Разбиране на сортирането след въвеждане на аденовирусни капсиди; Шанс за промяна на свойствата на вектора на ваксината, част 1

Резюме:

Базираните на аденовирус вектор генетични ваксини се очертаха като мощна стратегия срещу здравната криза SARS-CoV-2. Този успех не е неочакван, защото аденовирусите комбинират много желани характеристики на генетична ваксина. Те са силно имуногенни и имат нисък и добре характеризиран патогенен профил, съчетан с технологична достъпност. Продължаващите усилия за подобряване на векторите на аденовирусната ваксина включват използването на редки серотипове и нечовешки аденовируси. В този преглед ние се фокусираме върху вирусния капсид и как изборът на генотипове влияе върху усвояването и последващото субклетъчно сортиране. Ние описваме как разбирането на свойствата на капсида, като стабилност по време на процеса на влизане, може да промени съдбата на влизащите частици и как това се превръща в разлики в резултатите от имунитета. Обсъждаме подробно как мутирането на мембранния литичен капсиден протеин VI влияе на сортирането след влизане на вируси от вид C и накратко обсъждаме дали такива подходи могат да имат по-широко значение в развитието на ваксина и/или вектор.

Щракнете чиста цистанчепродукт

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Въведение

Вирусните инфекции, за разлика от бактериалните инфекции, които могат да бъдат лекувани с антибиотици, остават заплаха за здравето, тъй като съществуват много малко антивирусни лекарства. Следователно ваксинацията е единствената широко приложима стратегия за защита на човешките (и животинските) популации от вирусни инфекции.

Доскоро ваксинацията срещу вирусни инфекции се разглеждаше главно в контекста на предотвратяване на детски заболявания или като годишна ваксина срещу грип за профилактика на грипни инфекции. С избухването на здравната криза SARS-CoV-2 през 2020 г. ваксинацията се върна в центъра на общественото внимание, тъй като сега се възприема като единствения устойчив изход от тази пандемия. В този контекст ваксините, базирани на аденовирус (Ad), се очертават като една от двете основни успешни стратегии за ваксиниране. След спешно одобрение рекламните ваксини сега се инжектират в голяма част от населението на земята в безпрецедентен опит за установяване на планетарен имунитет срещу SARS-CoV-2.

Аденовирусните векторни ваксини не бяха широко използвани преди избухването на COVID{0}}, но техният успех не е неочакван. Като цяло вирусите са много подходящи платформи за ваксини. Те са биологично оптимизирани и адаптирани за транспорт на нуклеинова киселина и предизвикват имунни отговори. Аденовирусите имат много характеристики, които ги правят особено идеални кандидати за ваксина. Те имат нисък и добре характеризиран патогенен профил, съчетан с висока инфекциозност. Те са технологично достъпни и се използват широко за векторизация. Техният висок производствен добив и стабилност позволяват промишлено производство при условията на добра производствена практика (GMP) и предоставят практически характеристики (т.е. съхранение) за регионално разпространение на намалена цена [1]. Освен това доставянето на Ad клетки в антиген-представящи клетки е ефективно и те естествено провокират вроден имунен отговор, който действа като адювант за повишаване на успеха на ваксинацията [2,3].

Разбирането на рекламната биология е от решаващо значение при разработването на рекламни (ваксини) вектори. Например, използването на нечовешки или редки Ad серотипове в някои от предлаганите в момента на пазара ваксини срещу SARS-CoV-2 беше умишлено избрано, за да се предотврати намаляването на ефикасността на ваксината от съществуващ векторен имунитет. Използването на вектори с изтрит вирусен ген осигурява подобрена безопасност на вектора. Все още обаче има много аспекти от жизнения цикъл на вируса, които не са били взети под внимание при разработването на вектори за ваксини, базирани на реклами, и познанията за редки или нечовешки генотипове са ограничени, включително тези, използвани в момента като ваксини срещу SARS-CoV-2 . С този преглед бихме искали да повишим осведомеността за потенциални модификации, които могат да бъдат използвани при разработването на рекламни вектори за медицински цели, включително ваксинация.

