PEN1-amiR/rpx1-1 има нормални и непокътнати черва и PM в сравнение с ларвите, хранени с rpx1-1 (Фигура 6c,d,g,h), и прекомерната експресия на PEN1 причинява сериозно увреждане на средното черво и PM на ларвите на P. xylostella (Фигура 6c,d, i,j). Тези резултати предполагат, че нокдаунът на PEN1 може да потисне отрицателните ефекти върху растежа на ларвите, причинени от инактивирането на RPX1, като по този начин играе важна роля в индуцираното от rpx1-1-токсично влияние върху ларвите на P. xylostella.

3.8|DMNT транспортира от корените до надземните части на Arabidopsis 

Съобщава се, че PEN1 се експресира главно в корените на Arabidopsis (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (Подкрепяща информация: Фигура S8a), което е различно от резултатите, които показват надземните части на rpx1-1 токсичност за P. xylostella по PEN1-зависим начин (Фигура 6). Затова формулирахме алтернативна хипотеза: растенията синтезират DMNT главно в корените и го транспортират до надземните части, където насърчава устойчивостта към насекоми. За да тестваме тази хипотеза, направихме два анализа за транспортиране на DMNT. При първия анализ (Фигура 7а) ние инкубирахме корените на 3- 3-седмични разсади на Arabidopsis в течна растителна среда за растеж, съдържаща 2,5 μmol/L DMNT, използвайки DMSO като контрола. След култивиране в продължение на 24 часа, ние изрязахме листата на Arabidopsis и ги предложихме на ларвите на P. xylostella. В сравнение с контролата с DMSO, листата от третирани с DMNT растения причиняват значително по-висока смъртност на ларвите и по-ниски нива на какавидиране в сравнение с контролата (Фигура 7b,c). Във втория експеримент, целящ да получи допълнително независимо валидиране на транспорта на DMNT, ние маркирахме DMNT с 2 H и добавихме DMNT-2 H към течната среда за растеж на растенията. След 24 часа инкубация, DMNT-2H беше силно обогатен в листата (Фигура 7d–i). За да изключим възможността DMNT да се изпари от течната растежна среда във въздуха и да замърси надземните части на растенията, ние създадохме паралелен контрол, който беше извършен по същия начин, както на Фигура 7а, с изключение на това, че корените на Arabidopsis не бяха потопени в течност растежна среда. Резултатите показват, че не е открит DMNT‐ 2 H в надземните части на растенията (Подкрепяща информация: Фигура S8b,c). По този начин предлагаме DMNT да се премести от корените, където се произвежда, към листата на Arabidopsis, където причинява смърт на вредителите.

ФИГУРА 5 PEN1 играе важна роля в натрупването на диметил-1,3,7-нонатриен (DMNT) в rpx1-1. (a) Анализ на експресията на PEN1 в Col-0, rpx1-1, нокдаун на PEN1 в rpx1-1 фон (PEN1-amiR/rpx1-1) и свръхекспресия на PEN1 (35Spro:PEN1/Col-{{2{{ 22}}}}) линии. (b) RPX1 израз в Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 и 35Spro:PEN1/Col-0. (c) Експресията на PEN1 се индуцира от заразяване с Plutella xylostella в Col-0 и rpx1-1. (d) Сравнение на натрупването на DMNT между Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 и 35Spro:PEN1/Col-0. (e–j) анализ с газова хроматография-масспектрометрия (GC-MS) на летливи вещества, емитирани от Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) и 35Spro: PEN1/ Col-0 (i, j) линии. (k–p) TIC на DMNT, уловен от Col-0 (k), rpx1-1 (l), PEN1-amiR/rpx1-1 (m, n) и 35Spro: PEN1/Col-0 (o, p) линии , съответстващи на данните в (e–j). В (a-d) данните са представени като средно ± sem; различните букви показват значителна разлика (еднопосочен анализ на дисперсията, n=3). [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

