Времето и исхемичните ефекти върху бъбречната фиброза след контралатерална нефректомия

Въведение

Честотата наостра бъбречна травма(AKI) се е увеличил драматично в световен мащаб през последните години [1]. AKI може да бъде причинено от трансплантация на орган, постоперативна перфузия, кървене, дехидратация, шок и сепсис в клиничната практика [2]. Скорошни епидемиологични и експериментални проучвания показват, че тежестта, честотата и продължителността на AKI са тясно свързани с последващата честота нахронично бъбречно заболяване(CKD). Бъбречната фиброза след AKI може да доведе до ХБН или дорикраен стадий на бъбречно заболяване(ESKD) [3–5], което предполага, че AKI и CKD са свързани синдроми [6]. Въпреки това, механизмите, лежащи в основата на прехода от AKI към CKD, остават неизвестни въпреки многобройните експериментални и клинични проучвания. Животинските модели са важни инструменти за изследване на механизмите, чрез които AKI води до ХБН. Бъбречно исхемично-реперфузионно увреждане (IRI) е една от основните причини за AKI и са разработени няколко животински модела на AKI, предизвикано от IRI [7], включително двустранния IRI (bIRI) модел, едностранния IRI модел с непокътнат контралатерален бъбрек моделът uIRI с едновременна контралатерална нефректомия и моделът uIRI със забавена контралатерална нефректомия.

Моделът bIRI е по-малко последователен, защото когато исхемичното увреждане на двата бъбрека е твърде леко, няма значителни фиброзни промени в дългосрочен план. Когато AKI е твърде тежък, мишките могат да умрат във фазата на остро нараняване. Освен това малки разлики в увреждането на двата бъбрека могат да доведат до значителни разлики в тяхната хронична бъбречна патология след няколко седмици [8,9]. Моделът uIRI с едновременна контралатерална нефротомия е подобен на модела bIRI, тъй като остава само увреденият бъбрек поради нефректомията от другата страна [10]. В IRI модела с интактен контралатерален бъбрек, фиброзата на исхемичния бъбрек е тежка [11,12]. Този модел е много последователен и надежден за дългосрочно наблюдение от изследователи. Въпреки това, поради наличието на контралатерален неувреден бъбрек, той не може да се използва за оценка на изчислената скорост на гломерулна филтрация (eGFR), серумен креатинин (SCr) и уреен азот в кръвта (BUN) [11–14]. В сравнение с двата модела uIRI, споменати по-горе, моделът uIRI със забавена контралатерална нефректомия преодолява тези проблеми и може да се използва както за дългосрочни наблюдения след AKI, така и за мониториране на бъбречната функция. Следователно този модел е подходящ за изследване на прехода AKI-CKD [15].

НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ ЕКСТРАКТ ОТ CISTANCHE ЗАОСТРО БЪБРЕЧНО УВРЕЖДАНЕ

Независимо от това, различните исхемични състояния и интервалът между контралатералната нефректомия и uIRI могат да имат значително въздействие върху прогресията и тежестта на ХБН след AKI. Предишни проучвания се фокусираха върху ефекта от продължителността на исхемията върху бъбречната фиброза след AKI и не обърнаха много внимание на основната телесна температура по време на исхемия. Например, Skrypnyk et al. [12] контролират исхемичната температура при 38 C чрез система с водна баня, с исхемична продължителност от 30 минути, а контралатералният непокътнат бъбрек се отстранява 8 дни след uIRI. Резултатът показа, че исхемичният бъбрек има значителни фиброзни промени 28 дни след uIRI. Със същата исхемична продължителност Xiao et al. [8] показват, че значителни фиброзни промени са настъпили 11 дни след uIRI, когато исхемичната температура е контролирана при 37 C 38 C и интервалът от време между uIRI и контралатералната нефректомия е 10 дни. Някои изследователи, като Colombaro et al. [14] и Li et al. [16] не споменават исхемичната температура в своите проучвания.