Ние се фокусираме върху вирусния капсид и как изборът на генотипове влияе върху усвояването и последващото субклетъчно сортиране. Ние описваме как разбирането на свойствата на капсида като стабилност по време на процеса на влизане може да промени съдбата на влизащите частици и какви различни резултати от имунитета се наблюдават. Като пример за това как стабилността и съдбата на капсида могат да бъдат променени, ние обсъждаме подробно как мутирането на мембранния литичен капсиден протеин VI засяга вирусите от вида C. И накрая, обсъждаме накратко дали такива подходи имат потенциала да бъдат използвани за разработване на ваксина и/или вектор.

1.1. Аденовирусите представляват разнообразно семейство от инфекциозни патогени

Исторически Ad е изолиран за първи път през 1953 г. от аденоиди на пациенти с респираторни инфекции [4] и скоро след това терминът "аденовирус" е универсално приет [5]. Семейството на Adenoviridae има повече от 120 члена, разделени на пет рода - в зависимост от това дали заразяват бозайници (напр. Mastadenoviridae), птици (напр. Aviadenoviridae), влечуги (напр. Atadenoviridae), земноводни (Siadenoviridae) или риби (Ichtadenoviridae) ) [6,7]. Родът Mastadenoviridae също представлява повече от 70 вида човешки реклами [8, 9], които са класифицирани в седем вида (A–G), според техните морфологични, биологични и физикохимични свойства, както са изброени в таблица 1 [10, 11].

Освен това Ads може също така спонтанно да се рекомбинира, като по този начин генерира нови видове [12], какъвто беше случаят с AdE4, който е единственият човешки вид E вирус и вероятно е резултат от рекомбинацията между човешки вид B и маймунски Ad [13 ]. Въпреки че инфекциите при хора с нечовешки реклами са естествено редки, те не са невъзможни [14,15]. Капацитетът на различни нечовешки реклами да заразяват (или трансдуцират) човешки клетки ги прави привлекателни (ваксини) векторни платформи. Сред тях са реклами, получени от шимпанзета [16–18], горили [19], овце [20], крави [21], кучета [21,22] или маймуните от новия свят [23].

Аденовирусните инфекции могат да причинят различни патологии в зависимост от техния клетъчен или тъканен тропизъм, включително респираторни, очни, пикочни или стомашно-чревни заболявания (вижте таблица 1). Тъканният тропизъм често е резултат от различно използване на рецептори от различни Ads и може също да бъде свързан с присъщата стабилност на частиците [24]. Повечето инфекции с Ads са леки или асимптоматични при имунокомпетентен гостоприемник. Първичните инфекции с Ad се появяват предимно в детството и водят до силен защитен имунитет. Обратно, при имуносупресирани индивиди Ads може да причини неконтролирани, тежки и животозастрашаващи системни инфекции, водещи до сериозна клетъчна токсичност, което може да доведе до прекомерно възпаление и множествена органна недостатъчност, причинявайки висока смъртност [12].

Най-добре проучените човешки реклами са видовете С вируси тип 2 и 5, които се срещат предимно при пациенти с инфекции на горните дихателни пътища и стомашно-чревния тракт [25] и които ще бъдат основният фокус на този преглед. Аденовирусите могат да бъдат отговорни за случайни огнища, като вируси от вид B, причиняващи пневмония (напр. Ad3, 7 и 14) сред имунокомпетентни индивиди [26] или Ad40/41 от видове F и Ad12, 18 и 31 от видове A , които заразяват стомашно-чревния тракт (както е прегледано в [26,27]). Вирусите от вид D са много разнообразна група и са склонни към рекомбинация и са водеща причина за очни инфекции [28].