3.9|RPX1 се разгражда от заразяване с P. xylostella и лечение на рани

Ние показахме, че експресията на PEN1 е регулирана нагоре в rpx1-1 и разсад на Arabidopsis, заразени с ларви на P. xylostella (Фигура 5a, c), повишавайки възможността RPX1 също да реагира на заразяване с ларви. За да потвърдим тази прогноза, ние изследвахме потенциалния отговор на RPX1 към заразяване с P. xylostella. Анализът на генната експресия показа, че RPX1 се експресира в различни тъкани (Подкрепяща информация: Фигура S9a), но няма значителен отговор на 6–24 h заразяване с ларви (Подкрепяща информация: Фигура S9b). Затова проверихме нивата на RPX1 протеин в RPX1pro: RPX1-GFP трансгенни растения чрез извършване на имуноблотинг. Резултатите показват, че без заразяване с ларви, RPX1-GFP е стабилен за 0-12{{40}} минути; за разлика от това, след заразяване с ларви за 15 минути, RPX1-GFP започва да се разгражда; след 120 минути протеинът RPX1-GFP спадна непрекъснато до приблизително 6% от началната времева точка (Фигура 8a, Подкрепяща информация: Фигура S10a). Като контрола, в разсад на Arabidopsis, съдържащ GFP трансген, GFP е относително стабилен след заразяване с ларви (Фигура 8b). За да изключим възможното влияние на GFP маркера върху стабилността на RPX1, ние генерирахме трансгенни RPX1 растения с маркер FLAG (35Spro: RPX1-FLAG), за да извършим експерименти за заразяване с ларви, които показаха последователни резултати, че RPX1-FLAG също може да бъде разграден от ларви заразяване, подобно на RPX1-GFP (Фигура 8в). Нашествието от насекоми често причинява наранявания в растенията, а физическото увреждане може частично да симулира процеса на хранене на тревопасни насекоми. За да демонстрираме дали нараняването може да предизвика разграждане на RPX1, използвахме игла, за да създадем дупки в листата на растението, за да имитираме нараняване и открихме, че RPX1-GFP се разгражда след 30 минути лечения (Фигура 8d, Подкрепяща информация: Фигура S10b). За да разберем по-добре причината за разграждането на RPX1 при заразяване с P. xylostella, ние инкубирахме тъканите на RPX1-GFP трансгенни растения заедно в разтвор за 15 минути с този на Col-0, който беше заразен от P. xylostella за 15–120 минути , или Col-0 тъкани без инвазия. Имуноблотинг анализът показа, че нивото на RPX1-GFP от пробите, инкубирани с предварително инфектиран Col-0, е много по-ниско от тези с неинфектиран Col-0 (Фигура 8e), което предполага, че заразяването с P. xylostella индуцира някои фактори или сигнали в Col-0 което може да доведе до деградация на RPX1.

3.10|rpx1-1 мутацията дава предимство в развитието и възпроизводството на растенията

Обща характеристика на специфичните за тревопасните защитни реакции е компромисът между устойчивостта на вредители и растежа и възпроизводството на растенията (Li et al., 2018). За да определим дали генотипът в локуса RPX1 е обект на такива компромиси, сравнихме производството на семена в Col-{{10}} и rpx1-1 мутанти. При липса на заразяване с P. xylostella, добивът на семена от растение е сходен между двата генотипа (Подкрепяща информация: Фигура S11). За разлика от това, излагането на 3-седмични растения rpx1-1 и Col-0 на заразяване с 15 s-старши P. xylostella само за 72 часа намалява крайния добив на семена от Col-0 три пъти, докато добивът на семена в rpx1-1 не е засегнат значително. Освен това, добивът на семена от RPX1com е подобен на този на Col-0, но много по-нисък от този на rpx1-1, което предполага, че инактивирането на RPX1 дава предимство в производството на семена при заразяване с ларви (Подкрепяща информация: Фигура S11). Ние също така оценихме производството на семена в 35Spro: PEN1 трансгенен Arabidopsis и наблюдавахме, че свръхекспресията на PEN1 води до по-висок добив на семена както при заразени с ларви, така и при неинвазирани условия (Подкрепяща информация: Фигура S11). Тези резултати предполагат, че мутацията на rpx1-1 и по-високата експресия на PEN1 придават резистентност към P. xylostella при липса на типично свързан компромис с растежа, подчертавайки потенциала на RPX1 и PEN1 в програми за молекулярно размножаване, насочени към подобряване на производството на култури.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

