Транскриптомен и липидомен профил на човешки мезенхимни стволови клетки с намалено стареене и повишена способност за диференциране на трилинейни линии при лечение с лекарства

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

АБСТРАКТ

Човешки мезенхимни стволови клетки (hMSC) са клетки с много потенциали, които се използват широко в клетъчната терапия. Въпреки това, често появяващото се стареене и намаляването на възможностите за диференциация ограничават широките приложения на MSC. Няколко стратегии като третиране с малки молекули са широко проучени и използвани за подобряване на характеристиките на стъблото чрез заобикаляне на стареенето, но точните механизми за намаляване на стареенето не са напълно проучени. В това проучване hMSCs бяха третирани с рапамицин, олтипраз, метформин и витамин С за посоченото време и тези клетки бяха подложени на оценка на стареенето и трилинейна диференциация. Освен това, наборите от транскриптомични и липидомични данни на hMSCs след лечение с лекарства бяха анализирани, за да се интерпретират биологичните пътища, отговорни за техните ефекти против стареене. Въпреки че четири лекарства показват значителна активност в насърчаването на остеогенната диференциация на MSC, метформин е оптималното лекарство за насърчаване на диференциацията на трилинейни линии. Термините на GO показват, че ефектите на лекарствата против стареене са свързани главно с клетъчно стареене, митотични и мейозни процеси. Биосинтезата на фосфатидилхолини (PC) и фосфатидилетаноламин (PE) е инхибирана, докато производството на фосфатидилинозитоли (PI) и наситени мастни киселини (SFA)/мононенаситени мастни киселини (MUFA) превръщането е активирано. Средно свободните мастни киселини (FFA) бяха увеличени в hMSC с различни фенотипове против стареене. Ето защо ние създадохме цялостен метод за оценка на лекарствената интервенция въз основа на резултатите от транскриптомиката и липидомиката. Методът може да се използва за изследване на различни биологични фенотипове при лекарствена интервенция в MSC, което ще разшири клиничното приложение на hMSCs.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

ВЪВЕДЕНИЕ

Стареенето, зависим от времето процес, ще причини физиологична дисфункция. Стареенето е основният рисков фактор за много заболявания, включително рак, невродегенеративни заболявания и диабет. Изчерпването на стволовите клетки и клетъчното стареене са едни от отличителните белези, които определят физиологичния фенотип по време на стареенето [1]. Човешките мезенхимни стволови клетки (hMSCs) са клетки с много потенциали, представени в костния мозък, мастната тъкан, плацентата, пъпната връв, мускулите и много други тъкани [2-6]. В среда, специфична за линията, hMSC могат да претърпят диференциация в адипоцити, остеобласти и хондроцити, както и други клетъчни линии in vitro. Следователно hMSCs играят важна роля в регенеративната медицина и клетъчната терапия. Въпреки това, клиничната употреба на MSC е ограничена от стареенето по време на по-продължителната култура in vitro. Стареенето на hMSCs обикновено се свързва с промяната на дължината на теломерите, клетъчната плътност, потенциала за пролиферация, потенциала за диференциация на tilineage, епигенетиката, митохондриалната функция и секретома [7]. Следователно преодоляването на стареенето на MSC изисква по-задълбочени проучвания за изследване на стратегиите за инхибиране на стареенето на hMSC. Метформин (TAME) е първото лекарство, одобрено в клинично изпитване за забавяне на стареенето [8] и също така е одобрено от FDA лекарство от първа линия за лечение на захарен диабет тип e 2 [9].цистанчСмята се, че агонизиращият път на Nrf2 е основният механизъм за метформин да медиира удължаването на живота [10]. Олтипраз, антишистозомно средство, също се използва за инхибиране на прогресията на рака по пътя на NRF2 в модел на гризачи [11, 12]. Също така се съобщава, че олтипраз проявява ефект против стареене чрез потискане на пътя на антиоксиданта NRF2 [13]. Освен това, рапамицин (сиролимус) се използва за покриване на коронарни стентове, предотвратяване на отхвърляне на трансплантиран орган и лечение на лимфангиолейомиоматоза [14]. Съобщава се, че рапамицинът може да инхибира активирането на Т клетки и В клетки чрез инхибиране на mTOR [15], което е допълнително потвърдено от влошаването на дефицита на стволови клетки [16]. Витамин С е добре известен редуктор и се съобщава, че облекчава стареенето в модела на стволови клетки със синдром на Вернер [17]. Въпреки това остава неясно дали те споделят сходни пътища, за да упражняват ролята си в борбата срещу стареенето и специфичните механизми за потискане на клетъчното стареене при хората. Освен това, транскриптомът и липидомът за тези MSC, третирани с четирите лекарства, не бяха напълно проучени, което ни накара да извършим експериментите по-долу, за да отговорим на тези важни въпроси.

