Серум/PDGF-зависимата меланогенна роля на минималното ниво на онкогенната киназа PAK1 в меланомни клетки, доказана чрез високочувствителен киназен анализ

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Резюме:По-рано показахме, че онкогенната киназа PAK4, която както меланомите, така и нормалните меланоцити експресират на много високо ниво, е от съществено значение за тяхнотомеланогенеза. В настоящото изследване, използвайки силно чувствителния "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) киназен анализ, ние изследвахме меланогенния потенциал на друга онкогенна киназа PAK1, която клетките на меланома (B16F10) експресират само на много малко ниво. След трансфектиране на меланомни клетки с PAK1-shRNA за заглушаване на PAK1 гена, съдържанието на меланин,тирозиназаактивност и киназна активност на PAK1 бяха сравнени между див тип и трансфектанти. Открихме, че (i) PAK1 се активира значително от меланогенни хормони като IBMX (3-изобутил-1-метил ксантин) и -MSH (меланоцит-стимулиращ хормон), (ii) заглушаване на ендогенния PAK1 ген в меланомните клетки чрез PAK1-специфична shRNA намалява както съдържанието на меланин, така итирозиназаактивност в присъствието както на серумни, така и на меланогенни хормони до базалното ниво, (iii) екзогенно добавеният див тип PAK1 в клетките на меланома повишава индуцируемото от -MSH ниво на меланин с няколко пъти, без да засяга базалното ниво, и (iv) - MSH/IBMX-индуцираната меланогенеза почти не се осъществява в отсъствието на серум или PAK1, което ясно показва, че PAK1 е от съществено значение главно за серум- и -MSH/IBMX-зависимимеланогенеза, но не и базалната, в клетките на меланома. Резултатът от това проучване може да осигури първата научна основа за обяснение защо голямо разнообразие от билкови PAK1-блокери като CAPE (фенетилов естер на кафеената киселина), куркумин и шиконин в козметиката са полезни заизбелване на кожата.

Ключови думи:PAK1,меланогенеза, меланоми,тирозиназа, MITF,избелване на кожата, серум

избелващи продукти за грижа за кожата cistanche

Въведение

Цветът на космите, ирисите на очите и кожата се контролират от семейство пигменти, наречени меланини. Вътреклетъчният източник на меланин е тирозинът и се превръща в меланин чрез серия от ензимно окисление (хидроксилиране), което включватирозиназа, TRP (свързан с тирозиназа протеин) 1 и TRP2. Експресията на гени, кодиращи тези меланогенни ензими, изисква поне два онкогенни/меланогенни транскрипционни фактора (MTF): бета-катенин и MITF (свързан с микрофталмията транскрипционен фактор). По-голямата част от билковите съединения визбелване на кожатакозметиката или инхибира директно тези меланогенни ензими, или регулира надолу MTF. Аналозите на тирозин като коджиковата киселина принадлежат към първата категория (тирозиназаинхибитори), докато по-голямата част от остатъците като CAPE (фенетилов естер на кафеената киселина), куркумин и шиконин принадлежат към втората категория (MTF регулатори) (1,2). Интересното е, че много от тези регулатори на MTF, включително CAPE, куркумин, шиконин и кукурбитацин, са известни с това, че блокират онкогенната/старееща киназа PAK1 (RAC/CDC42-активирана киназа 1) (3-5). Следователно, най-вероятно е PAK1 да участва в активирането на тези меланогенни/онкогенни транскрипционни фактори в клетките на косата, ирисите на очите или кожните меланоцити. Наистина, поне бета-катенинът е сред директните субстрати на PAK1 (6). PAK1 фосфорилира бета-катенин при Ser 675 за активиране, което води до злокачествена трансформация. Освен това бета-катенинът е от съществено значение за активирането на MITF, което води домеланогенезаили/и онкогенеза на меланоцити (7).

Интересно е обаче, че наскоро беше разкрито, че нокаутираният PAK1 ген сам по себе си в пигментирани мишки не успява да произведе мишки албиноси (Hong He et al., непубликувани наблюдения), което ясно показва, че поне базалната меланогенеза както в клетките на косата, така и в очите ириси е независим от PAK1, въпреки че приносът на PAK1 към кожатамеланогенезапредстои да се изясни.

По-рано показахме, че онкогенната киназа PAK4 (CDC42-зависима киназа 4) е силно експресирана както в меланомни, така и в нормални меланоцитни клетъчни линии и е отговорна за тяхната меланогенеза, активирайки CREB/бета-катенин-MIFT-тирозиназапът, докато PAK2 (RAC/CDC42-активирана киназа 2), друг силно експресиран член на семейство PAK, не играе роля в тяхната меланогенеза (8).

