Тирозин киназата C-Abl потенцира медиирания от интерферон антивирусен имунитет чрез STAT1 фосфорилиране

РЕЗЮМЕ

Индуцираното от интерферон (IFN) активиране на сигналния преобразувател и активатор на семейството на транскрипция (STAT) е важно събитие в антивирусния имунитет. Тук показваме, че нерецепторните кинази c-Abl и Arg директно взаимодействат със STAT1 и потенцират фосфорилирането на STAT1 върху Y701. c-Abl/Arg може да медиира STAT1 фосфорилиране независимо от Janus кинази в отсъствието на IFNg и да потенцира IFNg-медиирано STAT1 фосфорилиране. Освен това димеризацията на STAT1, ядрената транслокация и генната транскрипция надолу по веригата се регулират от c-Abl/Arg. Дефицитът на c-Abl/Arg (abl1/abl2) значително потиска антивирусните отговори в инфектираните с вируса на везикуларен стоматит клетки. В сравнение с носителя, прилагането на c-Abl/Arg селективен инхибитор AMN107 води до значително повишена смъртност при мишки, заразени с човешки грипен вирус. Нашето проучване показва, че c-Abl играе съществена роля в сигналния път за активиране на STAT1 и осигурява важен подход към регулирането на антивирусния имунитет.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

ВЪВЕДЕНИЕ

Интерфероните (IFNs) играят ключова роля във вродения имунитет срещу вирусна инфекция и имунното наблюдение чрез регулиране на активирането на Janus кинази (JAKs) и сигнален преобразувател и активатор на транскрипция (STAT) и чрез препрограмиране на клетъчната генна експресия (Stark and Darnell, 2012). Свързването на IFNs към съответните им рецептори води до кръстосано фосфорилиране на три свързани JAKs (JAK1, JAK2 и TYK2) и набиране на STATs, което позволява единични тирозинови остатъци близо до С-терминалните краища на тези STATs да бъдат фосфорилирани от JAKs (Платаниас, 2005). След това активираните STAT се димеризират, мигрират към ядрото и се свързват с промоторите на IFN-реагиращи гени, за да индуцират тяхната транскрипция. Тирозиновото фосфорилиране на STATs е съществена стъпка в JAK-STAT пътя на IFN сигнализирането и участва в STAT димеризацията, ядрената транслокация и ДНК свързването (Stark and Darnell, 2012). По този начин фосфорилирането на тирозин функционира като ключ за активиране на STAT. Доказателства, получени чрез целенасочено разрушаване на JAK гени при мишки, предполагат, че JAK са най-важните STAT тирозин кинази (Villarino et al., 2017). Въпреки това е доказано, че тирозиновите остатъци в STAT1, STAT3 и STAT5 са фосфорилирани в JAK-дефицитни клетки от епидермален растежен фактор и рецептори на тромбоцитен растежен фактор с присъща активност на тирозин киназа (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). В допълнение, конститутивно активиране на STATs е наблюдавано в трансформирани клетки, експресиращи онкогенни тирозин кинази като v-Src, v-Abl и BCR-Abl, но дали STATs са директните субстрати на тези кинази остава да се определи (Danial и Rothman , 2000; Реди и др., 2000). Abelson киназата c-Abl на бозайник, кодирана от c-abl (abl1) гена и Abl-свързания генен протеин Arg, кодиран от arg (abl2) гена, са членове на семейство вътреклетъчни нерецепторни тирозин кинази, които са необходими за множество клетъчни процеси, включително пролиферация, апоптоза, адхезия, клетъчна миграция и реакции на стрес (Bradley and Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). Киназната активност на c-Abl е строго регулирана при нормални физиологични условия. Събитията на ретровирусна трансдукция и хромозомна транслокация водят до експресия на v-Abl или BCR-Abl, съответно онкогенна форма на Abl (Advani and Pendergast, 2002). В допълнение, целенасочената делеция на c-abl гена при мишки води до плейотропни фенотипове, свързани с имунна дисфункция, включително висока перинатална смъртност, атрофия на далака и тимуса, лимфопения и повишена чувствителност към инфекция (Schwartzberg et al., 1991). Освен това, лечението на BCR-Abl-положителна хронична миелоидна левкемия (CML) с Abl инхибиторите STI571 (иматиниб) и AMN107 (нилотиниб) е свързано с имуносупресия при подгрупа пациенти (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi и др., 2003). Предишни проучвания показват, че cAbl играе роля в регулирането на TCR (Т-клетъчен рецептор)- и BCR (В-клетъчен рецептор)-медиирана сигнална трансдукция, развитие, пролиферация и производство на цитокини (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002 ; Silberman et al., 2008). Abl-дефицитните мишки също показват намален брой T/B клетки (Gu et al., 2009; Liberatore and Goff, 2009; Schwartzberg et al., 1991). Въпреки това, механизмите, лежащи в основата на увредения имунитет, който възниква при отсъствие или инхибиране на c-Abl, остават неуловими. Широко се съобщава, че сигналният път на JAK-STAT е от съществено значение за индуцирана от BCR-Abl трансформация (Carlesso et al., 1996; Danial et al., 1998; de Groot et al., 1999). Следователно си струва да се проучи дали JAK-STAT може също да допринесе за вроден имунитет, включен в c-Abl. Тук съобщаваме, че STAT1 взаимодейства и се фосфорилира от c-Abl по JAK-независим начин, чрез който се регулират димеризацията, ядрената локализация и генната транскрипция надолу по веригата на STAT1. Тези констатации разкриха, че в допълнение към JAK киназата, c-Abl е незаменим за пълното активиране на STAT1 и последващите IFN-медиирани антивирусни отговори.