Cistanche може да спре стареенето

В това проучване метформин, олтипраз, рапамицин и витамин С са използвани за лечение на hMSCs на костен мозък (BM-hMSCs). Първо, диференциационните фенотипове на hMSCs след лечението бяха характеризирани, за да илюстрират техния потенциал против стареене. Транскриптомичен и липидомичен анализ беше извършен върху третирани с лекарство клетки. След това беше извършен GO анализ, базиран на набора от данни за транскриптомика, за да се закотвят сигналните събития, отговорни за стареенето и дейностите против стареене. Бяха проведени метаболитен профил и анализ на пътя, който илюстрира флуктуация на производството на липиди по време на лечението с лекарства. Като цяло ние създадохме цялостна система за оценка на лекарствената интервенция върху стареенето на hMSC. Системата може да се използва за изследване на различни биологични фенотипове при лекарствена интервенция в MSC, което ще разшири клиничното приложение на hMSCs.

РЕЗУЛТАТИ

BM-hMSC подлежи на стареене след дълго време на култура in vitro

BM-hMSC са мултипотентни стволови клетки с общи характеристики на самообновяване и диференциация в различни типове клетки. Въпреки това, с увеличаването на пасажа in vitro, клетките постепенно са подложени на стареене и ще загубят по-голямата част от своите способности за диференциация. Състоянието на BM-hMSCs беше анализирано при различни пасажи (P2, P8, P13) и състоянието на клетката се влоши, доказано от забавянето на клетъчната пролиферация, увеличаването на смъртта и удължаването на морфологията (Фигура 1A). Освен това, способностите за диференциране на трилинея на P8 BM-hMSC също бяха тествани. Както е показано на фигура 1B, в сравнение с тези от нашите предишни проучвания [18], диференциационните способности на P8 BM- са намалели, но все още могат да се диференцират до остеобласти, адипоцити и хондроцити при индукционна среда.cistanche АвстралияСпоред in vitro модела на стареене на MSC, както е докладвано [18], ние допълнително третирахме BM-hMSC с четири кандидат-лекарства, целящи да се намесят в стареенето in vitro. Както е показано на фигура iC, клетките се поставят в 24-плака с ямки с плътност от 60 процента и лекарствата се добавят към клетките след 48 часа. Супернатантата от клетки се събира на всеки три дни седем пъти. На 21-ия ден след лекарството

(Допълнителна фигура 1A). Олтипраз, рапамицин и витамин С могат ефективно да подобрят потенциала за диференциация, който е пряко пропорционален на антагонизма на стареенето (допълнителна фигура 1В). Интересно е, че само олтипраз показва положителен ефект върху средата за диференциране на адипоцитите (допълнителна фигура 1C, 1D).ползи от Cistanche,В обобщение, олтипраз е най-доброто лекарство за подобряване на способностите за трилинейна диференциация, рапамицин и витамин С могат ефективно да подобрят потенциала за остеогенна и хондрогенна диференциация, докато метформин показва само ограничен положителен ефект върху остеогенната диференциация.

