Подобряване на протеомиката отгоре надолу на мозъчната тъкан с FAIMS, част 2

Анализ на данни

Идентификацията на протеоформа беше извършена с TopPIC версия 1.3.53. Настройките за TopPIC включваха прекурсорен прозорец от 3 m/z (за отчитане на изотопната обвивка), допустима грешка на масата от 15 ppm, максимално/минимално неизвестно изместване на масата от 500 Da и максимална брой разрешени неизвестни модификации от 1.

През последните години все повече и повече проучвания показват, че има тясна връзка между морфологията на протеина и паметта. Протеините са най-основните молекули в жизнените дейности. Те могат да контролират жизнените дейности на клетките и да поддържат нормалното функциониране на човешкото тяло. Проучванията са установили, че морфологията на протеините не само играе важна роля в жизнените дейности на клетките, но също така има неразривна връзка с функцията на паметта в мозъка. След като морфологията на протеините се промени, това ще повлияе на връзката между невроните, като по този начин ще се отрази на паметта на хората.

В ранните етапи от живота промените в морфологията на протеините играят жизненоважна роля в развитието и функционирането на мозъка. Ако морфологията на протеините не е такава, каквато трябва да бъде, това ще причини поредица от неврологични проблеми, което в крайна сметка ще доведе до загуба на паметта, когнитивно увреждане и т.н.

Въпреки това, няма място за притеснение. Съвременната медицинска технология позволява на хората да коригират морфологията на протеините чрез диета, за да подобрят паметта си. Богатата и разнообразна диета е богата на протеини, но когато избирате протеини, опитайте се да изберете храни с ниско съдържание на мазнини, холестерол и въглехидрати, за да избегнете неблагоприятните ефекти от прекомерния прием върху тялото.

Накратко, протеиновата морфология и паметта са неразделни. Трябва да обърнем внимание на здравословната диета и балансирания прием на протеини, за да поддържаме добро здраве, като същевременно поддържаме добра памет. Може да се види, че трябва да подобрим паметта и Cistanche може значително да подобри паметта, тъй като има антиоксидантни, противовъзпалителни и анти-стареещи ефекти, които могат да помогнат за намаляване на окисляването и възпалителните реакции в мозъка, като по този начин предпазват здравето на нервна система. В допълнение, Cistanche може също така да насърчи растежа и възстановяването на нервните клетки, като по този начин подобрява свързаността и функцията на невронните мрежи. Тези ефекти могат да помогнат за подобряване на паметта, способността за учене и скоростта на мислене, а също така могат да предотвратят появата на когнитивна дисфункция и невродегенеративни заболявания.

Кликнете върху Know, за да подобрите краткосрочната памет

MS2 спектрите бяха търсени в база данни, свързана с записи от Homo sapiens Swiss-Prot (20 352), Swiss-Prot splicevariants (22, 000) и TrEMBL (54 436), както и общи замърсители. Идентифицираните протеоформи бяха филтрирани до степен на фалшиво откриване (FDR) от 1% чрез TopPIC.

Анализът на данните надолу по веригата беше извършен в R среда за статистически изчисления и генериране на цифри.54 При анализ надолу по веригата, протеоформи от същия ген със същите начални и крайни аминокиселини, за които беше установено, че са в рамките на ±5 Da, бяха комбинирани като единична протеоформа, за да се увеличи строгостта от нашите задачи.

Въпреки че прагът от 5 Da е произволен, този подход компенсира неправилно определени моноизотопни пикове, неяснота в неизвестни масови смени и други изкуствени отклонения. За да определим относителното стандартно отклонение (RSD) на протеоформите в репликите, ние използвахме изхода "интензитет на характеристиките" от TopPIC.

Картите на покритие на последователността на фрагментиране и свързаните с тях спектри бяха генерирани с помощта на софтуера LCMsSpectator.55

Специфичните настройки за LCMsSpectator включват толеранс на прекурсорни йони от 10 ppm, производствен толеранс от 10 ppm, минимален праг на S/N от 1,5, корелационен праг на Pearson от 0,7, изглаждане по подразбиране от 9 точки, и относителен праг на интензитета на прекурсорния изотоп от 0,1.

РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

Добавянето на FAIMS значително увеличава протеомното покритие

Тъканната проба от мозъчна кора на пациент, диагностициран с Алцхаймер, беше обработена в съответствие с работния процес, както е показано на Фигура 1. Първо се опитахме да анализираме ефективността на FAIMS върху различни CV в сравнение с тези без FAIMS (наричани „Без FAIMS“).

