Лечение на камъни в бъбреците: G. Fruticosus
Mar 22, 2022
Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
ЧАСТ Ⅰ: Оценки на лечебната ефикасност на екстракти от разтворител на G. fruticosus при експериментално индуцирана нефролитиаза Wistar мъжки плъхове
Tilahun Alelign, Tesfaye Sisay Tessema, Asfaw Debella и Beyene Petros
Заден план
Уролитиаза(камънив пикочните пътища) засяга около 12 процента от световното население на някакъв етап от живота им [1]. Други проучвания съобщават, че световното разпространение накамъни в бъбрецитеварира между 2 до 20 процента [2, 3]. Уролитиазата засяга всички възрасти, полове и раси [4,5], но се среща по-често при мъжете, отколкото при жените на възраст между 20 и 49 години [6]. Патогенезата накамъни в бъбрецитеостава ненапълно разбран [7] и лечението му остава предизвикателство, въпреки че има съвременни модалности на лечение, включително ESWL[8]. Последователността от събития, които задействаткамъкобразуването включва нуклеация, растеж, агрегация и задържане на кристали в бъбреците [9, 10].
Бъбречни камъниобразуването изисква постоянно задържане на кристали вбъбрецислед завършване на процеса на кристализация[11, 12]. Взаимодействието на COM кристали с повърхността на бъбречните епителни клетки е критично иницииращо събитие при нефролитиаза [13]. Взаимодействията между кристалните клетки водят до движение на кристалите от базолатералната страна на клетките към базалната мембрана [14]. Проучване върху животински модели също разкрива, че прилагането на високи концентрации на CaOx кристали или оксалатни йони изглежда е токсично, причинявайки увреждане на бъбречните тубулни клетки [7]. Излагането на по-високи нива на оксалат или CaOx кристали предизвиква увреждане на епителните клетки, което е предразполагащ фактор за последващокамъкобразуване [15, 16].
Дисбаланс междупикоченкамъкинхибитори и промотори се предполага, че причината закамъкобразуване [17]. Организаторите улесняваткамък[18], но инхибиторите намаляват инициирането на свръхнасищане, нуклеация, растеж на кристали и скорост на агрегация [17]. Въпреки това, инхибиторите действат еднакво за всички; следователно някои хора образуват камъни; докато други не [19]. Сред повтарящи секамъкпредишните, екскрецията на оксалат в урината е по-висока, докато екскрецията на цитрат е по-ниска. Проучване също така показва, че оксалатът може да улесни реабсорбцията на хлорид, натрий и вода в проксималните тубули и да активира множество сигнални пътища в бъбречните епителни клетки [20].
Въпреки значителните подобрения в медицинската терапия като полезността на екстракорпоралната литотрипсия с ударна вълна (ESWL), няма задоволително лекарство за лечение на бъбречни камъни [21]. Лечението с ESWL е свързано с остро бъбречно увреждане поради травматичния ефект на ударната вълна и инфекции след лечението [22]. Това също води до непълнакамъкклирънс, и не може да избегне новкамъкобразувания [23], иликамъкрецидиви често до 60 процента [24,25]. След първия епизод на aкамък, процентът на рецидиви е повече от 50 процента в рамките на 10-години [26,27]. Следователно,камък в бъбрекарецидивът е основен риск, който се счита за нерешено клинично предизвикателство в областта на урологията [28].камъкформиращите пациенти са склонни към рецидиви след първата хирургична терапия [29]. Въпреки че химическият състав на aкамъквлияят върху избора на интервенция [30], отворената хирургия остава основното лечение [31]. Някои изследвани досега лечебни растения срещу уролитиаза са посочени в таблица 1
В Етиопия повечето пациенти разчитат на традиционни лечебни растения като алтернативна терапия за различни заболявания, включително уролитиаза. Лечебните растения са достъпни, достъпни, ефективни, с по-малко странични ефекти и са по-добре съвместими с човешкото тяло [41] в сравнение с конвенционалните лекарства [42]. В настоящото изследване,G. fruticosus(L.) бяха избрани, за да се изследват техните ефекти върху експериментално индуцирана уролитиаза. Извършено е задълбочено проучване на литературата, за да се установи, че никоя от избраните части на лечебното растение не е проучена досега за анти-уролитиатични дейности. Към днешна дата също така няма достатъчно научни доказателства за антихеролитичната активност на това лечебно растение. Следователно, целта на изследването е да се оцени лечебната ефикасност на лечебните растения при експериментално предизвикана нефролитиаза при мъжки плъхове.