Транскриптомичен профил на третирани с лекарства BM-hMSCs Като се има предвид, че и четирите лекарства могат да противодействат на стареенето на BM-hMSCs с различна ефективност, след това се опитахме да проучим основните механизми за техния различен ефект чрез изследване на транскриптомичния профил на BM-hMSCs при лечение с лекарства . Ние изчислихме кратната промяна на генната експресия между всяка двойка лекарство-контрол съответно. За всяка двойка лекарство-контрол бяха избрани диференциално експресираните гени (DEG) с промяна на гънките над 2, които съдържат както регулиращи нагоре, така и регулиращи надолу гени (допълнителна таблица 1). Получихме общо 1758 гена след анализиране на всички DEG от BM-hMSCs, третирани с лекарства (Фигура 3A). За да изследваме функциите на DEG, ние идентифицираме термините на обогатената генна онтология (GO) ("p<0.01) based="" on="" each="" drug's="" degs="" [19](supplementary="" table="" 2).="" these="" enriched="" go="" terms="" represent="" the="" functions="" influenced="" by="" the="" drugs.="" furthermore,="" we="" plot="" the="" venn="" diagram="" to="" study="" the="" similarity="" and="" specificity="" of="" the="" enriched="" go="" terms.="" as="" shown="" in="" figure="" 3b,="" although="" each="" drug="" has="" its="" unique="" regulated="" go="" terms,="" the="" drugs="" also="" share="" a="" common="" go="" which="" suggests="" that="" there="" are="" common="" functions="" influenced="" by="" all="" four="" drugs.="" these="" common="" go="" terms="" may="" associate="" with="" the="" effects="" of="" the="" drug="" on="" senescence="" alleviation="" and="" trilineage="" differentiation="">

Дванадесет общи GO термина бяха споделени от четири лекарства (Фигура 3B, 3D), от които основно обогатени в отрицателната регулация на клетъчната подвижност (Фигура 3E), положителна регулация на организацията на структурата на актомиозина, регулация на клетъчния процес и организация на клетъчните компоненти, организация на цитоскелета , макромолекулен катаболитен процес, регулиране на клетъчната пролиферация, протеинов катаболитен процес и малка GTPase медиирана сигнална трансдукция (Фигура 3C, 3E). Тези функции са тясно свързани с клетъчната съдба, особено свързаните със стареенето фенотипове.

След като анализирахме общите GO термини между метформин и олтипраз, открихме, че те споделят същата функция като агонистите на NRF2. Както е показано на Фигура 3F, функцията на клетъчния цикъл, катаболичния процес на макромолекулите и организацията на ядрената обвивка са регулирани нагоре. Освен това, функцията за движение на компоненти, клетъчна миграция/адхезия и реакция към витамин Е/органично циклично съединение/липид беше регулирана надолу (Фигура 3G). Тези резултати като цяло показват, че метформин и олтипраз могат да повлияят на способността за клетъчна диференциация, клетъчната съдба и клетъчния метаболизъм. Тъй като олтипраз е най-доброто лекарство за подобряване на способностите за трилинейна диференциация, ние допълнително се опитахме да идентифицираме специфичните пътища, променени от олтипраз. Интересно е, че обогатените 85 GO термини са свързани главно с клетъчно стареене, клетъчен цикъл, митотичен и мейозен процес, клетъчен отговор на лекарства, витамин, cAMP, стимул за увреждане на ДНК, хранителен и осмотичен стрес (допълнителна фигура 2A, 2B). Липидомичен профил на третирани с лекарства BM-hMSCs За да се изследва глобалната флуктуация на липидите по отношение на остеогенната диференциация на BM-hMSCs при лечение с лекарства, беше проведен LC-MS-базиран липидомичен профилиращ анализ. Общо 139 липидни вида бяха идентифицирани в клетъчния липидом, включително лизофосфатидилетаноламини (LPE), 21 PE, 4 PE-Os, 4 фосфатидилинозитола (PI), 5 фосфатидилсерина (PS), 8 керамида (Cer), 4 Cerys, 11 сфингомиелина (SM), 6 диацилглицерида (DG), 18 триацилглицерида ( TG) и 20 свободни мастни киселини (FFA) (Фигура 4A-4M). Според клъстеризиращата материя, клетките, третирани с олтипраз, показват най-големите вариации на липидите, което е в съгласие с най-добрия му ефект върху облекчаването на клетъчното стареене и подобряването на диференциацията на трилинейните линии. По-подробно, LPCs на монофосфатидилглицероли бяха повишени в групата на лечение с олтипраз в сравнение с контролата, докато техните аналогове PCs и PEs бяха регулирани надолу (Фигура 4B, 4D, 4E). Нивата на PIs и SFAs също са повишени, докато нивото на Ceres и MUFAs е намалено (Фигура 4F, 4L, 4H, 4M). Тези резултати