Междувременно малко хора изследваха ефекта от времевия интервал между контралатералната нефректомия и uIRI в този модел, което доведе до много различни резултати сред различните лаборатории, което също драматично повлия на следващите експерименти. В това проучване ние изследвахме ефектите на основните фактори, влияещи върху бъбречната фиброза след AKI, включително интервала от време между контралатералната нефректомия и uIRI, основната телесна температура по време на исхемия и продължителността на исхемията. Имахме за цел да предоставим справка, за да направим подходящ животински модел за изучаване на прехода на AKI CKD

Материали и методи Животински модели

Мъжки мишки C57BL/6J (на възраст 8–10 седмици, приблизително 22 g тегло; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Китай) получиха безплатен достъп до храна и вода в Центъра за експерименти с животни на Медицинския университет в Шанси. Условията на размножаване бяха както следва: влажност 40–70%, температура 23 C, клас на чистота на въздуха 7, контролиран 12-h цикъл светлина/тъмнина при условия без патогени, облъчване с Co60 на захранване и пречистена вода. Всички процедури за това проучване бяха одобрени от Комитета по етика на животните на Втората болница на Медицинския университет в Шанси (етичен номер: DW2022028).

протоколи

Като се има предвид, че продължителността на исхемията, основните телесни температури по време на исхемия и времената на резекция на контралатералния неувреден бъбрек могат да окажат влияние върху тежестта на AKI и последващата бъбречна фиброза, ние изследвахме ефектите на горните три фактора поотделно, като другите два бяха фиксирани. Бяха проведени три експеримента, както следва.

Протокол 1: За да се наблюдава ефектът от интервала между контралатералната нефректомия и uIRI върху бъбречната функция и фиброзата след AKI, исхемичното време на левия бъбрек беше фиксирано на 24 минути и основната телесна температура беше фиксирана на 37 C по време на бъбрека исхемия междувременно. Резекцията на десния бъбрек беше извършена съответно на ден 7, ден 10 и ден 14 (n=8 на група) след IRI на левия бъбрек. Ние определихме продължителността на исхемията и бъбречната резекция въз основа на резултатите от предишни проучвания [8,10,12,15] и нашите предекспериментални резултати. Вижте Фигура 1(A–C) за протокола на изследването.

Протокол 2: За да се наблюдава ефектът от основната телесна температура по време на исхемия върху прехода AKI-CKD, исхемичното време на левия бъбрек беше фиксирано на 24 минути, а десният бъбрек беше отстранен 14 дни след IRI на левия бъбрек. Вътрешната телесна температура се контролира съответно на 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C и 38 C (n=8 за група). Вижте Фигура 1(D) за протокола на изследването.

Протокол 3: За да се наблюдава ефектът от продължителността на бъбречната исхемия върху прехода от AKI към CKD, основната телесна температура беше фиксирана на 37 C по време на исхемия и десният бъбрек беше отстранен 14 дни след IRI на левия бъбрек. Избрахме тази времева точка, защото бъбречната фиброза, която беше типичната промяна след AKI към CKD, беше много очевидна според докладите [8,10,12,15] и нашите предекспериментални резултати. Исхемичното време на левия бъбрек се контролира съответно на 21 минути, 24 минути, 27 минути и 30 минути (n=8 за група). Вижте Фигура 1(E) за протокола на изследването.

Всички мишки бяха евтаназирани на 8-та седмица след IRI на левия бъбрек. Част от тъканта на левия бъбрек се съхранява при 70°С за последващия RT-PCR и Western blot анализ, а другата част се фиксира в неутрален формалин за хистопатологичен анализ. Бяха взети кръвни проби през ретро-орбиталния синус за биохимично изследване.

Фигура 1. Протоколи на едностранно исхемично-реперфузионно увреждане (uIRI) със забавена контралатерална нефректомия. (A–C): Левият бъбрек беше подложен на IRI на ден 0, а резекцията на десния бъбрек беше извършена в различни времеви точки (ден 7, ден 10 и ден 14) с продължителността на исхемията фиксирана на 24 min с основна телесна температура, фиксирана на 37 C по време на бъбречна исхемия. (D): Левият бъбрек беше подложен на IRI на ден 0, а резекцията на десния бъбрек беше извършена при различни вътрешни телесни температури (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C и 38 C) с исхемичен времето на левия бъбрек е фиксирано на 24 минути, а десният бъбрек е отстранен 14 дни след IRI на левия бъбрек. (E): Левият бъбрек беше подложен на IRI на ден 0, а резекцията на десния бъбрек беше проведена при различна исхемична продължителност (21 минути, 24 минути, 27 минути и 30 минути) с основна телесна температура, фиксирана на 37 C по време на бъбрека исхемия, а десният бъбрек беше отстранен 14 дни след IRI на левия бъбрек. Бъбречното тегло, бъбречната функция, хистологичното увреждане на бъбреците и бъбречната фиброза бяха оценени до ден 56.