Струва си да се помни, че интерфейсът FAIMS създава умерена загуба на предаване на йони, вероятно поради по-дългия йонен път през източника.56 Следователно, за да се представят по-добре типичните условия и да се осигурят справедливи сравнения, данните „Без FAIMS“ бяха събрани с помощта на същата проба без модулът FAIMS е инсталиран.

Тези данни „Без FAIMS“ бяха събрани в три екземпляра и анализирани в съответствие с работния процес, както е показано на Фигура 1 с топ 6 DDA MS2 анализа. Наборите от данни „Без FAIMS“ идентифицираха средно 754 ± 35 протеоформи (Фигура 2A и Таблица S1) и колективно идентифицира 1073 уникални (не-излишни) протеоформи (Фигура 2B), получени от 293 уникални гена (Фигура 2C), покриващи 29 359 аминокиселини в протеома (Фигура 2D).

Метриката "протеомно покритие" (Фигура 2D) се определя като нередундантни аминокиселини, покрити от последователността на всяка протеоформа. По същество този показател отчита както дължината, така и разнообразието на идентифицираните протеоформи.

Считаме, че това е по-балансиран показател в сравнение със суровия брой протеоформи и гени, тъй като избягва пристрастия към по-малки протеоформи. Въпреки че простото преброяване на протеоформи или гени е интуитивно, тези показатели изглежда са силно повлияни от къси протеолитични фрагменти. FAIMS наборите от данни бяха събрани от -50 до -20 CV, сканирани на стъпки от 5 V.

Всяка от получените 7 автобиографии беше събрана в три екземпляра. По отношение на протеоформи и гени, FAIMS превъзхожда "Без FAIMS" за всички CV, тествани в рамките на -50 до -30 CV диапазон (Фигура 2A-C).

Например, трите набора от данни при -50 CV идентифицират 1833 ± 17 протеоформи, средно увеличение от ~140% на цикъл в сравнение с "Без FAIMS". Взети заедно, тези три набора от данни при -50 CV идентифицират 2564 уникални протеоформи от 530 уникални гена, покриващи общо 43 437 аминокиселини, съответно увеличение от 95, 69 и 69% спрямо трите набора от данни "NoFAIMS" (Фигура 2B–D и таблица S1).

Освен това, въпреки че FAIMS при −25V наблюдава по-малко уникални протеоформи и гени в сравнение с „Без FAIMS“, самите протеоформи са средно много по-дълги. По този начин, когато се разглежда дължината на протеоформата (Фигура 2D), наборите от данни от −25 V покриват почти толкова много аминокиселини от протеома (28 398) в сравнение с „Без FAIMS“ (29 359), като го правят само с наполовина по-малко протеоформи (Фигура 2B ).

Ние също така проучихме дали FAIMS може да осигури толкова стабилен и възпроизводим анализ в сравнение с без FAIMS. Ние оценихме възпроизводимостта на количественото определяне чрез изчисляване на RSD (еквивалент на коефициента на вариация) на интензитета на характеристиките на всяка протеоформа, при условие че протеоформата отговаря на критерия да бъде наблюдавана във всичките три репликирани набора от данни за всяка настройка на CV.

Тъй като наборите от данни FAIMS и „Без FAIMS“ са събрани от една единствена биологична проба, вариацията между повторенията трябва да се дължи изключително на инструментални фактори.

Графикът във Фигура 3 (както и индивидуалните хистограми на Фигура S1) демонстрира как разпределенията на RSD се сравняват между наборите от данни FAIMS и „Без FAIMS“.

Въз основа на средния RSD, добавянето на FAIMS доведе до подобно или леко подобрено качество на количественото определяне спрямо „Без FAIMS“. Подобряването на RSDs сред по-ниските напрежения (-20 до -30 CV) може да бъде свързано с наблюдението, че по-малко протеоформи се предават в този диапазон, осигурявайки по-висококачествени MS1 спектри и следователно по-добри оценки на интензитета на характеристиките.

Освен това си струва да се отбележи, че RSDs, определени от тези реплики, са подобни на предишни експерименти отгоре надолу55 и отдолу нагоре57,58, извършени с подобни инструменти.

Взети заедно, тези данни показват, че добавянето на FAIMS към TDP значително увеличава идентификациите на протеоформи, без каквато и да е жертва на качеството на количественото определяне.

След това проучихме припокриването в идентификациите между автобиографиите, което може да осигури най-големия неизлишен набор от наблюдения.

Използвайки коефициенти на припокриване, определени като пресечната точка между два набора, разделена на по-малкия от двата набора, ние определихме приликата между всеки набор от данни. Общият среден коефициент на припокриване за двете протеоформи и генни идентификации в рамките на всяка FAIMS CV беше 0.76.

