Ролята на генетичното изследване в диагностичния работен процес на педиатрични пациенти с бъбречни заболявания: Опитът на една единствена институция
Oct 18, 2023
РезюмеПредназначениеНаследствените бъбречни заболявания са сред водещите причини за бъбречна недостатъчност при деца, което води до повишена смъртност, високи разходи за здравеопазване и необходимост от трансплантация на органи. Технологиите за секвениране от следващо поколение могат да помогнат при диагностицирането на редки моногенни състояния, което позволява оптимизирано медицинско управление и терапевтичен избор.
Методи Клиничното секвениране на екзома (CES) беше извършено върху група от 191 педиатрични пациенти от една институция, последвано от секвениране на Sanger за потвърждаване на идентифицираните варианти и за проучвания за семейна сегрегация. Резултати Всички пациенти са имали клинична диагноза бъбречно заболяване: основните категории заболявания са гломерулни заболявания (32,5%), цилиопатии (20,4%), CAKUT (17,8%), нефролитиаза (11,5%) и тубулно заболяване (10,5%). 7,3% от пациентите са имали други състояния. Убедителен генетичен тест, базиран на валидиране на CES и Sanger, е получен при 37,1% от пациентите. Най-висок процент на откриване е получен за цилиопатии (74,4%), следвани от нефролитиаза (45,5%) и тубулни заболявания (45%), докато повечето гломерулни заболявания и CAKUT остават недиагностицирани. Заключения Резултатите показват, че генетичното изследване, последователно използвано в диагностичния работен процес на деца с хронично бъбречно заболяване, може (i) да потвърди клиничната диагноза, (ii) да осигури ранна диагноза в случай на наследствени заболявания, (iii) и генетичната причина за неразпознати преди това заболявания и (iv) индивидуални програми за трансплантация.
Ключови думи Клинично секвениране на екзоми, секвениране от следващо поколение,Бъбречни заболявания, Генетично изследване, Педиатрична кохорта
НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ CISTANCHE ЗАКРАЙЕН СТАДИЙ НА БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ
Въведение
Педиатричните нефропатии включват много различни болестни единици по отношение на клинично представяне, еволюция и терапевтични възможности [1–4]. Приблизително 30% от децата с хронично бъбречно заболяване (ХБН) страдат от моногенно състояние, като процентът се увеличава, когато се имат предвид деца с краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD) [5, 6]. Много от тези деца остават недиагностицирани по време на трансплантацията [4, 6, 7]. Постигането на диагноза за тези пациенти не само предполага края на диагностичната одисея, но предоставя няколко предимства за прогноза, управление и лечение
Пионерските проучвания последователно показват, че прилагането на техники за секвениране от следващо поколение (NGS) значително е подобрило диагностичния добив при пациенти с наследствени бъбречни заболявания (IKD) [8]. Съвсем наскоро широкото използване на NGS направи наличната генетична диагноза в разумно време и на достъпна цена, повдигайки въпроса дали и кога тя трябва да бъде интегрирана в рутинния диагностичен работен процес [5].
Генетичната диагностика при децата е от изключително значение за различни аспекти. Първият е, че може да бъде уместен в клиничния подход към заболяването, като типичният пример е този на нефротичните синдроми, където идентифицирането на структурни варианти в гени, свързани с подоцитите, се противопоставя на имуносупресивните терапии, които иначе биха се използвали рутинно за период от няколко месеца [9]. Второто е, че може да бъде от голямо значение за семейството на детето и за идентифицирането на други членове, които са носители на варианта, който е възможно да се предава на бъдещите поколения. След като се идентифицира патогенен вариант в пробанд, каскадното тестване на членове на семейството и генетичното консултиране при носители на варианти представлява стандартна практика в клиничната генетика [5]. Третото е, че познаването на патогенния вариант е от съществено значение в контекста на трансплантация, където донорът може да е роднина. Наистина, изключително важно е да се изключи наличието на същия вариант(и) в донора на органи, както и да се идентифицират всички членове на семейството, потенциално нуждаещи се от трансплантация. Четвъртото е, че някои заболявания представляват висок риск от рецидив след трансплантация на орган, като фокална сегментна гломерулосклероза [10] или техният резултат може да бъде подобрен чрез по-подходящ избор на трансплантация, която да се извърши, като например в случай на първична хипероксалурия, при която комбинирана трансплантация на бъбрек и черен дроб може да доведе до по-добър резултат [11]. И накрая, наличието на ясна диагноза на заболяването може да бъде полезно за пациента да участва в клинични изпитвания и да се възползва от нови възможности за лечение [12, 13].