4|ДИСКУСИЯ

Вредителите драстично понижават агрономическите добиви и качеството, което прави растителната защита приоритетна и дългосрочна цел за фермерите и животновъдите. В това проучване идентифицирахме мутанта на Arabidopsis rpx1-1, който показа висока резистентност към P. xylostella, важен лепидоптер вредител по културите. Нашият анализ разкри, че мутацията на rpx1-1 е довела до по-високи нива на PEN1 транскрипт, натрупване на DMNT и подобрена устойчивост на растенията срещу вредители. Ние също така показахме, че протеинът RPX1 може да бъде разграден от заразяване с ларви и лечение на рани.

ФИГУРА 6 PEN1 допринася за повишената устойчивост на rpx1-1 към Plutella xylostella. (a, b) PEN1-amiR трансгенът значително облекчава резистентността на rpx1-1 към заразяване с P. xylostella, докато 35Spro: PEN1 засилва ефекта на резистентност, както се вижда от смъртността (a) и степента на какавидиране (b) на ларвите на P. xylostella . (c) Представителни изображения на ларвите, хранени с Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 и 35Spro: разсад PEN1, показващ задържане на боята, както се вижда от техния син вид, като карикатурата на Смърфовете характер. (d) Резултати от количественото определяне на изображения, показани в (c). (e–j) Напречен разрез и оцветяване с хематоксилин-еозин показват увреждане на PM от ларвите, хранени с Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) и 35Spro: PEN1 разсад (i, j). Данните са представени като средно ± sem; различните букви при всяко лечение показват значителна разлика в (a, b, d) (еднопосочен анализ на дисперсията, n=6). [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

При тестовете без избор, мутантът rpx1-1 показва значителна резистентност към заразяване с P. xylostella (Фигура 1в). Обратно, ларвите на P. xylostella, хранени с растения rpx1-1, показват тежки отрицателни нарушения на развитието (Фигура 1d, e). Тези фенотипове се дължат на инактивирането на RPX1, тъй като линиите на RPX1 допълване (RPX1com) са толкова податливи, колкото и дивият тип Col-0 (Фигура 1c–e), подкрепяйки заключението, че RPX1 участва в устойчивостта на вредители. В допълнение към убиването на ларвите, мутантът rpx1-1 също има дългосрочен ефект върху развитието на ларвите, включително какавидация (Фигура 1f), което води до намалено възпроизвеждане на вредителя.

ФИГУРА 7 Диметил-1,3,7-нонатриен (DMNT) се транспортира от корените на Arabidopsis до листата. ( а ) Илюстрация на DMNT транспортен анализ с използване на разсад от Arabidopsis. DMNT се разтваря в течна среда Murashige и Skoog. След 24--часова култура, корените бяха изрязани и листата бяха използвани за хранене на ларвите на Plutella xylostella за оценка на смъртността и степента на какавидиране. ( b , c ) DMNT, транспортиран от корените до листата, води до по-висока смъртност ( b ) и по-ниски нива на какавидиране ( c ) на ларвите на P. xylostella. (d–f) 2 H-маркиран DMNT (DMNT- 2 H) се транспортира от корена до листата. DMNT-2H се разтваря в течна MS среда, както в (а) в продължение на 24 часа, след което листата се събират за GC-MS анализ (д). DMSO се използва като контрола (d). Стандартът DMNT‐ 2 H е показан за справка (f). (g–i) TIC на DMNT-2H, получен по време на транспортните анализи, показани в (d–f). Данните са представени като средно ± sem, в (b, c) n=6, p-стойностите са показани в съседство с колоните на хистограмата, за да посочат значителна разлика (двустранен несдвоен t-тест). Обърнете внимание, че повече контроли за транспортните анализи са включени в поддържаща информация: Фигура S8. [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