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

РЕЗУЛТАТИ

Транскрипцията на интерферон гама-активирана последователност на гени надолу по веригата се регулира от Abl киназа

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 бяха идентифицирани в c-abl/arg двоен нокаут (DKO) и WT MEFs, от които 960 бяха регулирани нагоре и 784 бяха регулирани надолу (Фигура 1A, вляво). За по-нататъшно изследване на потенциалните клетъчни функции и свързаните с тях пътища на тези DEG, ние извършихме анализ на генна онтология (GO) (за термини в биологичния процес, молекулярна функция и клетъчен компонент) (Фигура S1A). Гените, регулирани надолу от c-Abl и Arg, се свързват главно със защитните реакции на вируса (GO: 0009615, GO: 0051607 и GO: 0045071) и имунните отговори (GO: 0002376, GO: 0045087). Допълнителен анализ показа, че IFN-специфичните гени (Liu et al., 2012) са обогатени сред регулираните надолу гени (Фигури 1A, вдясно и S1B). За валидиране на диференциалните профили на експресия, нивата на транскрипт на антивирусни гени, включително cxcl10, psmb9, tap1 и isg15, бяха определени чрез количествени анализи на обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (RT-PCR) в реално време и нормализирани до нивата на psma5 , което не е силно регулирано от c-Abl. В сравнение с WT MEFs, c-abl / arg / MEFs показват значително по-ниски нива на транскрипция на тези гени, но индуцираните от DKO редукции бяха напълно обърнати от c-Abl спасяване по дозозависим начин (Фигури 1B и S1C). Тези данни предполагат, че панел от IFN-индуцирани гени се регулира от c-Abl и Arg. За да се изследват ключовите транскрипционни елементи, регулирани от Abl кинази в отговор на IFN, е конструирана луциферазна репортерна система на базата на споделен двупосочен промотор tap1/psmb9, регулиран от IFNg (Фигура 1C). Както се очакваше, c-Abl/Arg-селективният инхибитор AMN107 значително инхибира транскрипционната активност на промотора tap1 (червен) (Фигура 1D). Трябва да се отбележи, че за разлика от делецията на NFkB-действащи (синьо) или IFN консенсусна последователност (жълто) елементи, лечението с AMN107 има малък или никакъв ефект върху активността на промотора на tap1, когато елементът на гама-активирана последователност (GAS) (зелен) беше изтрит (Фигура 1D ). Тези констатации показват, че STAT1-насоченият GAS цис-елемент участва в c-Abl-регулираната tap1 транскрипция, което силно предполага, че STAT1 е отговорен за c-Abl-медиирана регулация на IFN-реагираща генна експресия.

c-Abl директно взаимодейства със STAT1

IFN-индуцираната експресия на TAP1 се регулира от c-Abl, вероятно чрез STAT1, което предполага, че STAT1 може да бъде свързан с c-Abl. За да се потвърди тази хипотеза, лизатите на MCF-7 клетки бяха подложени на анти-c-Abl имунопреципитация, последвано от имуноблотинг с анти-STAT1 антитяло. STAT1 присъства в анти-c-Abl, но не и в IgG имунопреципитати (Фигура 2А). След това 293Т клетки бяха котрансфектирани с Myc-cAbl и Flag-STAT1 или Flag-Vector като контрола. Наличието на Myc-c-Abl в анти-Flag имунопреципитати, приготвени от клетки, коекспресиращи Flag-STAT1, но не Flag-Vector, показва връзка между ектопично експресиран Myc-c-Abl и Flag-STAT1 (Фигура 2B, вляво). Подобен резултат беше получен и в реципрочен експеримент (Фигура 2B, вдясно). Освен това, другият член на семейството Abl, Arg (Abl2), който е силно хомоложен на c-Abl в неговия N-терминален домейн (NTD), също взаимодейства със STAT1 (Фигура S2A).