В края на 2018 г., в сътрудничество между педиатрични нефролози и генетици, започнахме да извършваме генетични тестове за моногенни състояния, потенциално водещи до ESRD и следователно до трансплантация. Нашата болница е най-голямата в Северозападна Италия, отводняваща се от площ от около 5 милиона души. Ние избрахме вид анализ „един размер за всички“, със секвениране на клиничния екзом, т.е. приблизително 6700 гена, които са свързани с моногенни състояния, фокусирайки анализа върху генни панели, съобразени с клиничното подозрение и следователно ограничаване на случайни находки и намаляване на времето за анализ на последователността.
Като цяло, чрез прилагането на този тръбопровод, ние получихме диагностичен добив в съответствие с публикуваните данни, с известна хетерогенност сред различните клинични подозрения, както се очакваше. Получените резултати потвърждават уместността на включването на рутинно генетично изследване и консултиране в диагностичния работен процес на педиатрични пациенти, засегнати от нефропатии. Наистина, идентифицирането на причинно-следствените варианти е критично за тяхното клинично управление и потенциално за оптимална селекция на живи донори.
Материали и методи
Набиране на пациенти
Проучването се основава на диагностична група от 191 последователни педиатрични пациенти (възраст при набиране < 18 години), наети от отделенията по педиатрична нефрология, диализа и трансплантация в Детската болница Regina Margherita и насочени към службата по имуногенетика и биология на трансплантацията за генетичен анализ. Всички пациенти, включени в проучването, предоставиха писмено информирано съгласие, подписано от двамата родители, когато е възможно.
Подготовка на проби, секвениране и биоинформатични анализи
Екстракция на нуклеинова киселина от периферна кръв, анализ на качеството на ДНК, подготовка на библиотека и секвениране бяха извършени, както беше съобщено по-рано [14]. Суровите данни, получени от секвенирането, бяха преобразувани във файлове FASTQ и след това приведени в съответствие с Enrichment 3.1.0 или DRAGEN Enrichment tools (Illumina) и картографирани в TruSight One Expanded v2.0 манифест, използвайки генома на Homo Sapiens UCSC GRCh37 като справка за получаване на единични нуклеотидни варианти, варианти на брой копия (CNV) и структурни варианти на файлове. За идентифициране на броя на копията беше използвана базова линия, направена от данни за секвениране от 5 различни пациенти, всички отрицателни за CNV (съгласно данни за сравнителна геномна хибридизация). Този подход позволява откриване на CNV дори в полови хромозоми, тъй като референтната група е съставена както от женски, така и от мъжки индивиди и полът на субекта, който трябва да бъде анализиран, винаги е бил посочван по време на фазата на подравняване. Извикването на варианти и приоритизирането бяха направени след определени критерии. Подравняването на четенията и покритието на екзоните на интересуващия ни ген бяха проверени и показани от Integrative Genomics Viewer IGV, свободно достъпен от UC San Diego—Калифорнийски университет и Broad Institute на MIT и Харвардския университет—Бостън (https://software.broadinstitute. org/software/igv/). Вариантите, които трябва да бъдат включени в окончателния генетичен доклад, бяха класифицирани според критериите на Американския колеж по медицинска генетика и геномика (ACMG).
Генериране на in silico списък с генни заболявания
Гените, които трябва да се вземат предвид за идентифициране на варианти и приоритизиране, бяха определени въз основа на клиничните подозрения. Бяха генерирани списъци с гени in silico, съответстващи на (i) данни от различни бази данни, корелиращи генотип с фенотип (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards) и (ii) данни от литературата. Наличните списъци с гени се актуализират веднъж годишно въз основа на нови доказателства за връзка между ген и заболяване.