Таблица 1 Лечебни растения, притежаващи анти-уролитиатични ефекти в предишни проучвания
Материали и методи
Идентификация и събиране на лекарствен растителен материалГомфокарпусfruticosus(G. fruticosus) листата са събрани по време на цъфтежа или плододаването. TheG.fruticosus(L)Ait.f, известен като Tifriena (местно име), е събран в Bole Bulbula около "93 Мазория" Адис Абеба през октомври 2018 г.G. fruticosusL.Ait.f(Asclepiadaceae) (съобщено от ключов информатор) се твърди за лечение на уролитиаза. Растителните екземпляри бяха предадени на Националния хербариум, Департамент по растителна биология и управление на биоразнообразието, Университета в Адис Абеба (AAU) за таксономично удостоверяване (TA238) и беше даден съответният номер на колекцията. Образците бяха депозирани в Националния хербариум на AAU за бъдещи справки.
Приготвяне на суровия екстракт
Растителните материали бяха почистени старателно с чешмяна вода за отстраняване на замърсителите и изсушени в навес при стайна температура от 2 до 3 седмици в лабораторията за биомедицински науки, AAU. Изсушените растителни части бяха фино прахообразни с помощта на кухненска мелничка (хаванче и пестик, с размер около 9 инча в диаметър). Праховете се прекарват през сито с размери на отворите 3, така че да се филтрира грубо твърдо вещество.
Екстрактите са приготвени по процедура, подобна на тази, често използвана от традиционните лечители или пациенти, с някои незначителни модификации. Растителните прахове се накисват в дестилирана вода, която се поставя върху шейкър за 72 часа. Сместа се филтрува през памук/марля, след това през филтърна хартия Whatman номер 1 (размер на порите: 1l μm） за отстраняване на фини твърди растителни частици или неразтворими съставки. Целите екстракти се концентрират до сухо с помощта на машина за лиофилизиране чрез отстраняване на дестилираната вода при понижено налягане След това полутвърдите концентрати се изсипват в стъклени петри-плаки и се оставят да изсъхнат напълно във водна баня, регулирана на 45 градуса. Крайните изсушени екстракти се събират и съхраняват в етикетирани стерилни бутилки, покрити с плътна запушалка и държани в фризера на -20 градуса, докато се използва в експериментите.
Приготвяне на последователни екстракции с разтворител
Gomphocarpus fruticosusосновният екстракт (воден) се разделя с разтворители с нарастваща полярност от неполярни към полярни разтворители, като се гарантира, че по-широк обхват на полярността на съединенията може да бъде извлечен. Последователната екстракция беше последователно започната с петролев етер, последван от хлороформ, етил ацетат, бутанол и вода, в които тези разтворители бяха отстранени и концентрирани под ротационен вакуум изпарител. Растителните материали, мацерирани в дестилирана вода, се лиофилизират в сушилня за замразяване, за да се получат прахообразните остатъци. Изсушените екстракти се затварят плътно със запушалка и се съхраняват в стъклени бутилки и се съхраняват в хладилник при -20 градуса C, докато се използват за експеримента.
Cistanche deserticola полза: лекува бъбречно заболяване
Химикали и реактиви/стандартни лекарства
Използваните химикали и реагенти или комплекти са с аналитичен клас, закупени от различни източници. Доставянето на петролев етер, хлороформ, етил ацетат, бутанол и етанол беше от Wisteam PLC (Адис Абеба, Етиопия), калиев дихидроген фосфат (безводен), натриев фосфат (двуосновен безводен екстра чист), Tris-HCl буфер (CaHuNO) и натриев хлорид (NaCl) са закупени от Micron International Trading House PLC (Адис Абеба, Етиопия). По същия начин, изофлуран и формалдехид са закупени от Neway Chemicals PLC (Адис Абеба, Етиопия). Етилен гликол (EG) и амониев хлорид (NH, Cl) са закупени от Pharma PLC (Адис Абеба, Етиопия). Епруветки с EDTA, епруветки за разделяне на серума, капилярни епруветки и хирургически остриета бяха закупени от Micro Pharma PLC (Адис Абеба, Етиопия). Освен това комплекти за чернодробни и бъбречни функционални тестове бяха закупени от Roshi PLC (Лондон, Англия). Комплектите за колориметричен анализ на оксалат (оксалова киселина) и колориметричен/флуорометричен анализ на цитрат, закупени от комплекти BioVision Incorporated, бяха (Milpitas, САЩ). Калиев цитрат на прах беше получен от рефералната болница Black Lion (Адис Абеба, Етиопия). Cystone (полихербална формулировка) беше закупен от Mumbi, Индия. Аскорбинова киселина, която е закупена от Micron International Trading House PLC (Адис Абеба, Етиопия).