1.2. Аденовирусните капсиди са метастабилни структури

Въпреки разнообразието си, всички реклами следват сходна структурна и организационна рамка. Аденовирусите са ДНК вируси без обвивка, съдържащи относително голям, 26–45 kb линеен двойноверижен ДНК геном [29–31]. Капсидът е с диаметър ~70–90 nm и има формата на икосаедър с 20 фасети и 12 върха [32]. Капсидът се състои от три основни структурни протеина (хексон, пентон и фибри) и разнообразие от второстепенни циментови протеини (т.е. IIIa, VI, VIII и IX във вируси от вид C), които стабилизират структурата. Структурата с висока разделителна способност на няколко Ad капсиди е получена чрез криоелектронна микроскопия и рентгенова кристалография [24,33–36]. Икосаедричният капсид има псевдо-T25 структура със 720 екзона, събрани в различни тримери в зависимост от местоположението им в капсида. 20-те фасети на капсида са съставени от девет сглобени екзона (т.нар. GON за група от девет), докато в 12-те върха екзоните са сглобени в GOS (за група от шест) (вижте [37,38] за повече подробности ). Пентамерната основа на пентона се вкарва в 12-те върха и служи като основа за изпъкналото тримерно влакно [39,40]. Взаимодействието между големи и второстепенни капсидни протеини стабилизира капсида, главно чрез взаимодействие с шестоъгълници.

Например GON се стабилизира от IX [41]; IX и IIIa сами по себе си се стабилизират чрез тяхното взаимодействие с VIII, което ги свързва съответно с GOS и GON [37]. Молекулите VIII очертават GON и спомагат за стабилизирането на шестоъгълници от вътрешната страна на капсида. Протеин VI също така стабилизира хексона чрез свързване на централната кухина на тримера на хексона, изложена на вътрешния вирусен лумен [42–44].

Капсидът заобикаля и защитава вирусното ядро, съставено от вирусния геном, протеините на вирусното ядро ​​(т.е. V, VII, Mu при вируси от вид C) и крайния протеин (TP), който е ковалентно свързан към всеки 5' край на геномът на Ad. Малките капсидни протеини взаимодействат с основните протеини, установявайки връзка между капсида и генома; обаче, тяхната пространствена организация сред основните протеини остава слабо разбрана. Доказано е, че V поддържа ДНК вътре в капсида чрез взаимодействие с VI (страна на капсида) и VII (страна на генома) [45–47] и вероятно допринася за освобождаването на генома в ядрената пора [48]. VII е основният капсиден протеин, свързан с вирусна ДНК и насърчава неговата кондензация вътре в капсида [49–51]. VII също защитава вирусния геном от имунно откриване чрез клетъчни фактори [50,52–54]. Интересно е, че капсиден протеин IX и протеин V присъстват само в Mastadenoviridae [55,56], а вирусните капсиди могат да бъдат произведени без IX [57] или протеин VII [58], показвайки известна гъвкавост в структурата на капсида.

Геномът на човешки реклами кодира ~45 протеина (включително структурните протеини), организирани във временно регулирани транскрипционни единици [59]. Транскрипционният фактор E1A е първият експресиран протеин и е необходим за иницииране на експресията на вирусен ген [60]. Геномът също съдържа 5' последователност на капсулиране и обърнати крайни повторения (ITR) във всеки край, които са необходими за репликация [59,61–64]. Аденовирусите кодират аденовирусна протеаза (AVP), която е опакована в частицата и обработва няколко протеина (т.е. IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP и 52.55K във видовете C вируси) [65–67]. Тази стъпка е необходима за образуването на зрели инфекциозни частици и индуцира образуването на метастабилни (т.е. по-малко стабилни) капсиди, подготвени за разглобяване на капсида при клетъчно прикрепване и навлизане [68,69]

Съществуват и специфични за вида разлики в структурата на човешките реклами, например в дължината на влакната и гъвкавостта, което пряко влияе върху рецепторното свързване [70–72]. Разлики могат да се наблюдават и в монтажа на пентона. Пентони на вируси от вид B могат да образуват междупентонни контакти, което води до алтернативни и по-малко стабилни вирусоподобни частици, които са лишени от геноми и понякога без влакна. Такива частици се наричат ​​додекаедри и се изследват за клетъчен трансфер на плазмиди или пептиди като алтернатива на Ad векторите. Додекаедрите излагат по-добре RGD къс пептиден мотив, присъстващ в пентона на повечето Ad видове, който е необходим за свързване на целевите клетки [73,74]. Разликите в стабилността на капсида, както е обсъдено по-долу, могат да бъдат важно свойство, което определя съдбата на влизане на Ad частиците.