Фигура 1. c-Abl регулира промоторите на IFN-чувствителни гени чрез GAS елементи

След това, лизати, приготвени от 293T клетки, експресиращи Flag-c-Abl, се инкубират с агарозно-конюгиран GST-STAT1 или GST самостоятелно и Flag-c-Abl се открива в GST-STAT1, но не и в GST адсорбатите (Фигура 2C). За да се изключи непряко свързване, медиирано от други компоненти в клетъчните лизати, анти-Flag имунопреципитатите, приготвени от 293T клетки, експресиращи Flag-c-Abl, бяха подложени на SDS-PAGE (електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел) и протеините бяха прехвърлени в PVDF (поливинилиден флуорид) мембрана и след това попива с разтворим GST-STAT1 или GST (като контрола). Резултатите показват, че GST-STAT1, но не и GST, свързва c-Abl директно in vitro (Фигура 2D). За да се определи c-Abl-свързващият домен, агарозно-конюгиран и GST-слят STAT1 с пълна дължина или съкратен STAT1 (Фигура 2E, горен панел) се инкубират с лизатите на 293T клетки, експресиращи Flag-c-Abl. Анализът на адсорбатите чрез имуноблотинг с анти-Flag антитяло показа, че аминокиселини 577–750 от STAT1, които съставляват регион, който съдържа SH2 домейна и трансактивационния домен, са отговорни за c-Abl взаимодействието (Фигура 2E, долен панел) . По подобен начин Flag-STAT1, имунопреципитиран от анти-Flag антитялото, се фракционира чрез SDS-PAGE и се прехвърля върху PVDF мембрана. След това мембраната се попива само с разтворим GST-c-Abl SH3 или GST-c-Abl SH2 и GST. Резултатът показа, че c-Abl SH3 домейнът е основният домейн, отговорен за асоциирането на STAT1 (Фигура 2F). Освен това, взаимодействието in situ на ендогенен c-Abl със STAT1 беше оценено чрез Duolink proximity ligation assay (PLA). STAT1: c-Abl комплекси се наблюдават главно в цитоплазмата и образуването на тези комплекси е значително потенцирано чрез IFNg стимулация (Фигура 2G). Взети заедно, тези открития демонстрират пряка връзка между c-Abl и STAT1 както in vitro, така и in vivo.

Фигура 2. c-Abl взаимодейства със STAT1

c-Abl медиира JAK-независимо STAT1 фосфорилиране

За да се изследва дали STAT1 е субстрат на c-Abl, пречистен His-маркиран STAT1 се инкубира с рекомбинантен c-Abl (съдържащ каталитичния домен при аминокиселини 237–643) в присъствието на ATP за in vitro киназен анализ. Имуноблотинг на реакционния продукт с анти-фосфо-тирозин и анти-фосфо-STAT1 Y701 показа, че STAT1 е директно фосфорилиран от c-Abl при тирозинов остатък(и), включително Y701, in vitro (Фигура 3А). След това открихме, че Flag-STAT1, експресиран в 293T клетки, е тирозин фосфорилиран, особено върху остатъка Y701, от Myc-c-Abl, но не и от киназа-неактивния мутант Myc-c-Abl (K290R). Освен това, при лечение с c-Abl/Arg-селективен инхибитор AMN107, c-Abl-медиирано STAT1 фосфорилиране беше почти елиминирано, което показва, че тирозиновото фосфорилиране на STAT1 зависи от c-Abl киназната активност (Фигура 3B). c-Abl-медиирано STAT1 фосфорилиране беше значително нарушено, когато STAT1 Y701 беше заместен с фенилаланин, което показва, че Y701 е основният фосфозит на Abl (Фигура 3C). Освен това, STAT1 също беше фосфорилиран от Arg (Фигура S2B). За допълнително очертаване на специфичните STAT1 остатъци, фосфорилирани от c-Abl, Flag-STAT1, коекспресиран с Myc-c-Abl, беше подложен на течна хроматография, съчетана с тандемен масспектрометричен анализ. В допълнение към добре дефинирания и функционално важен STAT1 фосфозит Y701 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993), два други фосфозита, Y106 и Y665, също бяха идентифицирани (Фигура S4A). В сравнение с WT STAT1, както Y106F, така и Y701F мутанти показват компрометирано фосфорилиране на тирозин (Фигура 3C). Въпреки това, фосфорилирането на STAT1 Y701 не е значително повлияно от фосфорилирането на Y106 и Y665, което показва, че Y106 и Y665 могат да играят различни роли (Фигура S4B). Заедно тези констатации показват, че тирозиновите остатъци на STAT1, включително докладвания по-рано остатък Y701, могат да бъдат фосфорилирани от Abl семейство кинази.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