Хирургична процедура

Преди операцията всички мишки са гладували в продължение на 12 часа със свободен достъп до вода и са били инжектирани с 3% пентобарбитал натрий 50 mg/kg интраперитонеално. По време на анестезията, ректалната температура се поддържа при 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C или 38 C, съответно, в различни експериментални групи. За да се постигне това, мишката беше поставена с гръб върху нагревателна подложка (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, Китай) в позиция с изпънати глава и врат, за да се гарантира, че дихателните й пътища остават безпрепятствено и очите бяха покрити с топла физиологична марля, за да се избегне изсушаване по време на процедурата. След анестезията космите отляво на гърба на мишката бяха обръснати с машинката за подстригване. След това кожата в хирургическата зона се избърсва с тампон, напоен със 75% алкохол. Обикновено телесната температура на мишката пада след бръснене. Хирургическата процедура се извършва, когато основната телесна температура стане постоянна, което може да отнеме около 15 минути. Левият бъбрек може да се види чрез срязване на лявата гръбначна кожа на 0, 5 cm до средната линия и 0, 5 cm в долния ръб на гръдния кош на мишката. След това стиснахме левия корем с една ръка, за да извадим левия бъбрек от телесната кухина, повдигнахме бъбрека с тъпи извити щипки (като внимаваме да не повредим бъбрека), отделихме дръжката на бъбрека и го щипнахме бързо и поставихме щипката бъбрек под кожата, за да го поддържате топъл и овлажнен. Успешната исхемия се характеризира с постепенна промяна на цвета на бъбрека от червено до тъмно лилаво, което продължи съответно 21 минути, 24 минути, 27 минути и 30 минути в различни експериментални групи. Цветът на бъбреците се променя обратно на червено в рамките на 2–5 минути след освобождаване на скобата. След това затворихме коремната кухина с послойни конци. Дясната дорзална кожа и мускул бяха разрязани съответно на ден 7, ден 10 и ден 14 след uIRI в различни експериментални групи и десният бъбрек беше резециран. След това затворете раната със стандартни конци. След всяка операция, 500 lL физиологичен разтвор се инжектират интраперитонеално, за да се компенсира загубата на течност по време на операцията. В същото време мишката беше държана върху нагревателна подложка за около 2-3 часа, докато достигне пълно съзнание, преди да бъде прехвърлена в клетката на жилище. Фиктивната група не притискаше дръжката на бъбрека и останалите хирургични операции бяха същите като тези на групата с uIRI. Всички хирургични операции са извършени от едно и също лице с повече от 2 години опит в работата с този модел.

Анализ на бъбречната функция

Нивата на SCr бяха измерени чрез комплекта за креатинин (метод Jaffe, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Нивата на BUN са измерени с комплекта Urea (метод на уреаза-глутамат дехидрогеназа, Biosino Biotechnology and Science).

Анализ на теглото на бъбреците

След уриниране телесното тегло на мишките се измерва с прецизна електронна везна. Пресните бъбреци се изплакват три пъти в предварително охладен физиологичен разтвор, след което излишната вода върху бъбреците се попива с филтърна хартия. Бъбречните капсули се отлепват върху леда и бъбреците се претеглят веднага. Съотношението на теглото на бъбреците към телесното тегло се изчислява, за да се оцени коригираното тегло на бъбреците в mg/g.