1.3. Аденовирусите следват литичен жизнен цикъл

Цикълът на инфекция с реклами е обстойно прегледан другаде [75–77]. Тук накратко се фокусираме върху входната част от жизнения цикъл и, освен ако не е посочено друго, ще се позоваваме на вируси от вид C, които са най-добре проучени (Фигура 1). Аденовирусите използват капсидни влакна като първична клетъчна прикрепваща молекула. Повечето Ads, включително вируси от вид C, използват коксакивируса и Ad рецептора (CAR) за свързване на целевите клетки [78–81]. Обратно, някои вируси от вид B преференциално свързват CD46 рецептора [82] или дезмоглеин 2 [83], а някои вируси от вид D взаимодействат със сиалови киселини [84,85] или директно с v интегрини (вижте Таблица 1) [ 86].

По този начин превключването на влакна между видовете е привлекателна стратегия за промяна на тропизма [87–89]. Основната роля на влакнеста молекула е да медиира физическото свързване с целевите клетки, което е последвано от второ взаимодействие между пентон и интегрини, като v 5 [90]. Това взаимодействие се медиира от RGD пептидния мотив в пентонната последователност [91]. Липсата на този мотив, както при вирусите от вид F, е свързана с по-малко ефективно навлизане в клетката [92]. Свързването на интегрин води до групиране на интегрин на клетъчната повърхност [93], което задейства сигнална каскада, водеща до реорганизация на актиновия цитоскелет [94,95] и ендоцитно поемане чрез клатрин-медиирана ендоцитоза или микропиноцитоза [96,97]. Свързването на RGD може също да дестабилизира капсида [98] чрез намаляване на контактите между пентон и хексон, като помага на капсида да се освободи от покритието [99]. В резултат на това Ad частиците губят своите влакна и могат да се намерят дисоциирани хексон и пентон вътре в ендозома [100–102]. Ендозомата е динамична органела, подготвена да узрее в разграждащи се лизозоми и рекламите трябва да избягат бързо в цитозола. Ендозомното подкисляване може да ускори процеса на бягство чрез допълнително отслабване на капсида [100,103]. Процесът на проникване в ендозома разчита на освобождаването на вътрешния капсиден протеин VI [103,104].

Освободеният VI се характеризира с N-терминална амфипатична спирала, която се свързва с вътрешната листовка на ендозома и предизвиква положително изкривяване на мембраната, което води до локално ограничено разкъсване на мембраната [75,103,105,106]. Клетките реагират на индуцираното от вируса разкъсване на мембраната и активират локализиран отговор на автофагия, за да изчистят увредената органела [107–109]. За да се избегне разграждането, Ads спират автофагията чрез къс PPxY пептиден мотив в протеин VI, докато частицата достигне безопасността на цитозола [104,108]. Показано е, че вирусите на вид C избягват от ранните ендозоми [110]. Други видове, включително A, B и D, първо преминават към лизозомата, преди да избягат в цитозола [111–113], което може да повлияе на имунната активация, предизвикана от тези вируси [114].

След като Ads достигнат цитозола, те се захващат с динеинови двигатели и използват ретрограден транспорт по микротубулите, за да достигнат до центъра за организиране на микротубулите [115–117]. Моторното свързване вероятно се медиира от хексон [115] и може да изисква киселинно праймиране [118]. В близост до ядрото капсидите сменят посоката на транспортиране, вероятно чрез свързване с кинезин моторни протеини и натрупване в ядрената обвивка [115,117,119,120]. Те се прикрепят към комплекса на ядрените пори, след което капсидите се разглобяват напълно и геномите се освобождават и импортират в ядрото [51,121–124]. След като влезе в ядрото, цикълът продължава чрез активиране на транскрипция на генома и експресия на непосредствения ранен ген E1A, който служи като транскрипционен фактор за всички други ранни транскрипционни единици [60,125–130]. След експресията на репликационните ензими, вирусните геноми се репликират и се натрупват в периферията на репликационните центрове [131].