JAK са основно отговорни за индуцираното от IFN STAT1 Y701 фосфорилиране (Villarino et al., 2017). Както се очакваше, фосфорилирането на STAT1 Y701 беше индуцирано от IFNg и беше значително инхибирано от руксолитиниб, биспецифичен инхибитор на JAK1 и JAK2 (Фигура 3D). По-специално, компрометирано фосфорилиране на Y701 също се наблюдава при инхибиране на Abl (Фигура 3D, лента 4), което показва, че c-Abl частично допринася за IFNg-индуцираното STAT1 активиране. Освен това, фосфорилирането на STAT1 Y701 също се индуцира от DPH, клетъчно пропусклив c-Abl активатор, в по-малка степен, отколкото от IFNg, което може да бъде напълно обърнато от AMN107 (Фигура 3E). За да се потвърди DPH-индуцираното Abl активиране, също беше открито c-Abl Y412 фосфорилиране, индикатор за Abl активиране (Фигура 3E). Доказано е, че активирането на JAK2 възниква първо и е необходимо за последващото активиране на JAK1 (Briscoe et al., 1996). За да изключим ефекта на JAK2 върху активирането на STAT1, установихме клетъчна линия jak2-KO MCF-7 чрез CRISPR. Намалено, но откриваемо STAT1 Y701 фосфорилиране се наблюдава в jak2-KO MCF-7 клетки в сравнение с това в родителските MCF-7 клетки, които биха могли да бъдат потенцирани по подобен начин в присъствието на Myc-c-Abl но не и Myc-c-Abl (K290R) (Фигура 3F) и е допълнително намален след лечение с AMN107. В c-abl / arg/клетки, IFNg-индуцираното фосфорилиране на STAT1 при Y701 беше силно компрометирано по начин, зависим от времето и дозата (Фигура 3G). Всички тези наблюдения показват, че c-Abl киназата може директно да фосфорилира и активира STAT1 независимо от IFNg-JAK сигналния път и че, което е важно, тези две кинази могат да имат синергични ефекти върху STAT1 фосфорилирането при Y701.

Фигура 3. STAT1 е фосфорилиран от c-Abl

Фигура 4. c-Abl насърчава образуването на STAT1 димер и ядрения импорт

c-Abl-медиирано фосфорилиране регулира STAT1 трансактивиращата активност

Тирозиновото фосфорилиране на STATs е съществена стъпка в JAK-STAT пътя на IFN сигнализирането и участва в STAT димеризацията, ядрената транслокация и ДНК свързването. За да се изследва дали c-Abl-медиираното фосфорилиране регулира STAT димеризацията, GFP-STAT1 и Flag-STAT1 бяха коекспресирани в 293T клетки в присъствието или отсъствието на Myc-c-Abl. Нивата на GFP-STAT1 в анти-Flag имунопреципитати бяха изследвани, за да се покаже STAT1 димеризация. Както е показано на Фигура 4А, коекспресията на c-Abl потенцира образуването на STAT1-STAT1 хомодимери. Имунофлуоресцентна микроскопия на MCF-7 клетки допълнително демонстрира, че аблация на c-abl/arg или лечение с AMN107 значително уврежда индуцираната от IFNg STAT1 ядрена транслокация (Фигури 4B и 4C).