В това проучване ние предоставяме първите биохимични доказателства за специфична роля на друга онкогенна киназа, наречена PAK1 в кожатамеланогенеза, въпреки факта, че неговото ниво на експресия е малко: индуцираното от shRNA заглушаване на PAK1 ген в меланоцити (B16F10), получени от миши меланом, значително намалява -MSH/IBMX-индуцируемиямеланогенезадо базалното ниво, докато свръхекспресията на PAK1 гена усилва -MSH-индуцируемата меланогенеза, без да засяга базалната. Освен това открихме, че -MSH/IBMX индуцируемата меланогенеза изисква серумен фактор, който най-вероятно е PDGF (тромбоцитен растежен фактор). В среда без серум, само базалномеланогенезасе провежда.

цистанченамаляване на активността на тирозиназата

2. Материали и методи

2.1. Материали

B16F10 меланомни клетки бяха закупени от American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). PAK1-SureSilencing плазмиди, атрактивна трансфекция, endofree® плазмиден макси комплект са закупени от Qiagen (Валенсия, Калифорния 91355, САЩ). Първични PAK1-антитела, биотинилирани вторични антитела, signalfireTM ECL реагент са получени от Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Kinase Glo реагент и ATP (ATP_Glo kinase kit) бяха закупени от Promega (Медисън, Уисконсин, САЩ). Липофектамин и JM109 компетентни клетки са закупени от Invitrogen и Life Technology. AG1295 и AG1478 бяха закупени от Calbiochem (Сан Диего, Калифорния, САЩ). Всички други химикали, включително човешки PDGF-bb, са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).

2.2. Заглушаване на PAK1 ген в миши меланоцити (B16F10) чрез стабилна трансфекция с миша PAK1-специфична shRNA

2.2.1. Клетъчна култура

Меланомните клетки B16F10 се култивират в DMEM, допълнен с 10 процента топлинно активиран FBS и 1 процент пеницилин/стрептомицин (10, 000 U/mL и 100 µg/mL) при 37 градуса във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2.

2.2.2. Стабилна трансфекция с миша PAK1-специфична shRNA

Трансфекцията на ShRNA на клетъчна линия B16F10 беше извършена основно чрез същата процедура, описана по-рано (9), но с миши PAK1-специфични shRNAs (# KM04553, Qiagen). Следните четири отделни клона на shRNA бяха използвани за трансфекцията: клон 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), клон 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), клон 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) и клон 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT), както и shCONTROL ненасочена shRNA като отрицателна контрола (WT) . Въпреки това, в това изследване, клонове 1 и 2 се оказват по-ефективни от клонове 3 и 4 за заглушаване на миши PAK1 ген в тази меланоцитна линия (данните не са показани). Стабилни трансфектанти бяха избрани в присъствието на G418 (1 mg/mL), който убива повече от 99 процента от нетрансфектираните клетки.

2.2.3. Western-blot анализ на нивото на PAK1 протеин и in vitro анализ за киназната активност на PAK1 в трансфектанти

2.2.3.1. Western blot анализ

За да се определи количествено изключително ниското ниво на PAK1 както в контролната (WT) клетъчна линия, така и в PAK1-заглушените трансфектанти (G418-резистентни), чрез минимизиране на нивата на "неспецифичен шум", ние проведохме западното блот анализ с използване на заешко поликлонално антитяло срещу PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) като първично антитяло. Накратко, всеки клон се посява при концентрация от 2 × 105 клетки/ямка в плоча с 6 ямки, предварително култивирана за 48 часа, и клетъчните лизати се варят в 25 µL SDS-PAGE буфер за 5 минути. Осем µL (съдържащи 15 µg общ протеин) от всеки супернатант на слот се използват за SDS-PAGE. Нитроцелулозата се блотира с анти-PAK1 IgG (1:1, 000 разреждане като първично антитяло) и като вторични антитела, HRP-свързаните анти-заешки IgG и анти-биотинов IgG (#7074, # 7075, клетъчно сигнализиране) бяха използвани за откриване както на PAK1, така и на -актинови ленти, които в крайна сметка бяха визуализирани с ECL системата от Amersham. Анализите на Western blot бяха представителни за три независими експеримента.