След това структурните протеини се експресират от късната експресионна единица под контрола на главния късен промотор [132,133]. Експресията на късните гени кулминира в производството и ядреното натрупване на всички структурни протеини, където те се събират в потомство и пакетират новосинтезирани геноми. След това ядреното сглобяване на следващото поколение Ads води до излизане на частици и клетъчен лизис [42,134–136]. Както бе споменато по-горе, сглобяването на капсидите е последвано от съзряване, т.е. протеолитично разцепване на няколко капсидни протеини от AVP за получаване на инфекциозни частици [66]. Значението на този процес е илюстрирано от чувствителния към температура мутант, Ts1, първоначално идентифициран в екран за мутагенеза в Ad2. При недопустима температура този мутант не успява да опакова AVP и сглобените частици не претърпяват узряване, което води до свръхстабилни частици [137]. Отговорната AVP мутация е генетично въведена в Ad5, запазвайки този фенотип. Ts1 капсидите все още могат да се прикрепят към клетъчните рецептори и да бъдат ендоцитирани, но след това остават уловени в ендозома поради неспособността им да освободят протеин VI [103,138,139].

2. Имунно откриване на аденовирус

Аденовирусите са широко разпространени и голяма част от населението се е сблъсквало с този вирус, главно в детството. Аденовирусите са силно имуногенни и всяка среща провокира развитието на специфичен анти-Ad имунитет, както вроден, така и адаптивен, който може да продължи цял живот. Това е важно в борбата срещу вируса и прави рекламите по-малко вредни за имунно-компетентния гостоприемник, но може да бъде пречка, когато рекламите трябва да се използват като вектор във ваксинологията или генната терапия [140,141]. Разбирането как Ad (и неговите векторни производни) активира имунната система ще ни позволи да подобрим ефективността и безопасността на ваксините. Наблюдения in vivo от пациенти, участващи в клинични изпитвания, ясно показаха, че базираните на Ad вектори могат да индуцират мощно имунно активиране [142,143], понякога с фатални последици [144].

В допълнение, различни изследвания, проведени in vitro или животински модели [145] предполагат ключова роля на самата вирусна частица (т.е. капсид и включена ДНК) в активирането на първоначалния имунен отговор. Тук накратко се фокусираме върху имунните отговори, свързани с влизащия капсид; за по-задълбочен преглед вижте публикувани преди това рецензии [146–149].

2.1. Аденовирусите задействат вътрешен клетъчен имунитет

С развитието на Ads като вектори стана ясно, че присъщият на клетката или вроден имунитет, индуциран от Ads, е отговор на нахлуващия вирион. Интересно е, че както репликативни, така и нерепликативни вируси (т.е. UV-инактивирани вируси, нерепликативни вектори или празни капсиди) активират имунните отговори в заразените клетки, което показва, че капсидът има ключова роля в този отговор [145,150–156] .

Като цяло рекламите се усещат от клетките на няколко стъпки през целия жизнен цикъл на вируса и активират пътищата на вродения имунитет (Фигура 1). Това активиране започва със свързването на Ad влакното към рецептора CAR на клетъчната повърхност, което активира сигнализирането на митоген-активирана протеин киназа (MAPK), което води до активиране на транскрипционния фактор NF-κB. Този тригер води до производството на провъзпалителни цитокини (IL-6, IL-8) [157,158]. Въпреки това, в зависимост от видовете Ad, използването на други рецептори може да модулира силата на сигналната каскада, участваща в експресията на цитокини [159]. Взаимодействието между вирусния пентон и клетъчния интегрин е допълнителен тригер за имунна активация. Проучване в миши макрофаги показа, че това свързване активира експресията на IL-1 чрез RGD мотива [160]. Това може да бъде ограничено до имунните клетки, тъй като в други клетъчни модели (напр. HeLa, епителна клетъчна линия), ролята на взаимодействието интегрин/RGD в производството на хемокини и провъзпалителни цитокини не е потвърдена [151,161,162]. Това предполага по-важна роля на самия процес на интернализация в имунното активиране, отколкото взаимодействието с интегрини. Наистина, свързването на пентон към интегрин също активира сигнализирането на фосфоинозитид 3-киназа (PI3K), за да увеличи интернализацията на вируса [163].

Освен това е показано, че активирането на PI3K при Ad инфекция задейства производството на провъзпалителни цитокини, като TNF [164], и процесът на интернализация е описан като необходим за имунна активация [165]. Тези проучвания предполагат, че имунното активиране се случва главно на етап след интернализация, подчертавайки важността на сортирането след влизане (прегледано в [166]).