Освен това бяха използвани анализи за изместване на електромобилността, за да се анализира активността на свързване на промотора на STAT1. IRF1 промоторна област, маркирана с биотин, съдържаща STAT1 свързваща консенсусна последователност, беше използвана като проба за откриване (Aaronson and Horvath, 2002). Тази проба беше инкубирана с ядрени екстракти от 293T клетки, екзогенно експресиращи STAT1 със или без c-Abl, което беше балансирано въз основа на фигура S5A. Както е показано на Фигура 4D, множество комплекси, свързани със сонда IRF1, съдържащи STAT1, са наблюдавани в ядрени екстракти (Фигура 4D, лента 1). Образуването на комплекс се увеличава леко с третиране с IFNg (Фигура 4D, лента 2) и се увеличава значително в клетки, ектопично експресиращи c-Abl (Фигура 4D, лента 3). Въпреки това, в сравнение с WT STAT1, c-Abl показва малък, ако има никакъв ефект върху свързването на промотора на STAT1, съдържащ Y701F (Фигура 4D, пътеки 7 и 8), докато Y106F и Y665F мутациите не показват почти никаква разлика с WT STAT1. Специфичността на комплексите, съдържащи STAT1 и сондата за откриване, беше потвърдена при добавяне на немаркирана конкурентна сонда (Фигура 4D, лента 9). Освен това, добавянето на анти STAT1 антитяло доведе до образуването на свръхизместена лента (Фигура 4D, пътека 11). Когато маркираните проби се инкубират с ядрени екстракти от 293Т клетки като контрола, не се наблюдават комплекси (Фигура 4D, лента 10). Тези резултати показват, че c-Abl-медиираното STAT1 Y701 фосфорилиране потенцира свързването на STAT1 с неговите целеви промотори.

Фигура 5. c-Abl регулира генната експресия, свързана с IFN

След това индуцираната от IFNg трансактивация на основни STAT1-регулирани гени, включително ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 и tap1, беше оценена в WT или c-abl/ arg DKO MCF-7 клетки чрез RT-PCR. Както се очакваше, генната транскрипция беше значително нарушена от изчерпването на c-abl/arg (Фигура 5А). Освен това, гените, обикновено индуцирани от IFNg и IFNa, не успяват да бъдат стимулирани от IFNs в присъствието на AMN107 (Фигури 5B и 5C). Тези открития показват, че трансактивиращата активност на STAT1 е положително регулирана от c-Abl.

c-Abl насърчава IFN-зависимите антивирусни ефекти

TAP1 и PSMB9 участват в производството и представянето на пептиди в пътя за обработка на антиген на MHC клас I (Ghannam et al., 2014; Vitale et al., 1998). В съответствие с предишни открития, представянето на антиген на овалбумин от JAWS II клетки към B3Z клетки беше значително потиснато от AMN107 поради намаленото производство на IL2 (Фигура 6А). За по-нататъшна оценка на антивирусните биологични последици от регулирането на STAT1 от c-Abl, WT и c-abl / arg / MEFs, предварително третирани със или без серийно разреден IFNg, бяха инфектирани с вирус на везикуларен стоматит (VSV). VSV инфекцията причинява по-тежка клетъчна смърт в c-abl / arg / MEFs и WT клетки, третирани с AMN107, отколкото в WT MEFs, третирани с носители (Фигура 6B). Лечението с IFNg значително намалява клетъчната смърт, предизвикана от вирусна инфекция, но има много по-слабо изразен ефект в присъствието на AMN107. В съответствие с това откритие, c-abl/arg аблация в MEFs доведе до нечувствителност към IFN стимулация, но този ефект беше значително обърнат от c-Abl спасяване (Фигура 6B). След това A549 клетки, третирани с или без AMN107, бяха заразени с вирус на нюкасълска болест (NDV), експресиращ GFP, и резултатите разкриха, че вирусната репликация също се потенцира от лечението с AMN107, но се потиска от експресията на c-Abl (Фигура 6C). В съответствие с констатацията, че ДНК трансфекцията води до активиране на ендогенния IFN отговор (Park et al., 2003), трансфекцията с pcDNA вектора инхибира вирусната пролиферация. Трябва да се отбележи, че трансфекцията с Flag-c-Abl води до по-изразен инхибиторен ефект върху вирусната пролиферация, отколкото трансфекцията с празен вектор (Фигура 6C). Освен това, лечението с IFNg има малък, ако има такъв, ефект върху вирусната инфекция в присъствието на c-Abl-селективния инхибитор AMN107 (Фигура 6D). Тези данни предполагат, че c-Abl играе важна роля в STAT1-медиираните антивирусни ефекти. След това изследвахме ролите на c-Abl при вирусна инфекция в call/fl, Lck-Cre (c-abl-условен нокаут, c-abl-cKO) мишки, при които c-abl беше специфично нокаутиран в тимоцитите (Фигура S7A ), тъй като нокаутът на гена c-abl в зародишната линия води до бягане и смърт през първите две седмици след раждането (Koleske et al., 1998; Schwartzberg et al., 1991). След това, WT и c-abl-cKO мишки бяха интраназално заразени с грипен вирус А (IAV). Наблюдавана е статистически незначима по-висока смъртност сред c-abl-cKO мишки, отколкото сред WT мишки. WT мишки, на които непрекъснато се прилага AMN107, който систематично потиска c-Abl/Arg киназите във всички тъкани, демонстрират значително повишена чувствителност към IAV (Фигура 6E). Взети заедно, тези открития показват, че c-Abl е необходим за антивирусен имунитет при животни.