2.2.3.2. "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo) киназен анализ за PAK1 в меланомни клетки

Киназната активност на PAK1 в WT меланоцитите и shRNA трансфектантите (SHs) беше измерена чрез съществена модификация (5) на десетилетен метод (който измислихме "Macaroni-Western"), разработен от италианска група (1{{39 }}). Накратко, B16F10 меланомни клетъчни линии (WT или SHs, 2 × 105 клетки/mL) бяха предварително култивирани върху 6-ямкова плака за 24 часа. След това клетките се третират със 100 nM -MSH или 100 цМ IBMX за 48 часа. Клетките се разрушават чрез лизисен буфер, съдържащ 50 mM Tris HCl рН 7.5 и 150 mM NaCl и 1 процент Triton-X. За имунопреципитацията (IP) на PAK1, изчистените клетъчни лизати се инкубират с анти-PAK1 IgG (разреждане 1:50) и протеин А-агарозни перли за 1-2 h в студена стая с непрекъснато разклащане с ротационен миксер (Нисин, Сугинами-ку, Токио, Япония). Полученият IP (PAK1) от всеки лизат се инкубира с комплект за анализ на ATP Glo киназа (Promega) в присъствието на ATP и MBP (миелинов основен протеин) в продължение на 1 час при 37 градуса и оставащото ниво на ATP се измерва чрез ATP- зависима луциферин-луциферазна реакция, която в крайна сметка генерира луминесценция (10). Крайната суспензия се центрофугира и супернатантата се прехвърля в 96-ямкова плака за отчитане. Луминесценцията беше записана от MTP-880лабораторен четец на микроплаки (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Япония) с време за интегриране от 0,5 s на ямка.

2.3. Измерване на съдържанието на меланин и тирозиназната активност в трансфектанти

2.3.1. Измерване на съдържанието на меланин

Съдържанието на меланин се определя, както е описано по-горе (11). Накратко, B16F10 клетки (див тип или PAK1-специфични shRNA трансфектанти) се поставят при плътност от 2 × 104 клетки/ямка в 24-ямкова плака. След 24 часа култивиране се добавят 100 цМ изобутил-1-метилксантин (IBMX) или 100 nM -MSH и се инкубират за допълнителни 72 часа при 37 градуса. Клетките се промиват два пъти с фосфатен буфер, след това се лизират с 500 µL разтвор, съдържащ 1 М NaOH и 10 процента DMSO и се инкубират при 80 градуса за 1 час, за да се разтвори меланинът, и съдържанието на меланин се измерва при 490 nm. За да се сравни съдържанието на меланин в дивия тип и трансфектираните клетки, общото количество меланин, произведен от дивия тип меланоцити, се счита за контрола (100 процента) и тези от трансфектантите се изчисляват съответно.

2.3.2. Тест за вътреклетъчна тирозиназна активност

Тирозиназаактивността се определя, както е описано по-горе (12), с лека модификация. B16F10 клетки (див тип или трансфектантите) се посяват при плътност от 2 × 104 клетки/ямка и след 24 часа култура се добавят 100 µM IBMX или 100 nM -MSH и се инкубират за допълнителни 72 часа при 37 градуса . След това клетките се промиват с ледено студен фосфатен буфер и се лизират с фосфатен буфер (рН 6.8), съдържащ 1% Triton-X (500 uL/ямка). Плаките бяха замразени при -80 градуса за 30 минути. След размразяване, 100 uL от 1 процент L-DOPA се добавят към всяка ямка. След инкубиране при 37 градуса за 2 часа, абсорбцията се измерва при 490 nm.

2.4. Измерване на съдържанието на меланин в меланоцитите от див тип и PAK1-свръхекспресия след лечение с -MSH

Използвайки Myc вектор (2 µg), меланоцитите (B16F10) се трансфектират временно или с див тип (WT) PAK1, или с така наречения "конститутивно активиран" (CA) PAK1, носещ T423E мутация. След 3 дни култивиране, всеки трансфектиран клон беше събран за по-нататъшен експеримент. Ефектът от свръхекспресията на PAK1- върху съдържанието на меланин се измерва чрез същите процедури, описани по-рано (8). Накратко, меланоцити, или див тип, или свръхекспресия на PAK1-, които експресират или дивия тип PAK1, или негов СА мутант, бяха инкубирани със 100 nM -MSH в продължение на 3 дни. Клетките се лизират с разтвор, съдържащ 1 М NaOH и 20 процента DMSO, за да се разтвори меланинът и съдържанието му се определя при 405 nm.

2.5. Меланогенеза в среда без серум

B16F10 клетки (див тип или PAK1-специфични shRNA трансфектанти) се посяват при плътност от 2 × 104 клетки/ямка в 24-ямкова плака в присъствието на 10 процента FBS. След 24 часа инкубация културалната среда се заменя със среда без серум и се култивира за допълнителни 72 часа със или без 100 µM IBMX или 100 nM -MSH за измерване на съдържанието на меланин.