Веднъж попаднали в ендозома, Ads са изложени на интралуминални рецептори за разпознаване на патогени (PRR) като TLR9, който е двуверижен ДНК сензор, ограничен до имунни клетки. Мишите макрофаги могат да усетят Ad вектори чрез TLR9, за да индуцират производството на провъзпалителни цитокини [167]. TLR9 също беше строго необходим за IFN / производство, когато миши плазмоцитоидни дендритни клетки (pDC) бяха предизвикани с Ad [168]. Въпреки това, в модели на мишки с нокаут TLR9, IFN / все още се произвежда, което предполага, че в клетки, различни от pDC, производството на IFN възниква независимо от сигнализирането на TLR9 [168,169].

Вирусните геноми (или векторните геноми) стават достъпни за усещане по време на или след ендозомалното излизане на вируса. След като достигнат цитозола, те се усещат от цитозолния двуверижен ДНК сензор cGAS [168,170]. При разпознаване на вирусен геном, cGAS насърчава фосфорилирането и ядрената транслокация на транскрипционния фактор IRF3, за да задвижи IFN / експресията, предизвиквайки антивирусно състояние. Ендозомалното преминаване изисква индуцирано от вируса увреждане на ендозомалната мембрана, за да се улесни ендозомалното излизане на вирусни частици. По този начин руптурата на мембраната значително допринася за имунното активиране, подчертано от факта, че дефектният Ts1 мутант не успява да активира пълен и ефективен имунен отговор [161,162,170,171]. Основна роля във възпалителния отговор при проникване на мембраната на Ad се играе от киназата, свързваща резервоара, TBK1, предполага се, че е част от цитозолния сензор надолу по веригата на вирусния геном чрез пътя cGAS/STING [168,170].

Увреждането на аденовирусната мембрана също води до освобождаване на катепсин В от ендо-лизозомния компартмент, причинявайки оксидативен стрес, който активира инфламазомата NLRP3, което води до съзряване на IL-1 [114]. Вирусите от вид C избягват от ранните ендозоми, докато вирусите от вид B преминават до късните ендозоми, вероятно поради разликите в използването на рецепторите. Подкисляването в късната ендозома/лизозома е по-вероятно да активира лизозомни киселинни хидролази. И двата вида индуцират активиране на инфламазома [172], но, вероятно поради времето на престой в ендозома, степента на техните отговори се различава. В световен мащаб вирусите от вид B предизвикват по-силна вродена и адаптивна имунна активация от вирусите от вид C [113,173,174]. Това може да обясни защо вирусите от вид B са по-патогенни, причинявайки огнища при имунокомпетентни гостоприемници [26]. Освен това предполага, че клетките могат да разграничават компартмента за проникване (т.е. ендозома срещу лизозома [109]) и да адаптират ефективността на имунитета. Увреждането на ендозомалната мембрана по време на процеса на бягство от Ad също може да бъде сигнал за опасност само по себе си. Както е обсъдено подробно по-долу, увреждането на мембраната води до цитозолно излагане на интралуминални гликани, които се откриват от клетката като сигнали за опасност (както е разгледано в [109]). Откриването на открити гликани от галектини впоследствие активира автофагия, задействайки втори клон на антивирусния имунитет [108].

2.2. Аденовирусите провокират адаптивен имунен отговор и подкопават антивирусната автофагия при навлизане в клетката

Вродените имунни отговори, провокирани от Ads или техните вектори, впоследствие се превръщат в адаптивен имунитет чрез хемокинова секреция, която привлича имунни клетки (неутрофили, естествени клетки убийци и макрофаги) и подсилва мощното антигенно представяне [153,154]. Аденовирусите са силно имуногенни и техните основни имуногени са главните капсидни протеини (хексон, пентон и фибри), които задействат специфичното за видовете производство на неутрализиращи антитела от В клетки [175–177].