Фигура 6. c-Abl насърчава IFN-зависими антивирусни ефекти

ДИСКУСИЯ

IFNg е един от най-важните имуномодулиращи цитокини и играе жизненоважна роля във вродения имунитет срещу вирусна инфекция. При канонично IFNg сигнализиране, при IFNg стимулация, JAK1 и JAK2 се набират към цитоплазмените опашки на агрегирани IFNg рецептори (IFNGRs) и се активират чрез последователни събития на автофосфорилиране и трансфосфорилиране (Stark, 2007; Villarino et al., 2017). След това STAT1 се свързва с IFNGR чрез асоцииране на неговия SH2 домейн с последователност на разпознаване в IFNGR (Y440DKPH444), в рамките на която Y440 е фосфорилиран от JAK (Greenlund et al., 1995). След своето фосфорилиране при Y701 от JAKs, STAT1 димеризира и се премества в ядрото, където насърчава транскрипцията на масив от IFNg-реагиращи гени (Aaronson и Horvath, 2002; Stark и Darnell, 2012). Stat1 аблация при мишки води до липса на транскрипционни отговори към IFN и липса на IFN-индуцирана антимикробна и антивирусна активност в клетките (Meraz et al., 1996). Stat1 / мишки също демонстрират повишена чувствителност към развитието на спонтанни и химически (3-метилхолантрен)-индуцирани тумори (Kaplan et al., 1998) и свръхчувствителност към определени възпалителни патологии (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Освен това, STAT1 сигнализирането предпазва Т клетките от цитотоксичност, медиирана от естествени клетки убийци (Kang et al., 2019).Тези открития предполагат, че STAT1 медиира вроденото имунно активиране и туморния имунитет.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Schlatterer и др. съобщава, че c-Abl, но не и Arg, може да предизвика загуба на неврони чрез подтикване към активиране на STAT1 и производство на интерферон. Въпреки това, точният механизъм, отговорен за c-Abl-зависимото STAT1 активиране, не е изяснен (Schlatterer et al., 2012). Тук показваме, че c-Abl се свързва и фосфорилира STAT1 и взаимодейства със STAT2 директно in vitro (Фигури 2 и 3, S8A, S9A и S10A). STAT1 Y701 е ексклузивно фосфорилиран от JAK кинази, които регулират образуването на STAT1 димер (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) и нуклеоцитоплазменото преместване по време на IFNg сигнализиране (Mao et al., 2005; Mertens et al., 2006; Zhong et al., 2005). Нашето проучване неочаквано установи, че c-Abl, друга киназа, различна от JAKs, също допринася за фосфорилирането на STAT1 Y701 независимо (Фигура 3). Въпреки че c-Abl-медиираното фосфорилиране на Y701 не е толкова мощно, колкото това на JAKs, изглежда е необходимо Y701 да достигне максимално фосфорилиране, тъй като се наблюдава сериозно нарушено фосфорилиране на Y701 в c-abl / arg/клетки при IFNg стимул, и IFNg- индуцираното STAT1 Y701 фосфорилиране се инхибира от AMN107, от 1,25 тМ до 5 тМ, по дозозависим начин (Фигури 3G и S11A). Въпреки това, фосфорилирането на Y701 не се влияе много от състоянието на фосфорилиране на Y106 и Y665, другите два фосфозита на c-Abl, което показва, че потенцираното фосфорилиране на STAT1 Y701 не е резултат от c-Abl-медиирано многоместно фосфорилиране на STAT1, но е възможно приписват на засилената активност на JAK. Предишни проучвания показват, че конститутивно активиране на JAK1 и променливо активиране на JAK2 са наблюдавани в BCR-Abl-експресиращи клетки (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). Освен това е показано, че BCR-Abl умерено активира STAT1 и STAT2 чрез тирозиновото фосфорилиране на JAK1, JAK2 и JAK3 (Henderson et al., 1997). Настоящите доказателства подкрепят, че Abl и JAK могат да имат изразени синергични ефекти върху фосфорилирането на STAT1 при Y701 (Фигура 3E).