2.6. Ефект на PDGF/EGF рецепторни инхибитори върху серум-зависима меланогенеза

2 × 104 B16F10 клетки се посяват във всяка ямка за 24 часа в 10 процента FBS-съдържаща среда и след това се култивират за допълнителни 72 часа в прясна среда, съдържаща 100 nM -MSH и следното: (1) без серум, (2) 10 процента FBS самостоятелно, (3) 10 процента FBS плюс 2 µM AG1295 (PDGF рецепторен инхибитор) и (4) 10 процента FBS плюс 400 nM AG1478 (EGF рецепторен инхибитор), за измерване на съдържанието на меланин.

2.7. Статистически анализ

Данните са изразени като средни стойности с техните стандартни грешки. Статистическите сравнения бяха извършени чрез еднопосочен ANOVA, последван от многообхватен тест на Duncan. Статистическият анализ беше проведен с помощта на SAS (версия 9.2; SAS Institute, Cary, NC, САЩ) и p По-малко или равно на 0.05 беше счетено за значимо.

мака женшен цистанче

3. Резултати

3.1. Активиране на PAK1 в меланомна клетъчна линия (B16F10) от меланогенни хормони

Два меланогенни хормона, -MSH (меланоцит-стимулиращ хормон) и IBMX (3-изобутил-1-метил ксантин) често се използват за стимулиранемеланогенезав меланоцити като меланомна клетъчна линия B16F10. По този начин първо проверихме дали тези хормони могат да активират PAK1 в тази клетъчна линия, въпреки че нивото на протеина на PAK1 там е изключително ниско в сравнение с тези на PAK2 и PAK4 (8). За да наблюдаваме промените в киназната активност на PAK1 в клетките, наскоро разработихме високочувствителен/специфичен киназен анализ, наречен "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) протокол за анализ на киназа чрез комбиниране на имунопреципитация (IP) на PAK1 от клетка лизати и ATP_Glo kinase kit на Promega (5). Използвайки този киназен анализ, ние открихме, че и -MSH (100 nM), и IBMX (100 µM) активират PAK1 в меланомни клетки, като -MSH е по-мощен от IBMX (вижте на фигура 1). Все пак трябва да напомним на читателите, че показаното тук многократно активиране на PAK1 е само привидно, тъй като по време на този отнемащ време IP епруветка и анализ на киназата (общо над 3 часа), протичащ без тези меланогенни хормони, PAK1 ще се нормализира постепенно през време. С други думи, ние не можем да замразим точния киназен статус на PAK1 в края на клетъчната култура, третирана с тези стимулатори, и активирането на гънките е само подценено отражение на активирането на PAK1, което се извършва по време на клетъчната култура от тези симулатори.

3.2. Заглушаване на PAK1 ген от shRNAs в клетъчна линия на миши меланом

За да се изследва допълнително биохимично дали PAK1 допринася замеланогенезав кожни клетки (меланоцити), ние стабилно трансфектирахме клетъчната линия на меланома B16F10 с миша PAK1-специфична shRNA, за да заглушим PAK1 гена селективно.

3.2.1. Заглушаване на PAK1 гена в меланоцитите

Нашият предварителен Western blot анализ предполага, че в два различни PAK1-заглушени клона (SH1 и 2) нивата на PAK1 протеин са значително (с около 75 процента) намалени, но скоростта на растеж на тази меланомна клетъчна линия сама по себе си не е значително засегнати от заглушаването на PAK1 (данните не са показани). Въпреки това, точното количествено определяне на нивата на PAK1 протеин чрез сканиране на този Western blot беше доста трудно, главно поради високия фонов шум около PAK1 лентата в усилието да се визуализират нейните изключително ниски нива на експресия. Вместо това, използвайки теста за киназа "Macaroni-Western" (5, 10), ние потвърдихме, че киназната активност на PAK1 и в двата клона SH1 и 2 е само около 25-30 процента от тази в контролните (WT) клетки ( виж Фигура 2A).