Освен това, тестовете за предпочитания показват, че дивият тип Col-{{0}} и rpx1-1 мутанти могат да излъчват различни летливи съединения; един от тях е DMNT, който е ефективен при отблъскване на вредители (Фигури 1b, 3a, Подкрепяща информация: Фигура S5a). Въз основа на горните резултати, ние предлагаме, че натрупването на DMNT в rpx1-1 е една от причините за отравяне с насекоми. Съобщава се, че сигналните пътища на JA и SA участват в устойчивостта на насекоми (Costarelli et al., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). В това проучване, след 24 часа хранене с насекоми, съдържанието на JA и SA както в Col-0, така и в rpx1-1 мутанти се повишава и увеличението на съдържанието на SA в rpx1-1 е значително по-ниско от това в Col-0, докато увеличението на съдържанието на JA е много по-високо (Подкрепяща информация: Фигура S6), което предполага, че JA и SA могат също да играят важна роля в устойчивостта на rpx1-1 към P. xylostella. Следователно, ние предлагаме както преките, така и непреките ефекти на rpx1-1 да допринесат за повишена устойчивост на Arabidopsis срещу насекоми.

ФИГУРА 8 Разграждането на RPX1 протеин се индуцира от заразяване с Plutella xylostella и лечение на рани. (a) RPX1-GFP от RPX1pro: RPX1-GFP трансгенни растения се разграждат при заразяване с P. xylostella за 15−120 минути. (b) Като контрола за (a), самият GFP от 35Spro: GFP трансгенните растения не показват разграждане при заразяване с ларви. (c) RPX1-флаг от 35Spro: RPX1-флаг трансгенните растения се разграждат при заразяване с ларви. (d) RPX1-GFP от RPX1pro: RPX1-GFP трансгенните растения се разграждат с 15-120 минути лечение на рани. (e) RPX1-GFP от RPX1pro: RPX1-GFP трансгенни растения се разграждат, когато тъканите се инкубират в разтвор с тъканите от Col-0 растения, които са били заразени от P. xylostella за 15-120 минути. Стойностите под лентите за имуноблотинг показват относителното изобилие на протеини, определено количествено с помощта на ImageJ. Всички тези експерименти са повторени поне три пъти и са показани представителни резултати. Повече експериментални данни с независими трансгенни линии са показани в подкрепяща информация: Фигура S10. [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

Представяме няколко линии доказателства, демонстриращи как PEN{{0}}медиираното натрупване на DMNT допринася за функциите на RPX1 в устойчивостта на растенията към P. xylostella. PEN1, ключов ген, принадлежащ към пътя на сесквитерпеноидната и тритерпеноидната биосинтеза, беше идентифициран от KEGG анализа на RNA-seq данни от rpx1-1 мутант (Фигура 3b), осигурявайки връзка между RPX1, PEN1 и DMNT (Sohrabi et al. , 2015). В подкрепа на DMNT като едно от причинните съединения, които убиват ларвите на вредители, DMNT се натрупва по-високо в rpx1-1 мутанти, отколкото в Col-0 (Фигура 3a), но нивото в линиите RPX1com е обърнато на Col-0 ( Фигура 4a–c). В допълнение, химически синтезираният DMNT може да отблъсне и убие ларвите на P. xylostella (Подкрепяща информация: Фигура S5a, b), което е в съответствие с резултатите от rpx1-1 (Фигура 1b, e). Освен това, трансгенни растения, свръхекспресиращи PEN1, произвеждат повече от четири пъти повече от DMNT в Col-0 и придават подобна устойчивост на P. xylostella като rpx1-1 (Фигури 5d, i,j,o,p и 6).