Анализ на пътя, базиран на липидомика и транскриптомика, в лекувани с лекарства hMSCs

За по-нататъшно изследване на основните механизми за подобряване на трилинейната диференциация от олтипраз беше извършен анализ на пътя въз основа на липидомните и транскриптомните набори от данни. Както е показано на Фигура 5А, CDP-диацилглицерол синтаза 1 (CDS1) е единственият ензим, регулиран нагоре в клетки, третирани с олтипраз, което може да е причината за повишаване на PI и намаляване на PC. Въпреки това, регулираната надолу лецитин холестерол ацилтрансфераза (LCAT) и непроменената лизофосфатидилхолин ацилтрансфераза3 (LPCAT3) са несъвместими с повишените LPCs, което предполага, че прекомерно произведените LPCs може да не се синтезират от PCs/Pes (Фигура 5A). Интересно е, че може да се наблюдава очевидно преобразуване между SFAs и MUFAs (Фигура 5B). Увеличаването на наситените мастни киселини (SFA) и намаляването на MUFAs може да е резултат от регулираната надолу стеароил-CoA десатураза (SCD). Това оформление има тенденция да разкрие механизма за намалената активност на липогенезата след лечение с олтипраз. Въпреки че лечението с олтипраз може да намали производството на Ceres, преобразуванията, медиирани от Cars, не са значително променени (Фигура 5C).

Глобални профили на липидни видове в супернатанта на hMSCs при лечение с лекарства

Освен това, липидомичните промени в средата бяха характеризирани, за да се проучи задълбочено влиянието на лекарствата върху hMSCs. Както е показано в допълнителна таблица 3, клъстерният анализ показа, че липидите са класифицирани в два клъстера, т.е. по-голямата част от FFA и други липиди (не-FFA).цистанчен холестеролКакто е показано на Фигура 6, в четири групи FFAs показват очевидни промени при различни периоди на лечение. За разлика от това, не-FFA показват леки колебания в четири групи (Фигура 6A-6D). FFA са значително повишени в ранните етапи във всички групи (Фигура 6E-6H).Cistanche deserticola странични ефектиОсвен това, FFAs в клетките, индуцирани от метформин (Фигура 6E), олтипраз и лечение с витамин С, бързо се увеличават от 2-ра времева точка до 3-та времева точка. Въпреки това, в клетките, третирани с рапамицин, FFAs бяха повишени от списъка до 2-ра времева точка (Фигура 6F-6H). Интересното е, че FFA в клетките, третирани с метформин, показват по-голям спад, отколкото в другите три групи (Фигура 6E). След това могат да се наблюдават леки повишения на FFA в групата на лечение с олтипраз и витамин С, докато от 4-та до 5-та времева точка FFAs показват лек спад в групата на лечение с метформин (Фигура 6E, 6F, 6H).