3.2.2. Намаляване на меланогенезата чрез заглушаване на PAK1 гена

Следващият ни критичен въпрос беше дали такова намаляване на киназната активност на PAK1 засягамеланогенеза. По този начин, съдържанието на меланин в тези клонинги (SH1 и 2) се сравнява с меланомните клетки от див тип (WT), след третиране на всички тези клетки с -MSH, меланогенен индуктор, в продължение на 72 часа. Както е показано на фигура 2B, съдържанието на меланин в тези PAK1-дефицитни меланоцити (SH1 и 2) е намалено с около 50 процента (51-55 процента), достигайки основното ниво в WT без меланогенен хормон. За да видим дали това намаляване на съдържанието на меланин е свързано с потискането на активността на тирозиназата, ние измерихметирозиназаактивност в клетки с дефицит на PAK1- (клонове SH1 и 2), в сравнение с WT. Както е показано на Фигура 2C, активността на тирозиназата в клетки с дефицит на PAK1- е само около 45 процента (33-58 процента) от тази в WT, отново достигайки базалното (нестимулирано) ниво, което ясно показва, че че PAK1 е от съществено значение за -MSH-индуцираното производство на меланин чрезтирозиназав меланоцитите. Освен това, по много подобен начин индуцираната от IBMX меланогенеза също беше намалена чрез заглушаване на PAK1 гена в тази меланомна клетъчна линия (данните не са показани). Въпреки това, като се вземат предвид следните два фактора, най-вероятно е само половината отмеланогенезав меланоцитите е зависима от PAK1-, а останалата (до голяма степен „основна“) е зависима от PAK4-: (i) PAK4 също е от съществено значение за индуцираната от -MSH меланогенеза в меланоцитите (8) и (ii) около 25 процента от гена PAK1 изглежда все още се експресира в тези трансфектанти (SH1 и 2). Въпреки това, остава да се изясни енергично дали PAK1 е отговорен за индуцирания от хормони или базалниямеланогенеза.

Освен това, ние потвърдихме, че ендогенният PAK1 е значително активиран от меланогенни индуктори като IBMX и -MSH в тази меланомна клетъчна линия (виж Фигура 1), но без никаква значителна промяна в неговото автофосфорилиране при Thr 423, както се преценява от анти-pPAK1 антитяло (данните не са показани).

3.3. Увеличаване на -MSH-индуцирана меланогенеза чрез свръхекспресиран PAK1

Чрез свръхекспресия на гена PAK1 от див тип (WT) в меланоцити (клетъчна линия B16F10) чрез трансфекция, ние разкрихме, че екзогенно добавеният PAK1 ген повишава индуцируемото от -MSH ниво на меланин с няколко пъти (вижте вляво на Фигура 3, сравнете ленти 2 и 4), докато почти не засяга независимото "базално" ниво на меланин per se (сравнете ленти 1 и 3 в левия панел на фигура 3), което предполага, че PAK1 допринася главно за -MSH/IBMX-зависимимеланогенеза, а не базалната меланогенеза без екзогенен стимулатор(и).

3.4. Серумен ефект върху -MSH/IBMX-индуцируема меланогенеза

По-интересното е, че открихме, че индукцията на меланогенеза от -MSH/IBMX изисква 10 процента FBS (фетален говежди серум) в допълнение към PAK1. Както е показано на Фигура 4А, в среда без серум или -MSH, или IBMX почти не индуциратмеланогенезав WT клетките, въпреки че 10 процента FBS самостоятелно (без -MSH/IBMX) индуцирамеланогенезазначително (с около 60 процента). Интересно е, че меланогенезата в SH трансфектанти (PAK1-дефицитни клетки) в присъствието или отсъствието на серум е на същото ниво като това в WT клетките в отсъствието на серум (вижте Фигура 4B), което предполага, че серум-зависимата меланогенеза също изисква PAK1. В подкрепа на това схващане, серумът сам значително активира киназната активност на PAK1 в WT клетки, но -MSH-зависимото активиране на PAK1 в WT клетки изисква серум (вижте Фигура 4C).

По отношение на химическата природа на меланогенния серумен фактор, който сам активира PAK1, ние спекулираме, че това е PDGF (тромбоцитен растежен фактор) поради следните причини: (i) преди повече от десетилетие показахме, че PDGF е единственият растежен фактор в серум, който активира PAK1 чрез трансактивиране на EGF (епидермален растежен фактор) рецептор от PDGF рецептор (13, 14), а съвсем наскоро други доказаха, че или PDGF, или EGF самостоятелно наистина стимулиратмеланогенезана меланоцитите (15,16).