Важно е, че намаляването на нивата на PEN1 транскрипт в rpx1-1 блокира биосинтезата на DMNT (Фигура 5d,g,h,m,n) и облекчава ефекта на убиване върху ларвите на P. xylostella, които са податливи на заразяване с P. xylostella (Фигура 6a,b ). Тези комбинирани резултати показват, че мутацията на PEN1 може да потисне функцията на инактивиране на RPX1 при устойчивост на вредители. RPX1 лезията причинява по-високо изобилие на PEN1 (Фигура 5а), въпреки това как точно RPX1 регулира PEN1 и медиира биосинтезата на DMNT, се нуждае от допълнителни проучвания. Тъй като RPX1 се предвижда като нов белтък, свързващ капачка, принадлежащ към семейството на eIF4E (Rhoads, 2009; Ruud et al., 1998), възможно е RPX1 да повлияе на PEN1, като повлияе на стабилността на иРНК или ефективността на транслация на протеини, което ще бъде важно тема в бъдещо проучване. Нещо повече, трябва да се отбележи, че нивата на DMNT все още могат да бъдат индуцирани до по-високо ниво от заразяване с P. xylostella в rpx1-1 мутанта (Фигура 5d), което предполага, че може да има някои други пътища, регулиращи натрупването на DMNT независимо от RPX1. DMNT е открит в широк спектър от растителни видове, като Arabidopsis (Sohrabi et al., 2015), памук (Liu et al., 2018) и царевица (Richter et al., 2016). В допълнение, той предоставя косвена защита срещу тревопасни вредители чрез привличане на хищници, позволявайки на растенията да отстранят заплахите от вредители (Kappers et al., 2005; Lee et al., 2010; Li et al., 2018). Наскоро съобщихме, че може да отблъсне и убие ларвите на P. xylostella чрез увреждане на PM в средното черво на ларвите (Chen et al., 2021). Тук открихме, че структурата на PM може да бъде сериозно повредена, когато ларвите са били хранени с rpx1-1 или PEN1 свръхекспресиращи разсад (фигури 2c–j и 6i,j). Тези резултати са в съответствие с констатациите в експериментите за лечение с DMNT, които описахме по-рано (Chen et al., 2021), като отново подкрепяме предложението, че натрупването на DMNT в rpx1-1 може да бъде един от факторите, допринасящи за отблъскването и смъртта на вредителите. RPX1 принадлежи към семейството на гените eIF4E (Rhoads, 2009) и участва в движението от клетка към клетка на растителни вируси (Keima et al., 2017). Въпреки това остава неясно дали натрупването на DMNT е свързано с вирусна резистентност в растенията. PEN1 е специфично експресиран в корените на Arabidopsis, където катализира биосинтезата на DMNT (Sohrabi et al., 2015).

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Последователно в това проучване открихме висока експресия на PEN1 в корените и много ниска експресия в листата (Подкрепяща информация: Фигура S8a). Наблюдавахме, че листата на мутанта rpx1-1 са токсични за ларвите на P. xylostella (Фигура 1), което предполага, че натрупването на DMNT и свързаната с него резистентност към вредители в листата не може просто да се обясни с минутна експресия на PEN1 в тези тъкани. Смислено, ние открихме, че DMNT може да се транспортира от корените на растението до надземните части, както е показано от анализи за транспортиране на DMNT и GC-MS анализ на екстракти от листа от растения, инкубирани с DMNT-2 H в техните корени (Фигура 7). Как това съединение се транспортира в растенията не е ясно и може да бъде тема за по-нататъшно изследване. Растенията имат способността да понасят и да се борят с атаките на насекоми по различни начини. Тук, чрез извършване на имуноблотинг анализ на RPX1pro: RPX1-GFP и 35Spro: RPX1-FLAG трансгенни растения, открихме, че при заразяване с P. xylostella протеинът RPX1 може да се разгради бързо (Фигура 8a,c, Подкрепяща информация: Фигура S10a), докато , на нивото на експресия на иРНК, RPX1 остава незасегнат (Поддържаща информация: Фигура S9b). Понастоящем как се разгражда протеинът RPX1 остава неясно, но нашите данни предполагат предимно, че механизмът на разграждане на протеина може да бъде включен в сигналните пътища на нараняване (Фигура 8d, Поддържаща информация: Фигура S10b).