В клетките, третирани с рапамицин, нивата на FFA се поддържат основно от 3-та до 5-та времева точка. По-конкретно, както е показано на допълнителна фигура 3 и допълнителна таблица 4, моделите на промяна на FFA могат да бъдат допълнително класифицирани в 8 групи. Там клъстер 6, състоящ се главно от SFAs, показва същото оформление като тези, показани в групата с олтипраз и витамин С, докато клъстер I е основно същият като групата с рапамицин. Като цяло средните FFA във всички групи, с изключение на метформин, са глобално повишени заедно с индукцията, което предполага връзката между FFA във вътрешната културна среда и клетъчното стареене. Клетките, индуцирани от метформин и витамин С, допринесоха за подобно влияние върху SFAs във вътрешната среда в сравнение с индукцията на рапамицин (Фигура 6A, 6D, 6E, 6H).

Общата стратегия за изследване на ефектите против стареене на лекарствата в hMSCs

За да обобщим, както е показано на Фигура 7, за характеризиране на ефектите против стареене на четири лекарства в hMSCs, беше проведено систематично проучване въз основа на семинара, състоящ се от характеризиране на фенотипа, транскриптомика, клетъчна липидомика и анализ на средна липидомика. Олтипраз облекчава стареенето и подобрява ефективността на диференциация на трилинейни линии чрез насърчаване на производството на PIs, инхибиране на биосинтезата на PCs/PEs и блокира превръщането от SFA в MUFA. GO термините също така илюстрират фенотипа, свързан с клетъчното стареене, митотичния и мейозния процес, клетъчния отговор на стимула за увреждане на ДНК, амониевите йони и нивата на кислород. Интересното е, че пътят на NRF2 се регулира както от олтипраз, така и от метформин, за да се насърчи клетъчната диференциация в различна степен. Междувременно оформлението на средната липидомика демонстрира критичните роли на средните FFA в диференциацията на MSC в множество типове клетки. Следователно, многоизмерната стратегия предоставя множество перспективи за тълкуване на различни ефекти от лекарствената интервенция върху стареенето на hMSCs. Този метод може да се използва за изследване на различни биологични фенотипове при лекарствена интервенция в MSC, което ще разшири клиничното приложение на hMSCs.

ДИСКУСИЯ

Новата коронавирусна болест 2019 (COVID-19) се превърна в глобална извънредна ситуация за общественото здраве. Понастоящем няма специфични лекарства за защита на пациентите от имуномодулиращи ефекти. Беше съобщено, че прилагането на MSC при тежки случаи на COVID-19 подобрява изхода на пациентите чрез регулиране на възпалителния отговор на тялото и насърчаване на възстановяването и регенерацията на белодробната тъкан [20]. Въпреки това, често появяващото се стареене на hMSCs по време на по-продължителна култура in vitro възпрепятства клиничното приложение на hMSCs. В това проучване ние установяваме in vitro система за скрининг на лекарства, базирана на фенотипа на стареене на BM-hMSC [21]. Много проучвания провеждат свързани със стареенето интервенционни изследвания за hMSCs въз основа на манипулиране на TF [22-27] и прилагане на различни лекарства [10. 13,17,28,29]. Въпреки това, ние сме първите, които задълбочено оценяват ефекта против стареене на различни лекарства върху BM-hMSCs от гледна точка на активността на SA- -gal и ефективността на диференциация. Рапамицин, олтипраз, метформин и витамин С са четирите традиционни лекарства, използвани за първи път за интервенция на стареенето на hMSC. Въпреки че и четирите лекарства противодействат на стареенето на BM-MSC, точните ефекти и основният механизъм на четирите лекарства за насърчаване на клетъчната диференциация са различни. По-важното е, че ние също установяваме цялостна система за оценка на лекарствената интервенция чрез интегриран анализ на транскриптомични и липидомични профили в клетъчни супернатанти и лизати. Подробно, транскриптомичните данни бяха напълно анализирани в комбинация с фенотипа на стволовите клетки след лечение с лекарства, за да се изследват променения път и основните механизми, повлияни от лечението с лекарства. Освен това, моделът на промяна на липидите на клетки, третирани с различни лекарства в различни моменти от време, се определя чрез LC-MS. Освен това, чрез интегриране на данните от транскриптомиката и липидната метабономия, специфичните за лекарството метаболитни пътища и свързаните с лекарството липидни промени бяха анализирани и обобщени.