3.5. Серум/PDGF-зависимата меланогенеза изисква EGF рецептор

В опит да идентифицираме специфичната химическа природа на този меланогенен серумен фактор, тествахме ефекта или на AG1295 (инхибитор, специфичен за PDGF рецептор), или на AG1478 (инхибитор, специфичен за EGF рецептор) върху серум-зависимитемеланогенезав меланоцитите. Както е показано на фигура 5, или 2 µM AG1295, или 400 nM AG1478 силно намаляват серум-зависимитемеланогенезадо нивото, еквивалентно на основната (безсерумна) меланогенеза. Тъй като PDGF присъства в изобилие в серума, но не и EGF и AG1295 не инхибира EGF рецептора, докато AG1478 не инхибира PDGF рецептора (13), най-вероятно е PDGF в серума да активира своя рецептор, който от своя страна трансактивира EGF рецептора, който в крайна сметка активира PAK1, който е от съществено значение за серум-зависимата меланогенеза (за подробности вижте Фигура 6). Въз основа на това предположение, по-късно ще обсъдим най-вероятния механизъм, лежащ в основата на очевидната синергия между -MSH и серум/PDGF за активирането на PAK1, което води до стабилна меланогенеза.

И накрая, трябва да се отбележи, че "базалното" съдържание на меланин без -MSH не е значително променено от свръхекспресиран CA (конститутивно активен) мутант на PAK1, носещ T423E мутация (вижте левия панел на Фигура 3, лента 5), тъй като ако беше или DN (доминантно отрицателен), или неактивен мутант. Всъщност -MSH изобщо не индуцира фосфорилирането на WT PAK1 при Thr 423 (данните не са показани). По този начин може да се заключи, че автофосфорилирането на PAK1 при Thr 423 няма нищо общо с -MSH-индуцираното активиране на PAK1, което води до стабилнотомеланогенезав клетките на меланома. Тъй като T423E мутантът на PAK1 е добре известен като силно онкогенен (6), може би автофосфорилирането при Thr 423 може да служи за преминаване от "меланогенно" към "онкогенно" сигнализиране.

4. Обсъждане

От нашите наблюдения както върху зависимата от PAK1-, така и върху зависимата от PAK4- меланогенеза в меланоцитни/меланомни клетки възникват два потенциално интересни въпроса, които трябва да бъдат посочени: (i) „Специфичната“ меланогенна активност на PAK1 ( само леко експресиран) трябва да бъде много по-висок от този на PAK4 (силно експресиран) в меланомните клетки. (ii) Изглежда, че PAK1 е отговорен главно за индуцираната от серум меланогенеза, докато PAK4 е отговорен главно за присъщата (базална)меланогенеза. С други думи, въпреки че дефицитът на PAK4-е ембрионално смъртоносен при мишки, докато дефицитът на PAK1-сам по себе си не успява да създаде мишки „албиноси“, очевидната разлика в оригиналния цвят на кожата (основенмеланогенеза) между черни и бели хора например може да бъде поне частично отражение на разликата в нивото на експресия на PAK4, както и разликата в нивото на меланогенентирозиназаs.

In vivo, използвайки HRM-2 (пигментирани, но без косми) мишки, наскоро показахме, че крем, съдържащ 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-инхибитор), намалява UV-индуцираната меланогенеза в кожата им до базално ниво, въпреки че все още остава да се изясни дали PAK4 или PAK1 е отговорен за UV-индукцията на меланогенезата (8). Тъй като PAK1 е отговорен за индуцируемата, но не и за базалната меланогенеза, би си струвало да се тества дали PAK1 значително допринася за UV-индуцируематамеланогенеза(слънчев тен), както и с помощта на редкия PAK1 KO (нокаут) мутант, получен от C57B16 щам на мишки, носещи тъмни коси и очи (Hong He et al., непубликувани наблюдения), в опит да се разбере дали разнообразие от билкови PAK1 блокерите в козметиката са полезни за слънцезащитни агенти или не. Интересно е, че се съобщава, че PAK1 се активира от ултравиолетово облъчване и други агенти, увреждащи ДНК (17).

Показано е, че -MSH активира Tyr киназата JAK2 (18), която от своя страна активира PAK1 чрез фосфорилиране при Tyr 285 (вместо Thr 423), което води до взаимодействието PIX-PAK1 (19). Това би могло да обясни защо нито -MSH-зависимото активиране на PAK1, нито меланогенезата включват автофосфорилирането на PAK1 при Thr 423. Затова наскоро проучихме дали PAK1-зависимата меланогенеза е блокирана от мощен билков JAK2- инхибитор, наречен кукурбитацин I (CBI) от горчив пъпеш (Goya), който инхибира директно JAK2 (20), и установи, че CBI инхибирамеланогенезав присъствието на меланогенни хормони с повече от 70 процента, което предполага възможността CBI да блокира не само PAK1, но и PAK4 (5). В този контекст би било от голям интерес да се отбележи, че билковите PAK1-блокери като CAPE, куркумин, шиконин и FTY 720 могат да инхибират -MSH-индуцираната меланогенеза в миши или човешки кожни клетки само с около 50 процента дори при техните концентрации, при които PAK1 е почти напълно блокиран (1,2), докато синтетичният пан-PAK-блокер PF3758309, инхибиращ както PAK1, така и PAK4, премахвамеланогенезав клетките на кожата с около 90 процента при 300 nM (8). С други думи, -MSH-индуцираната меланогенна система в меланоцитите може да разграничи PAK1-специфичните блокери от пан PAK-блокерите. Досега не са идентифицирани билкови PAK4-специфични блокери (различни от PAK4-специфични siPHK). Въпреки това, много мощен квазиноид, наречен глаукарубинон, получен от горчиво дърво, отглеждано в джунглите на Амазонка, наскоро беше показано, че блокира както PAK1, така и PAK4, инхибирайки растежа на ракови клетки на панкреаса както in vitro, така и in vivo (21). По този начин би било от голям интерес да се тества дали този билков PAK-блокер потиска почти напълно меланогенезата на кожните клетки, както PF3758309.