Освен това предварително заразеният с P. xylostella Col-0 индуцира разграждане на RPX1-GFP в различни растения (Фигура 8e), което предполага, че заразяването с P. xylostella може да причини натрупване на сигнали в растенията, което от своя страна може да доведе до RPX1 деградация. Ще бъде интересно да разберем идентичността на сигналите в бъдеще. Тази характеристика на разграждането на RPX1 е важна за растенията, което може да доведе до натрупване на DMNT и да осигури бърз отговор на увреждане от вредители (Подкрепяща информация: Фигура S3). Повишената толерантност на растенията към вредители често е за сметка на годността. Наблюдението, че мутацията rpx1-1 води до повишена устойчивост (Фигура 1) и по-високо производство на семена (Подкрепяща информация: Фигура S11) в Arabidopsis без значителни компромиси, предлага обещаващ път за създаване на култури с по-висока устойчивост на вредители. Например редактирането на генома чрез CRISPR-Cas9 е мощен инструмент за подобряване на културите (Yang et al., 2017), който позволява въвеждането на мутации в RPX1 и потенциално разширява приложенията му към различни култури.

ПРЕПРАТКИ

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. & Takabayashi, J. (2000) Индуцираните от растителноядните летливи вещества предизвикват защитни гени в листата на боб от Лима. Природа, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Wang, C., Tao, Z. et al. (2021) Летливият DMNT предпазва директно растенията от Plutella xylostella, като разрушава перитрофната матрична бариера в средното черво на насекомото. eLife, 10, e63938.

Cheng, X., Hu, J., Li, J., Chen, J., Wang, H., Mao, T. и др. (2018) Увреждането на копринените жлези и транскрипционният отговор на гени, свързани с детоксикиращи ензими на Bombyx mori при излагане на фоксим. Chemosphere, 209, 964–971.

Clough, SJ & Bent, AF (1998) Floral dip: опростен метод за Agrobacterium-медиирана трансформация на Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. et al. (2020) Салициловата киселина, предизвикана от храненето на тревопасни животни, противодейства на защитата на растенията, медиирана от жасмоновата киселина срещу нападение от насекоми. Сигнализиране и поведение на растенията, 15, e1704517.

Дъглас, AE (2018) Стратегии за повишена устойчивост на културите към насекоми вредители. Годишен преглед на растителната биология, 69, 637–660.

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) Цветен аромат, метил бензоат, е ефективен зелен пестицид. Научни доклади, 7, 42168.

Field, B. & Osbourn, AE (2008) Независимо от метаболитната диверсификация сглобяване на оперон-подобни генни клъстери в различни растения. Наука, 320, 543–547.

Go, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK et al. (2012) Идентифициране на минерална синтаза, която е критична за растежа и развитието на Arabidopsis. The Plant Journal, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Директни и косвени химически защити срещу насекоми в мултитрофична рамка. Растение, клетка и околна среда, 37, 1741–1752.

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K., et al. (2019) Едновременно CRISPR/Cas9-медиирано редактиране на eIF4E изоформите на маниока nCBP-1 и nCBP-2 намалява тежестта и честотата на симптомите на заболяването от кафяви ивици на маниока. Вестник за растителна биотехнология, 17, 421–434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) Антенни електрофизиологични реакции на три паразитни оси към летливи вещества, предизвикани от гъсеници от царевица (Zea mays), памук (Gossypium herbaceum) и cowpea (Vigna unguiculata). Journal of Chemical Ecology, 31, 1023–1038.