В допълнение към Y701, фосфорилирането на Y106 и Y665 беше идентифицирано едновременно (Фигури 3C и S4A). Тези фосфозити не участват във фосфорилирането на STAT1 Y701 или хомодимеризацията на STAT1 (фигури S4B и S4C). Въпреки това, Мърфи и колегите откриха, че взаимодействието между NTDs (домейн на взаимодействие на N-краен протеин, аминокиселини 1-136) на мономерите е необходимо за димеризацията на нефосфорилирани STAT молекули с пълна дължина (Ota et al., 2004). STAT1 мутанти (F77A и/или L78A) не успяват да образуват нефосфорилирани димери и тези мутанти проявяват фенотипно персистиращо фосфорилиране в третирани с IFN клетки и резистентност към TC45-медиирано дефосфорилиране in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 в NTD, който е близо до F77 и L78, може да е отговорен за поддържането на STAT1 в състояние на фосфорилиран димер и за поддържането на STAT1 в ядрото при йонизиращо лъчение (фигури S6A и S6B). Освен това, SH2 домейнът взаимодейства с фосфорилирания тирозин-съдържащ домен, когато образуването на фосфорилиран хомодимер се индуцира от IFN (Shuai et al., 1994). Y665, който се намира в домейна SH2, може да повлияе на димеризацията. Функциите на c-Abl-медиирани места за фосфорилиране (Y106 и Y665) изискват допълнително изследване.

Подобно на JAK, c-Abl-медиираното фосфорилиране регулира образуването на STAT1 димер (включително STAT1- STAT1 хомодимер и STAT1-STAT2 образуване на хетеродимер (Фигури 4A, S12A и S12B)), ядрена транслокация, ДНК свързване и транскрипция на IFN-стимулирани гени. Разрушаването на Abl допринася за потенцирана вирусна пролиферация и повишена индуцирана от вируса клетъчна смърт (Фигури 6B, 6C и 6D). Освен това открихме, че йонизиращото лъчение (IR) индуцира STAT1 ядрена транслокация в отсъствието на c-Abl инхибитора (фигури S6A и S6B). IR активира c-Abl директно (Pendergast, 2002) и впоследствие STAT1-зависимото IFNg сигнализиране, което може да осигури основен механизъм, чрез който лъчетерапията инициира IFN-каскадна вродена и адаптивна имунна атака върху тумора (Burnette et al ., 2011) и предлага по-силен вроден имунен статус в отговор на IR стимули. В сравнение с WT котила, мишки, при които c-abl е условно нокаутиран в тимоцитите, показват по-висока, но не статистически значима смъртност. Трябва да се отбележи, че мишките, на които системно е прилаган c-Abl/Arg инхибиторът AMN107, имат по-висока смъртност (Фигура 6E), което показва, че експресията на c-Abl в различни тъкани допринася за антивирусния имунитет при животните. От тези данни предполагаме, че ендогенният Abl предлага латентна базална резистентност към вирусна инфекция и че активираният Abl, стимулиран от йонизиращо лъчение, предпазва клетките. Abl киназите са конститутивно активирани при повечето пациенти с ХМЛ. Инхибиторите на Abl киназата STI571 и AMN107 представляват лечението на първа линия за лечение на ХМЛ. Въпреки това често се наблюдава инфекция на горните дихателни пътища и имуносупресия, което може да бъде причинено от потискането на медиирания от STAT имунен регулаторен път (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Нашите открития добавиха теоретична основа за оптимизиране на терапията.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

В обобщение, беше установено, че тирозин киназата c-Abl се свързва със STAT1 in vivo и in vitro, за насърчаване на фосфорилирането на STAT1 при Y701 независимо от JAK, за потенциране на трансактивирането и за медииране на вродени имунни отговори срещу инфекция, особено в контекста на c - Стрес, свързан с Abl. Нашето откритие осигурява допълнителен подход за активиране на STAT1, което допринася за нарастващия обем от знания относно регулирането на IFN сигналния път надолу по веригата.