Основната цел на това проучване беше да се съсредоточи върху специфичната меланогенна роля на PAK1, а не да изследва подробно как PAK1 активира меланогенния сигнален път, включително меланогенни ензими и MTF. Въпреки това, най-вероятно е PAK1 да активира директно бета-катенин чрез фосфорилиране при Ser 675, което води до активиране на MITF, което е от съществено значение за експресията на гени, кодиращи меланогенни ензими като напр.тирозиназа(Тир).

Наскоро открихме, че PAK4 (CDC42-зависима киназа 4) също участва вмеланогенезана една и съща меланомна клетъчна линия чрез активиране на два транскрипционни фактора, CREB и бета-катенин, като и двата са от съществено значение за активирането на MIFT (8). Тъй като е известно, че CREB се активира от LIM киназа (22, 23), която подобно на бета-катенин е сред често срещаните директни субстрати на PAK1 и PAK4 (6, 18), най-вероятно е PAK1 и PAK4 да споделят един и същ CREB /бета-катенин-MITF сигнални пътища за активиране на гените на меланогенния ензим.

Въпреки това, подробните сигнални пътища, водещи до -MSH/IBMX-зависимото активиране на PAK1, могат да се различават значително от тези, водещи до активирането на PAK4, главно защото първият включва серумния фактор (PDGF). Серумът сам по себе си е в състояние да активира PAK1 (13) и също така повишава зависимата от -MSH/IBMX активация на PAK1. С други думи, има ясна синергия между серума и тези меланогенни хормони както при активирането на PAK1, така имеланогенеза.

Следното е нашата работна хипотеза за това как може да се осъществи тази синергия. Основният сигнален път, водещ до активиране на PAK1, е каскадата онкогенен EGFR (рецептор на епидермалния растежен фактор)-RAS-PI 3 киназа-RAC/CDC42-PAK1. Само тази каскада обаче не е достатъчна за пълното активиране. Нуждае се от друг фактор, наречен PIX, SH3 адаптерен протеин, който се свързва директно с PAK1 чрез богатия на Pro мотив от 18 аминокиселини, наречен PAK18. Взаимодействието PIX-PAK1 се нуждае от трети протеин, наречен JAK2, Tyr-киназа, който фосфорилира PAK1 при Tyr 285. RAS регулира JAK2 чрез пролактин. Според няколко предишни констатации от нас и други (13-16), PDGF (тромбоцитен растежен фактор) е основният меланогенен серумен фактор(и), който е от съществено значение за -MSH/IBMX-индуцираниямеланогенеза, защото активира своя рецептор (PDGFR) Tyr-киназа, която от своя страна транс-активира EGFR (рецептор на епидермален растежен фактор=ErbB1) Tyr-киназа, което води до активиране на PAK1 чрез онкогенната RAS-PI3 киназа-RAC /CDC42 път (13). По този начин, PDGF в серума сам може да активира PAK1 и да индуцира меланогенеза до половината. Въпреки това, за пълното активиране на PAK1-зависимата меланогенеза, -MSH/IBMX е необходим за активиране на JAK2 чрез cAMP-зависим път (който може да включва PKA), който в крайна сметка осигурява взаимодействието PIX-PAK1 (за подробности, виж Фигура 6).

В заключение, тук представяме първите биохимични доказателства, които биха могли да обяснят как различни билкови PAK1-блокери като CAPE, куркумин и шиконин в козметичните кремове могат да допринесат за "избелване на кожата" ефекти. Серия от аналогични изследвания с човешки меланоцити се очакват за допълнително доказателство или потвърждение.