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. et al. (2016) Биосинтеза на 8-O-метилирани бензоксазиноидни защитни съединения в царевица. Растителната клетка, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. et al. (2019) Специализирана метаболитна мрежа селективно модулира кореновата микробиота на Arabidopsis. Наука, 364, eaau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Синтез на моеноцинол и неговите аналози с помощта на BT-сулфон в олефиниране на Julia-Kocienski. Tetrahedron Letters, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. et al. (2020) DMNT, предизвикан от тревопасни животни, катализиран от CYP82D47, играе важна роля в индуцирането на JA-зависима резистентност на тревопасни животни на съседни чаени растения. Растение, клетка и околна среда, 44, 1178–1191.

Johnson, SN & Züst, T. (2018) Изменението на климата и насекомите вредители: съпротивата не е безполезна? Тенденции в науката за растенията, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: успешен инсектицид с нови екологични характеристики и новини. Приложна микробиология и биотехнология, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Генното инженерство на терпеноидния метаболизъм привлича телохранителите към Arabidopsis. Наука, 309, 2070–2072.

Keima, T., Hagiwara-Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N., et al. (2017) Дефицитът на eIF4E изоформата nCBP ограничава движението от клетка към клетка на растителен вирус, кодиращ протеини с троен генен блок в Arabidopsis thaliana. Научни доклади, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Индуцираните от растителноядни и флорални монотерпенови летливи вещества се биосинтезират от един ензим P450 (CYP82G1) в Arabidopsis . Сборник на Националната академия на науките, 107, 21205–21210.

Li, B., Förster, C., Robert, CAM, Züst, T., Hu, L., Machado, RAR, et al. (2018) Конвергентна еволюция на метаболитен превключвател между листни въшки и устойчивост на гъсеници в зърнени култури. Научен напредък, 4, eaat6797.

Liu, D., Huang, X., Jing, W., An, X., Zhang, Q., Zhang, H. et al. (2018) Идентифициране и функционален анализ на два P450 ензима на Gossypium hirsutum, участващи в биосинтезата на DMNT и TMTT. Вестник за растителна биотехнология, 16, 581–590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) Жасмонатното сигнализиране в растенията оформя екологията на взаимодействие между растение и насекомо. Текущо мнение в науката за насекомите, 14, 32–39.

Lu, H., Luo, T., Fu, H., Wang, L., Tan, Y., Huang, J., et al. (2018) Устойчивост на ориза към насекоми вредители, медиирана от потискане на биосинтезата на серотонин. Природни растения, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) Насочването на CRISPR-Cas9 към гена eIF4E1 разширява спектъра на устойчивост на картофения вирус Y на Solanum tuberosum L. cv. желание. Граници в микробиологията, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) Ново взаимодействие между реакциите на пътя на етилен и жасмонова киселина към пиърсинг-смучещо насекомо в ориз. Нов фитолог, 225, 474–487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW et al. (2019) Летливият DMNT системно индуцира независима от жасмонат директна защита срещу тревопасни животни в листата на растения от сладки картофи (Ipomoea batatas). Научни доклади, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska-Banaszak, O., Skrzypczak-Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Глутатион S-трансфераза като индикатор за токсичност при обща анестезия: генетика и биохимична функция. Вестник по клинична анестезия, 27, 73–79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: нови членове на семейството, нови обвързващи партньори, нови роли. Journal of Biological Chemistry, 284, 16711–16715.

Richter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG и др. (2016) Характеризиране на биосинтетичните пътища за производството на летливите хомотерпени DMNT и TMTT в Zea mays. Растителната клетка, 28, 2651–2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ & Browning, KS (1998) Идентифициране и характеризиране на нов кап-свързващ протеин от Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 273, 10325–10330.