Секвениране на Sanger и амплификация на сонда, зависима от мултиплексно лигиране (MLPA)
Секвениране на Sanger и/или MLPA анализи бяха извършени за валидиране на варианти, идентифицирани от NGS и за проучвания за семейна сегрегация. Накратко, ДНК беше извлечена, започвайки от втора независима аликвотна част от периферната кръв на пробанда и от родителите. ДНК регионите, представляващи интерес, бяха амплифицирани чрез PCR при използване на специфични експериментални условия. Чистотата и специфичността на амплифицираните области бяха проверени с 0.8 или 1,5% агарозен гел. След това амплифицираните PCR продукти бяха секвенирани по Sanger, използвайки същите праймери. За варианти на PKD1, валидирането беше извършено с помощта на PCR на дълги разстояния, последвано от вложена PCR, за да се избегне всякакъв извод от псевдогените.
Резултати
Определяне на критерии за връщане на резултатите от генетичния анализ
We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 гена, всички участващи в различни форми на бъбречни заболявания [14]. За това проучване ние внедрихме анализ с подпанели, фокусирани върху специфичната клинична категория на подозрение (напр. CAKUT, гломерулопатия, тубулопатия и т.н.) и предварително определихме специфична група гени за анализ. Този подход ограничава броя на анализираните гени, опростява анализите и намалява броя на случайните открития. Само когато в края на аналитичното поле със съответния панел(и) генетичният резултат е отрицателен и (i) клиничният фенотип не е ясно посочен или (ii) припокриващи се различни категории заболявания, генетичният анализ се разширява до т.нар. „пълния списък на бъбреците или бъбреците“, суперпанел, включващ всички гени, включени в подпанелите.
Като първа стъпка дефинирахме набор от критерии за тълкуване на резултатите от NGS. След извършване на клинично секвениране на екзоми (CES) и подравняване на данни, беше определен тръбопровод от анализи за филтриране в съответните варианти. По-конкретно, въз основа на клинично подозрение, идентифицираните варианти бяха филтрирани въз основа на in silico генни списъци, специфични за различните макро-категории на заболяването. Синонимните варианти, които не влияят върху механизма на снаждане, или интроничните варианти, които не се картографират в областта на сплайсинг, бяха изключени, като се имаха предвид само несинонимните, безсмислените, вариантите с изместване на рамката и засягащите сплайсинг варианти. Бяха включени десет, само редки варианта (честота по-малка от 1% в популацията) и варианти с честота на алел при пациента най-малко 0.2 и покритие от най-малко 20 четения. Останалите варианти бяха анотирани и допълнително курирани въз основа на (i) начин на наследяване, (ii) запазване на нуклеотиди, (iii) въздействие на протеини, използване на различни бази данни за проверка на резултатите и (iv) литература, ако има такава. В този момент филтрираните варианти бяха изброени в така наречения „технически доклад“. Техническият доклад беше интерпретиран от медицински генетик, за да се изготви окончателният генетичен доклад за пациента и неговото/нейното семейство. По време на генетичната консултация бяха предложени проучвания за семейна сегрегация за (i) потвърждаване на вариантите в пробанда и (ii) за включване/изключване на непричинителни варианти въз основа на тяхната сегрегация в семейството (фиг. 1).
Чрез приемането на тези критерии успяхме да дефинираме три различни категории генетични доклади. Първо, "убедителен доклад", който включва патогенни (C5) и вероятно патогенни (C4) варианти. Докладите за варианти с неизвестна значимост (C3) се считат за убедителни само ако са напълно съвместими с клиничната картина и ако проучванията за семейна сегрегация потвърждават възможната им роля. Второ, „несигурен доклад“, който включва C3 варианти, идентифицирани от CES, които все още не са или не могат да бъдат валидирани в контекста на проучвания за семейна сегрегация или C4/C5 варианти, които не са напълно в съответствие с клиничния фенотип. Трето, „неубедителен доклад“, който включва (i) отрицателен CES анализ, което означава, че не са идентифицирани варианти от NGS; (ii) единични варианти в рецесивни гени; и (iii) C3 варианти, които не съответстват на клиничния фенотип, идентифицирани, когато анализът е разширен до всичкигени, свързани с бъбречни заболявания(Фиг. 1).