Разтваряне на растителния екстракт и стандартните лекарства Тестваните екстракти/лекарства с различни концентрации се разтварят с помощта на подходящи носители, които са дестилирана вода и 3 процента Tween 80. Всички растителни екстракти и калиев цитрат се разтварят в дестилирана вода при различни концентрации. Процедурата, използвана за разтваряне на Cystone, е подобна на методите на Pha-tak и Hendre [43] и Garimella et al. [44] с някои модификации. Таблетките Cystone се стриват на прах с помощта на хаванче и пестик (размер: 0.23m) и се разтварят (суспендират) в дестилирана вода (900 ul) и 100 ul от 3 процента Tween 80 (тоест 750 mg/ml). След това те се държат в продължение на 3 часа, за да се разтворят, центрофугират се при 1000 rpm за 5 минути и се филтруват през филтърна хартия с размер на порите 0,22 mm. Прозрачният супернатант се събира и използва за нуклеация на калциев оксалат и анализи на агрегация. Екстрактите се събират с помощта на епруветки на Falcon ( 45 ml), затегнете на въздух и съхранявайте в хладилник до експериментална употреба. Тестовите екстракти и стандартните лекарства се приготвят ежедневно и малко преди прилагането на теста в доза 200 mg/kg екстракти, 750 mg/kg Cystone и 2,5 g/kg калиев цитрат Обемът на дозиране на тестваното вещество беше 2 ml/100 g телесно тегло Дейонизирана вода беше използвана за приготвяне на всички екстракти/лекарства и те бяха приготвени ежедневно преди прилагане на теста.
In vivo уролитиатични фармакологични изследвания
Целеви животни: Използвани са здрави възрастни мъжки плъхове албиноси Wistar от същата възрастова група между 8 до 10 седмици и с тегло (220-280g), закупени от Етиопския институт за обществено здраве (EPHI) и отгледани в Biomed-ical Научна лаборатория за животни, AAU. Експериментът е проведен в лабораторията по биомедицински науки на AAU и EPHI, в съответствие с международно приетите стандартни насоки за използване на животни в научни изследвания. Преди започване на експеримента плъховете се аклиматизират към стандартни лабораторни условия (6 плъха в полипропиленови клетки) в продължение на 7 дни. Те бяха държани в контролирана среда на температура (27 ± 2 градуса), относителна влажност (55 ± 5 процента) и светлина (12 часа цикъл светлина/тъмнина). Тези плъхове са хранени с обикновени пелети (стандартна диета) и им е разрешена безплатна питейна вода (ad libitum) в продължение на 28 дни.
Cistanche deserticola полза: лекува бъбречно заболяване
Индукция на уролитиаза
Камъни в бъбрецитебяха индуцирани с помощта на етилен гликол (EG) заедно с амониев хлорид (NHCl), приложен в питейната вода на плъхове. В този модел на хипероксалурия, 1 процент (w/v) NHACl беше даден с 0.75 процента (v/v)EG за първите 5 дни за ускоряване на литиазата, след което подаването на вода беше превключено на {{4 }}.75 процента само EG през следващите 25 дни [45-47]. Експозицията на тези дози е достатъчно поносима при проучвания върху животни [48]. Приложенията на EG водят до хипероксалурия, която от своя страна води до отлагане на CaOx в бъбреците [49]. Опитните плъхове, определени катокамъкполучаваха лечебни групикамъкиндуциращо лечение за 28 дни.