ПРЕПРАТКИ

Aaronson, DS и Horvath, CM (2002). Пътна карта за тези, които не знаят JAK-STAT. Наука 296, 1653–1655.

Advani, AS и Pendergast, AM (2002). Варианти на BcrAbl: биологични и клинични аспекти. Левк. Рез. 26, 713–720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH и Kuchroo, VK (2004). Загубата на T-bet, но не и на STAT1, предотвратява развитието на експериментален автоимунен енцефаломиелит. J. Exp. Med. 200, 79–87.

Брадли, WD и Koleske, AJ (2009). Регулиране на клетъчната миграция и морфогенеза от кинази от семейство Abl: нововъзникващи механизми и физиологични контексти. J. Cell Sci. 122, 3441–3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN, и Kerr, IM (1996). Киназа-негативните мутанти на JAK1 могат да поддържат интерферон-гама-индуцируема генна експресия, но не и антивирусно състояние. EMBO J. 15, 799–809.

Carlesso, N., Frank, DA и Griffin, JD (1996). Тирозил фосфорилиране и ДНК свързваща активност на сигнални преобразуватели и активатори на транскрипция (STAT) протеини в хематопоетични клетъчни линии, трансформирани от Bcr/Abl. J. Exp. Med. 183, 811–820.

Chai, SK, Nichols, GL и Rothman, P. (1997). Конститутивно активиране на JAK и STAT в BCR Abl-експресиращи клетъчни линии и периферни кръвни клетки, получени от пациенти с левкемия. J. Immunol. 159, 4720–4728.

Количели, Дж. (2010). ABL тирозин кинази: еволюция на функцията, регулация и специфичност. Sci. Сигнал. 3, re6.

Даниал, NN, Лосман, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY и Rothman, PB (1998). Директното взаимодействие на Jak1 и v-Abl е необходимо за v-Abl-индуцирано активиране на STATs и пролиферация. Mol. Cell Biol. 18, 6795–6804.

Danial, NN и Rothman, P. (2000). JAK-STAT сигнализация, активирана от Abl онкогени. Онкоген 19, 2523–2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R. и Koenderman, L. (1999). Активирането на STAT5 от BCR-Abl допринася за трансформацията на K562 левкемични клетки. Кръв 94, 1108–1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR, и Vuk-Pavlovic, S. (2004). Иматиниб мезилатът инхибира Т-клетъчната пролиферация in vitro и свръхчувствителността от забавен тип in vivo. Кръв 104, 1094–1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. и Liu, X. (2017). Глобална регулация на диференциална генна експресия от c-abl/arg онкогенни кинази. Med. Sci. Монит. 23, 2625–2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , et al. (2014 г.). Повишената регулация на имунопротеазомните субединици при миозит показва активно възпаление с участието на антиген-представящи клетки, CD8 Т-клетки и IFNGamma. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. и Schreiber, RD (1995). Набиране на статистика от тирозин-фосфорилирани цитокинови рецептори: подреден обратим процес, управляван от афинитет. Имунитет 2, 677–687.

Grouber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. и Pendergast, AM (2013). Роля на киназите от семейство ABL при рак: от левкемия до солидни тумори. Нац. Rev. Cancer 13, 559–571.

Gu, JJ, Ryu, JR и Pendergast, AM (2009). Abl тирозин кинази в Т-клетъчно сигнализиране. Immunol. Rev. 228, 170–183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. и Deisseroth, AB (1997). Потенциална роля на bcr-abl в активирането на JAK1 киназа. Clin. Cancer Res. 3, 145–149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et al. (2016). Дългосрочни ползи и рискове от първа линия нилотиниб срещу иматиниб за хронична миелоидна левкемия в хронична фаза: 5-годишна актуализация на рандомизираното проучване ENESTnd. Левкемия 30, 1044–1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M. и Snapper, SB (2019). STAT1 сигнализирането предпазва Т клетките от цитотоксичност, медиирана от NK клетки. Нац. Общ. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ и Schreiber, RD (1998). Демонстрация на интерферон гама-зависима система за наблюдение на тумори при имунокомпетентни мишки. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 95, 7556–7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA, и Baltimore, D. (1998). Съществени роли за Abl и Arg тирозин киназите в неврулацията. Неврон 21, 1259–1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE, и Stark, GR (1996). Роли на JAKs в активирането на STAT и стимулиране на експресията на c-fos ген от епидермален растежен фактор. Mol. Cell Biol. 16, 369–375.