Основни характеристики на вербуваната кохорта
Това проучване описва кохорта от 191 педиатрични пациенти (0–18 години), които са били последователно насочвани от педиатричното нефрологично отделение за генетичен анализ от ноември 2018 г. до май 2022 г., със средно 50 нови пациенти, включени всяка година . Критериите за генетично изследване са (i) нефропатия, свързана с положителна фамилна анамнеза за бъбречно заболяване или (ii) клинично подозрение за моногенно състояние или (iii) необходимост от изключване на моногенно състояние (както в случая на нефротични синдроми, където разграничаването моногенни срещу немоногенни заболявания е клинично значимо за прогнозата и лечението).
Кохортата беше разделена въз основа на клиничното подозрение, като се отчитат 6 различни макро-категории на заболяването: вродени аномалии на бъбреците и пикочните пътища (CAKUT; n=34), цилиопатии (n=39), гломерулопатия (n=62), нефролитиаза (n=22), тауопатии (n=20) и други заболявания, които включват също синдромни фенотипове (n=14). С изключение на CAKUT и тубулопатии, които показват еднакво разпределение между жени и мъже, във всички останали категории имаше преобладаване на мъже (фиг. 2а). Когато се разглежда възрастта на набиране, не се подчертава значително различно разпределение между различните групи, като средната възраст варира от 6,7 до 10 години съответно в „Други заболявания“ и гломерулопатии. Въпреки това, когато се разглежда средната възраст, заболяванията CAKUT показват най-ниската стойност (4,6 години), в съответствие с вроден фенотип. От гледна точка на етническата принадлежност, независимо от разглежданата макрокатегория на заболяването, повечето пациенти са европейци, следвани от африканци, като само няколко пациенти са азиатски, латиноамерикански или кръстосани (фиг. 2b). Сред кохортата само 8 пациенти са имали родствени родители.
Фиг. 1 Конвейер за анализ на генетични данни и критерии за включване на варианти. Схематично представяне на аналитичния тръбопровод, приет за идентифициране и приоритизиране на варианти, включително всички критерии за филтриране и филтриране. Получените варианти бяха включени в окончателния генетичен доклад. Когато е възможно, бяха извършени проучвания за валидиране на вариант(и) и семейна сегрегация. Генетичните доклади бяха класифицирани като убедителни, несигурни или неубедителни въз основа на посочените критерии. Въз основа на тази класификация беше изчислена диагностичната честота на нашия работен процес за секвениране от следващо поколение (NGS). 1 KG: база данни с 1000 генома; Alt fr: променена честота; C3: вариант с неизвестно значение; C4: вероятен патогенен вариант; C5: патогенен вариант; AR: автозомно рецесивен
И накрая, когато се вземе предвид фамилната анамнеза за бъбречни заболявания, като се вземат предвид индивидите от мъжки и женски пол поотделно, хетерогенността в разпределението между положителните и отрицателните случаи е очевидна, като се имат предвид различните категории заболявания. Като цяло, по-голямата част от наетата кохорта и независимо от пола не се характеризира с положителна фамилна анамнеза, както е показано за CAKUT, гломерулопатии, тауопатии и други бъбречни заболявания. Въпреки това, при цилиопатии и нефролитиаза, значителна част от случаите са представени с положителна семейна история с различно разпределение между жени и мъже (13 случая от 22 за цилиопатии и 5 от 12 за нефролитиаза; Фиг. 2c).
От клинична гледна точка кохортата е доста хетерогенна с включени различни първични заболявания (фиг. 2d). Сред тях най-повтарящите се клинични съмнения са поликистоза на бъбреците (n=27), CAKUT (n=25), нефротичен синдром (n=19), фокална сегментна гломерулосклероза (FSGS; n =14) и синдром на Alport (n=13; Фиг. 2d).
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
КЛИКНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 25% ЕХИНАКОЗИД И 9% АКТЕОЗИД ПРИ БЪБРЕЧНИ ИНФЕКЦИИ