мака женшен цистанче

Препратки

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Куркуминът потиска алфа-меланоцит-стимулиращия хормон меланогенеза в B16F10 клетки. Int J Mol Med. 2010 г.; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Фенетиловият естер на кафеената киселина инхибира синтеза на меланин, индуциран от алфа-меланоцит-стимулиращия хормон, чрез потискане на трансактивиращата активност на свързания с микрофталмията транскрипционен фактор. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.

3. Maruta H. Билкови терапевтици, които блокират онкогенната киназа PAK1: Практически подход към PAK1-зависими заболявания и дълголетие. Phytother Res. 2014 г.; 28: 656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Няколко билкови съединения в растенията от Окинава директно инхибират онкогенната/старееща киназа PAK1. Drug Discov Ther. 2014 г.; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Комбинация от имунопреципитационен (IP)-ATP_Glo киназен анализ и меланогенеза за оценка на мощни и безопасни PAK1-блокери в клетъчна култура . Drug Discov Ther. 2015 г.; 9:289-295.

6. He H, Maruta H. Онкогенност на PAK и техните субстрати. В: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-активирани кинази: Към лечението на ракови заболявания и други зависими от PAK заболявания (Maruta H, изд.). Elsevier, Оксфорд, 2013 г.; стр. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lesnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. - Растежът на меланома, предизвикан от катенин, изисква транскрипционен фактор, свързан с микрофталмията надолу по веригата. J Cell Biol. 2002 г.; 158:1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-активираната киназа 4 критично регулира меланогенезата чрез активиране на пътищата CREB/MITF и -catenin/MITF. J Invest Dermatol. 2015 г.; 135:1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-активираната киназа 1 стимулира растежа на раковите клетки на дебелото черво и миграцията/инвазията чрез ERK- и AKT-зависими пътища. Biochim Biophys Acta. 2010 г.; 1803: 1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Използване на луминесцентна технология за разработване на киназен анализ: Cdk4 като моделна система. J Pharm Biomed Anal. 2005 г.; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Инхибиторен ефект на флоротанини, изолирани от Ecklonia cava, върху активността на гъбичната тирозиназа и образуването на меланин в миши B16F10 меланомни клетки. J Agric Food Chem. 2009 г.; 57: 4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein инхибира меланогенезата чрез активиране на ERK сигналния път. Int J Mol Med. 2010 г.; 25:923-927.

13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Факторът на растеж, получен от тромбоцити, изисква рецептор на епидермален растежен фактор, за да активира p21-активираните кинази от семейството на киназите. J Biol Chem. 2001 г.; 276: 26741-26744.

14. Сайто Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Рецепторна хетеродимеризация: основен механизъм за трансактивиране на рецептора на епидермален растежен фактор, индуциран от тромбоцитен растежен фактор. Mol Cell Biol. 2001 г.; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Растежният фактор, получен от тромбоцити, регулира пролиферацията и диференциацията на човешки меланоцити по специфичен за етапа на диференциация начин. J Dermatol Sci. 2016 г.; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Епидермалния растежен фактор (EGF) насърчава in vitro диференциацията на клетките на нервния гребен до неврони и меланоцити. Cell Mol Neurobiol. 2009 г.; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p21-активираната протеин киназа гама PAK се активира от йонизиращо лъчение и други агенти, увреждащи ДНК. Прилики и разлики с alpha PAK. J Biol Chem. 1999 г.; 274: 31119-31122.

18. Бъги JJ. Свързването на алфа-меланоцит-стимулиращия хормон към неговия G-протеин-свързан рецептор върху B-лимфоцитите активира Jak/STAT пътя. Biochem J. 1998; 331: 211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Фосфорилирането на тирозин 285 на PAK1 улеснява PIX/GIT1 свързването и оборота на адхезията. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Откриване на JSI-124 (кукурбитацин I), селективна Janus киназа/сигнален преобразувател и активатор на инхибитор на сигналния път на транскрипция 3 с мощна антитуморна активност срещу човешки и миши ракови клетки при мишки. Cancer Res. 2003 г.; 63:1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Глаукарубинон и гемцитабин синергично намаляват растежа на рак на панкреаса чрез понижаване на p21-активираните кинази. Рак Lett. 2014 г.; 346: 264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Цитоскелетните промени, регулирани от PAK4 серин/треонин киназа, се медиират от LIM киназа 1 и кофилин. J Biol Chem. 2001 г.; 276: 32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM киназа 1 активира cAMP-реагиращия елемент-свързващ протеин по време на невронната диференциация на обезсмъртени хипокампални прогениторни клетки. J Biol Chem. 2004 г.; 279: 8903-8910.