Лечебни ефекти при уролитиаза
При лечебното третиране (разтваряне) общо 54 мъжки плъха ал-бинос Wistar бяха разделени на случаен принцип в 9 групи, включващи 6 индивида на група със съответстващо телесно тегло. При лечебно лечение, заболяването е индуцирано преди от ден 1 до 14. След това всеки от екстрактите/лекарствата е приложен перорално от ден 15 до 28 едновременно с протоколи за индуциране на заболяване (EG), за да се определят лечебните ефекти [50, 51] . В края на 28-ия ден плъховете се умъртвяват за биохимични и хистопатологични изследвания. Експерименталният дизайн беше определен като група I (нормална контрола), група II (литийна контрола), група I (K-Cit), група IV (цистон), група V (G. fruticosusРЕТ екстракт), група VI (екстракт от G.fruti-costs Chl.), група VI (G. fruticosusEtOAc екстракт), група VIII (G.fruticosus BuOH екстракт) и група IX (G. fruticosusaq. фракция). Други изследователи също са използвали калиев цитрат (2,5 g/kg) като положителна контрола [52, 53]. Дозираният обем е 2 ml/100 g телесно тегло. Контролната група получава дестилирана вода веднъж дневно през целия експеримент. В края на 28-ия ден плъховете бяха умъртвени за биохимични и хистопатологични изследвания.
Събиране на урина и микроскопски анализ
Урина, серум и хистологични профили са показатели закамъкобразуване, както и рецидиви. Изобилието и морфологията на кристалите на калциев оксалат, образувани in vivoкамъкиндукциите бяха изследвани с помощта на светлинен микроскоп (Wagtech Thatcham Berkshire RG194QD, Обединено кралство, 40x увеличение). Плъховете се поставят в отделни метаболитни клетки и се подлагат на 24-часово събиране на урина на 28-ия ден за лечебен тест [50]. При анализ на кристалурия, около 3 ml от събраните пресни проби от урина се поставят в стъклена епруветка и се центрофугират при 3000 rpm за 10 минути, за да се отстранят остатъците, а супернатантите се изхвърлят. Тези седименти от урина се използват за определяне на образуването на кристали CaOx. Около 10 ul от завихрените седименти се поставят върху предметно стъкло на микроскоп (покрито с покривно стъкло) и се изследват за CaOx кристали, като се има предвид техният брой и размер под светлинен микроскоп (40x). Кристалите, образувани от химикали в урината, бяха внимателно изследвани от други артефакти от урина. Снимките на микроскопични наблюдения бяха направени с помощта на цифров фотоапарат (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP с 3x оптично увеличение, Ню Джърси, САЩ), монтиран ръчно върху него.
Биохимичен анализ на урината
В края на съответните периоди на лечение, животните се настаняват индивидуално в метаболитни клетки и се събират проби от 24-часова урина (подкиселена и неподкиселена). Урината се подкислява с 1 ml 6N HCL (солна киселина) и се съхранява при 4 градуса за 5 дни. След това те се центрофугират при 3000 rpm за 10 минути (REMI, R24) и супернатантата от подкислена урина се използва за оценка на екскреции като съдържание на оксалат, калций, магнезий и фосфат. Съдържанието на проби от неподкиселена урина, като цитрат, креатинин и пикочна киселина, и общите протеинови концентрации бяха анализирани с помощта на налични в търговската мрежа диагностични комплекти от автоматизирания клиничен химичен анализатор. Концентрациите както на оксалат, така и на цитрат бяха анализирани с помощта на многоямков спектрофотометър (ELISA четец) съгласно ръководството, предоставено с комплектите. За целите на количественото определяне беше изготвена калибровъчна крива, използвайки комплекти за оксалат и цитрат като стандарт.
Събиране и анализ на серум
След края на експерименталния период (ден 28-ми), плъховете се анестезират с помощта на изофлуран и се вземат 3 ml кръвни проби от ретро-орбиталната вена чрез капилярна пункция. Серумът се отделя след центрофугиране при 3000 rpm, 20 градуса за 15 минути. Събраният серум беше изследван за биохимични параметри като креатинин, уреен азот в кръвта, пикочна киселина, урея, калций, магнезий и фосфат чрез автоанализатор за клинична химия (анализатор Cobas 6000, Германия) със съответните диагностични комплекти. Концентрациите на оксалат и цитрат, определени с множество ямки, като се използва 1 спектрофотометър (ELISA четец) съгласно ръководството, предоставено с комплекти. За целите на количественото определяне беше изготвена калибровъчна крива, използвайки комплекти за оксалат и цитрат като стандарт.