Това е сравнимо с коефициента на припокриване от набори от данни „Без FAIMS“ (0.77), което предполага, че техническите реплики показват подобна възпроизводимост. Топлинна карта, показваща коефициентите на припокриване на FAIMS на протеоформи и гени, е показана съответно на фигури 4 и S2.

Трябва да се отбележи, че припокриването на генни идентификации в CV пространството е много по-голямо спрямо протеоформите, въпреки че е особено забележимо при сравняване на най-дългите CV разстояния.

Например, припокриването между −50 и −20 CV е 0,64 на ниво ген и 0,06 на ниво протеоформа. Това се очакваше, тъй като всеки ген може потенциално да бъде представен от множество протеоформи.

Фигура 4 показва, че докато 5−10 V разлика в CV произвежда коефициенти на припокриване предимно над 0,5, разстояния, по-големи от 15 V, произвеждат по-големи степени на несходство и следователно са по-добре разпределени за улавяне на достатъчно различни набори от протеоформи.

С тези набори от данни, ние следвахме да определим кои комбинации от CV са оптимални за постигане на максимални генни идентификации, идентификации на протеоформи и покритие на последователността с ограничения върху броя на CV за всяка комбинация.

Първо, ние установихме оптималните комбинации за произволен брой CV от 1 до 7, използвайки показателите за уникални протеоформи, гени и покритие на протеомна последователност (Фигура 5).

Използвайки комбинации, ограничени до три CV като пример, Фигура 5A, B описва как -35, -40 и -50 V са идеални, ако човек желае да увеличи максимално броя на протеоформите или гените.

Протеоформите и гените, идентифицирани в тези три автобиографии (девет набора от данни), покриват 84% от общите уникални протеоформи и 92% от общите гени в целия набор от 21 набора от данни.

Когато се претегля дължината на протеоформа с покритие на последователността като метрика, идеалната комбинация е -30, -40 и -50 CV, покриваща 88% от уникалните аминокиселини от всичките 21 набора от данни на FAIMS само със скромна загуба на идентификация на протеоформа и ген ( 4221 протеоформи и 723 гена, Фигура 5C). Въпреки това, тези комбинации включват всички реплики и представляват максималните идентификации, които могат да бъдат постигнати за дадена комбинация от CV. Ето защо, за да демонстрираме предимството на външното стъпало на CV, ние решихме да проучим какви числа биха могли разумно да бъдат постигнати средно само с три изпълнения, като всяко изпълнение е различно CV.

Използвайки -50, -40 и -30 V набори от данни като пример, ние определихме средните уникални протеоформи, уникални гени и покрития на протеомна последователност въз основа на 27-те уникални комбинации от трите различни реплики във всяка CV.

Въз основа на този анализ бихме могли да постигнем 2986 (±46) уникални протеоформи и 618 (±12) уникални гена, покриващи средно 64 534 (±1089) аминокиселини. В сравнение с наборите от три екземпляра от данни „Без FAIMS“, които идентифицират 1073 уникални протеоформи и 293 уникални гена, покриващи 29 359 аминокиселини, външната CV стъпка при −50, −40 и −30 V може повече от да удвои всеки показател.

Независимо от това, оптималната комбинация от CV вероятно също ще зависи от организма и тъканта, от които е получена пробата, приложените стъпки за подготовка на пробата, както и всяко допълнително офлайн фракциониране, приложено преди LC-MS анализ.

Като цяло, когато се вземат заедно с анализа на припокриването (Фигура 4), предполагат, че 15 V или по-големи разстояния между CVs осигуряват най-малко количество припокриване между протеоформите, докато 5-10 V разделяне в рамките на -50 до -30 CV максимизира гените, протеоформите и протеома покритие на последователността.

За по-нататъшно определяне на въздействието на FAIMS върху дълбочината на покритие на протеома, ние сравнихме гените, идентифицирани от нашите набори от данни отгоре надолу, с типичен анализ отдолу нагоре на човешкия мозък.

Изчерпателни набори от данни отдолу нагоре за човешка мозъчна тъкан ни позволиха да оценим изобилието за 8528 протеини, използвайки претеглено спектрално броене. 59–61 Протеините бяха групирани в 10 различни процентила на изобилие въз основа на спектрални преброявания, събрани от няколко набора от данни отдолу нагоре на човешкия мозък.

Чрез кръстосано препращане с нашите набори от данни отгоре надолу, успяхме да определим откъде произлизат гените и протеоформите и да ги класираме по отношение на очакваното изобилие на протеини (използвайки нормализирани спектрални брои на набор от данни) в човешкия мозък (Фигура 6).

Гени, които бяха открити в рамките на нашия анализ отгоре надолу, но не и референтният набор отдолу нагоре, бяха групирани като "NA".

For more information:1950477648nn@gmail.com