Oltipraz е най-доброто лекарство за подобряване на диференциационните способности на BM-hMSCs сред четири лекарства. DEG, повлияни от лечението с олтипраз, са основно обогатени в клетъчно стареене, клетъчен цикъл и клетъчен отговор към лекарства, cAMP и т.н. Тези промени играят критична роля в клетъчното стареене Въпреки това, олтипраз и метформин, инхибиторите на пътя на Nrf2, повлияха на общите регулаторни пътища [30], които основно обогатиха способностите за клетъчна диференциация, клетъчната съдба и клетъчния метаболизъм. Като инхибитор на пътя на mTOR, рапамицинът може да предотврати клетъчното стареене [31, 32] Последователно, ние също открихме, че рапамицинът играе най-добрата роля в насърчаването на остеогенната диференциация, която главно чрез регулиране на пътя на метаболитния процес на фосфатно съединение, организацията на клетъчните компоненти, клетъчна комуникация, сигнална трансдукция, макромолекулен биосинтетичен процес, клетъчен протеинов метаболитен процес и развитие на скелетната система. Витамин С е добре известен редуктор и играе най-добрата роля в насърчаването на клетъчната пролиферация в сравнение с другите три лекарства, но няма значителен ефект при подобряването на способностите за трилинейна диференциация на MSC. Тези фенотипове могат да бъдат причинени от отговора на цитокин/липид/оксидативен стрес и положителна регулация на каталитичната активност (допълнителна фигура 4).

Доказано е, че липидите играят незаменима роля в диференциацията на стволовите клетки [33]. По-рано открихме, че увеличенията на мембранните глицерофосфолипиди, включително PCs и PEs, отличителен белег на стареенето, са наблюдавани в световен мащаб при възрастните MSC [18]. В настоящото проучване, намаленията на PCs и PEs са наблюдавани в клетките, третирани с олтипраз, които се представят най-добре при забавяне на стареенето на MSCs PCs и PEs са липидите с най-голямо изобилие в конструкцията на еукариотните мембрани 34]. Повишените нива на PCs и PEs в серума са показани при възрастни хора в сравнение с по-млади индивиди [34]. Интересното е, че PI са малцинствените GPL, намалени в старите MSC в нашите предишни наблюдения. В това проучване PIs са драматично повишени във всички индуцирани клетки. Механично, анализът на пътя предполага, че увеличенията на PIs могат да бъдат свързани с активирания CDS1. Доказано е, че CDS1 киназата участва в регулирането на сигнализирането на ROS и допълнително влияе върху експресията на гени, които функционират в оксидативна резистентност [35]. Друг значително блокиран метаболитен поток е превръщането от SFA в MUFA, медиирано от SCD. Като биобарометър на липогенезата, активираните SFA/MUFA са наблюдавани при редица заболявания като рак и неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD)[36,37]. Подобни резултати се наблюдават и при възрастни мишки, което отразява анормалния метаболизъм на липиди в черния дроб по време на стареене [38]. Като цяло нашата стратегия може да се използва при скрининг на лекарства против стареене и изследване на молекулярни механизми след лечение с лекарства в стволови клетки и рак. Като комбинираме стратегията със системата за оценка, можем да извършваме мониторинг в реално време въз основа на свързания със стареенето статус на стволовите клетки, за да открием нови лекарства, които ще се използват в терапиите със стволови клетки.

Тази статия е извлечена от www.aging-us.com