Оцветяване с хематоксилин-еозин (HE) и оценка за бъбречно увреждане

Фиксирани с неутрален формалин бъбречни тъкани бяха рутинно дехидратирани, поставени в парафин, нарязани (3 lm) и оцветени с HE, за да се наблюдава увреждането на бъбречните тъкани. Десет произволно избрани полета от бъбречната кора на всяка секция бяха заснети със светлинна микроскопия при 400 увеличение. Двама патолози оценяват отделно нараняването на гломерула и бъбречните тубули. Тръбното нараняване се оценява по скала от {{20}}–4, като се използват следните критерии [17]: 0, без нараняване; 1, засягащ 1–25% от бъбречната площ; 2, засягащи 26–50% от бъбречната площ; 3, засягащ 51–75% от бъбречната площ; и 4, засягащи 75–100% от бъбречната площ. Степента на тубулно увреждане се оценява полуколичествено чрез изчисляване на площта на бъбречно тубулно увреждане. Гломерулното увреждане беше оценено и отбелязано по скала от 0–4 според процентната площ на мезангиална експанзия или склероза, като се използваха следните критерии [17]: 0, нормални гломерули; 1, 1–25% от увредената площ; 2, 26–50% от увредената площ; 3, 51–75% от увредената площ; и 4, 76–100% наранена площ. Окончателният резултат за гломерулно увреждане ¼ 0 (% гломерули от степен 0) þ 1 (% гломерули от степен 1) þ 2 (% гломерули от степен 2) þ 3 (% гломерули от степен 3) þ 4 (% гломерули от степен 4). Повече от 50 гломерула се оценяват на мишка.

Трихромно оцветяване на Masson

Фиксирани с неутрален формалин бъбречни тъкани бяха рутинно дехидратирани, поставени в парафин, нарязани (3 lm) и оцветени с трихром на Masson, за да се наблюдава бъбречна фиброза. В оцветените с трихром срезове на Masson, двадесет неприпокриващи се полета от кортекса на бъбреците са заснети при увеличение от 200. Image-Pro Plus софтуер за анализ на изображения беше използван за автоматично измерване и анализ. Процентът на фиброзната област се използва за определяне на нивото на бъбречна интерстициална фиброза [8].

RT-PCR

Общата иРНК се екстрахира от бъбречната тъкан на всяка група чрез Trizol и нейната концентрация се измерва, след което се превръща в cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). Методът на флуоресценция на Taqman (TB Green Premix Ex Taq II RT-PCR в реално време) беше използван за количествено определяне на експресиите на фибронектин (FN) и колаген I (COL-I) РНК в бъбречните тъкани. Използвани са специфични праймери за FN (напред: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 и обратно: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30 ) и COL-I (напред: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} и обратно: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (предоставено от Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай). Условията на усилване са както следва: 95 °С за 30 s, 95 °C за 5 s, 60 °C за 30 s, 40 цикъла; 95 °C за 10 s, 65 °C за 5 s и 95 °C/5 °C. След анализ на кривите на амплификация и кривите на разтворимост на продуктите, относителните нива на иРНК бяха определени чрез сравнителния CT метод (2-DDCt) с 18SrRNA (напред: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 и назад: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) като вътрешна референция.

Western blot

Буферът за лизис на радиоимунопрецитиращ анализ (RIPA) се използва за лизиране на бъбречните тъкани и концентрацията на протеин се определя чрез ВСА метода. Използва се градиентна гел електрофореза за разделяне на протеините от 50 lg проби. След това протеините се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана. След блокиране с 5% обезмаслено мляко в продължение на 2 часа, мембраните се попиват за една нощ при 4°С със заешко анти-мише моноклонално антитяло срещу a-гладкомускулен актин (a-SMA) (1:1000, No.19245, Cell Signaling Technology ), съответно FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) или COL-I (1:1000, No.72026, Cell Signaling Technology). На следващия ден мембраните се затоплят отново при стайна температура за 0, 5 часа. След промиване с TBST, мембраните се инкубират с HRP конюгиран AffiniPure кози анти-заешки IgG (H þ L) (1:1000, № BA1054, BOSTER Biological Technology) в продължение на 2 часа. След като бяха промити отново с TBST, те бяха оцветени с ултра-високо чувствителен ECL хемилуминесцентен реагент за визуализиране на имуноблотите. b-актинът се измерва на същата мембрана като вътрешната референтна стойност. Протеиновите експресии се определят чрез количествено определяне на относителните експресии на целевите протеини спрямо b-актин.

Данни и статистически анализ

Всички изследвани данни са изразени като средно ± стандартно отклонение. Сравненията между двете групи бяха достъпни чрез независим t-тест. Сравненията между множество групи бяха достъпни чрез еднопосочен ANOVA, когато разпределението на данните е нормално и дисперсията е хомогенна, Welch ANOVA беше използвана за оценка на статистическата значимост, когато дисперсията беше хетерогенна, последвано от post hoc теста на Tukey за множество сравнения. Всички статистически анализи бяха проведени от софтуера GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 се счита за статистически значимо.