Cistanche deserticola полза: противовъзпалително
Анализ на бъбречен хомогенат
В края на експерименталния период (ден 28-ми), плъховете се умъртвяват под анестезия с изофлуран, последвано от цервикална дислокация. След това коремът се отваря и двата бъбрека се събират от всеки плъх. Изолираните бъбреци бяха внимателно отстранени и почистени (измити/изплакнати) от чужди тъкани с леденостуден физиологичен разтвор (0.15 М NaCl). Левите бъбреци от всяко животно бяха запазени в 10 процента буфериран неутрален формалин и използвани за хистологични изследвания. Десните бъбреци се нарязват на две равни половини с помощта на острие и едната половина се изсушава при 80 градуса във фурна с горещ въздух. Използваният метод е подобен на Ashok et al. [35] с някои модификации, при които фиксирано тегло от 200 mg (29 процента) от общото средно тегло на бъбрека (0,67 g) допълнително се нагрява отделно в 10 ml 1N солна киселина (1 процент HCl), която се поставя в кипяща водна баня при 100 градуса за 30 минути. След това се нарязва на ситно на парчета с помощта на острие, разбива се с пестик и хаван и се хомогенизира допълнително за 10 минути с помощта на ултразвук. Хомогенатът се центрофугира при 3000 rpm за 15 минути и супернатантата се събира с помощта на белязани криоепруветки. Накрая, супернатантите бяха използвани за оценка на съдържанието на калций, оксалат и фосфат с налични в търговската мрежа биохимични комплекти (BioVision PLC, САЩ), съгласно протокола на производителя [54,55].
Хистопатологични изследвания
Направени са хистопатологични изследвания на бъбречни тъкани на опитните плъхове. Всички плъхове бяха умъртвени по хуманен начин, използвайки анестезия с изофлуран в края на 28-ия ден (изследвания за лечение на уролитиаза). Парчетата тъкан са взети от бъбреците и са анализирани за уролитиазен лечебен потенциал на растителни екстракти. Тъканите се фиксират с 10 процента буфериран разтвор на неутрален формалин и впоследствие се поставят в парафинов восък. Срезовете (с дебелина 5 μm) бяха изрязани с помощта на ротационен микротом 4060E (Германия), монтирани върху предметни стъкла и оцветени с хематоксилин и еозин за изследване на хистопатологичните промени [34]. Всички области на тъканната морфология бяха изследвани под светлинен микроскоп (100x увеличение) (Wagtech Thatcham, Berkshire, RG19 4QD, Обединеното кралство) и фотомикрографиите бяха заснети с помощта на цифрова камера, монтирана ръчно (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP с 3x оптично увеличение, Ню Джърси, САЩ) за допълнителни справки.
Отлагане на кристали на калциев оксалат
В бъбреците кристалните отлагания се определят с помощта на полуколичествени анализи, което е микроскопски точков метод [46,56]. Използван е микроскопски филарен микрометър (0.1 mm) окуляр (10x, широко поле от 23,3 mm, Olympus Optics OSM 212422, произведен в Япония). Тоест кристалните отлагания в бъбречните тъкани се преброяват с помощта на светлинен микроскоп. Степените на тежест на кристалните отлагания бяха определени като 0=<1 crystal(no="" crystal="" deposition),1="1-10,2=11-30," 3="31-50," 4="51-75" and="" 5="">75 броя кристали, като се вземат средните стойности [46].
При преброяването на кристалните отлагания на CaOx, сагитален разрез на всеки бъбречен образец беше разделен на четири еднакви по размер региони с две виртуални линии и бяха отчетени показания на средно 4 микроскопични полета [57,58]. След това на случаен принцип беше избрано поле от 100x избрани от всеки регион и отлаганията на CaOx бяха преброени. Изображението на една от четирите области под светлинен микроскоп беше заснето на случаен принцип [58] с помощта на цифрова камера, монтирана ръчно отгоре на микроскопа.
Статистически анализ
Данните бяха анализирани с помощта на софтуер Graph Pad Prism версия 6 (софтуер Graph Pad, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от post-hoc сравнения на теста на Dunnett, се извършва, когато е необходимо да се сравнят между третираните и нетретираните групи. Стойностите на данните бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Стойности на P<0.05 was="" considered="" statistically="">
Cistanche deserticola полза: лекува бъбречно заболяване