Неутрализиращите антитела са насочени най-вече срещу хиперпроменливите бримки на хексоновия протеин [178–180] и представляват основно ограничение за използването на Ads като вектори, получени от същия серотип. Този проблем е заобиколен чрез използването на по-малко сероразпространени или нечовешки реклами [181–185]. Въпреки този анти-векторен имунитет, когато Ads се използват като платформи за ваксини (напр. за предизвикване на имунна защита срещу ебола в клинични изпитвания), те все още предизвикват силен В-клетъчен отговор, позволявайки производството на антитела срещу желания имуноген на ваксината, който може да продължи до 6 месеца [186]. В допълнение, съществуващият векторен имунитет може да бъде преодолян с по-високи дози на вектора на ваксината, както в случая с вектора на ваксината SARS-CoV-2, базиран на AdC5 с високо серологично разпространение [187].

Както при неутрализиращите антитела, Ad инфекциите предизвикват устойчив Т-клетъчен имунитет, главно чрез CD4 плюс активиране. Тази защита все още може да се намери при възрастни, което предполага дълготраен имунитет от детството [188–190]. В допълнение, активирането на CD8 plus също е описано за поддържане на цитотоксичен отговор [191–193]. Това Т-клетъчно активиране не е непременно специфично за серотипа и позволява кръстосана защита срещу различни Ad подгрупи и серотипове [192–194].

Освен това, при пациенти с трансплантирани стволови клетки, заразени с Ad, е описано силно активиране на CD4 plus и CD8 plus [195]. Това активиране е насочено срещу хексонови пептиди и води до изчистване на Ad viremia, подчертавайки основната роля както на CD4 плюс, така и на CD8 плюс Т-клетъчното активиране в имунната защита. Докато този базиран на Т-клетките имунитет е насочен срещу частицата Ad, Ads също предизвиква силен клетъчен имунитет, базиран на T-клетъчния отговор срещу антигена на ваксината, което е предимство за дълготраен имунитет при използване на рекомбинантни Ad вектори като платформи за ваксина [196,197 ]. Важно е, че данните от клиничните изпитвания потвърждават, че когато Ad се използва като платформа за ваксина (с желания антиген като трансген), той индуцира както цитотоксични CD8 плюс Т-клетки, така и CD4 плюс Т-клетъчно активиране, което води до имунитет на паметта срещу експресиран трансген [184,186,198–202].

Т-клетъчното активиране разчита на представянето на вирусни пептиди чрез главния комплекс за хистосъвместимост (МНС). Накратко, представянето на антиген от МНС клас I е резултат от протеазомно разграждане и получените пептиди ще индуцират CD8 плюс Т-клетъчно активиране, позволявайки първично и пролиферативно действие на цитотоксичен Т-клетъчен отговор. Представянето на MHC клас II антиген е резултат от лизозомна протеолиза и получените пептиди ще индуцират CD4 плюс Т-клетъчно активиране при представяне, задействайки последващото активиране на В клетки [203]. Сега е добре характеризирано, че аутофагията насърчава представянето на пептид към молекулите на МНС клас II [204]. Не е изненадващо, че автофагията е един от най-старите защитни механизми срещу инфекция и важна част от клетъчния репертоар срещу нахлуващи патогени, участвайки както във вродени, така и в адаптивни имунни отговори. Той може директно да отдели патоген за разграждане (ксенофагия) и участва в представянето му на имунната система [205–207]. Макроавтофагията (по-често наричана аутофагия) е запазен път на лизозомно разграждане, който участва в много фундаментални физиологични процеси като хомеостаза и вроден и адаптивен имунитет [208–210]. Автофагията се характеризира с образуването на двойна мембранна везикула, наречена "автофагозома", която поглъща цитоплазмени товари (т.е. органели, агрегати и патогени), предназначени за разграждане (Фигура 2). По време на този процес автофагозомите, съдържащи товар, се сливат с лизозоми, за да бъдат разградени и рециклирани.

Представянето на антиген чрез аутофагия е описано както за MHC клас I, така и за клас II [204]. След индукция на аутофагия, вътреклетъчните антигени се поглъщат в автофагозоми, сливайки се с отделения, съдържащи MHC клас II, за да им се осигури външен патогенен материал (Фигура 2) [211]. Ролята на аутофагията в това конкретно представяне на MHC клас II антиген е описана за първи път за инфекция с вируса на Epstein-Barr, където инхибирането на аутофагията води до намалено CD4 плюс Т-клетъчно активиране [212,213]. Към днешна дата примерите включват няколко вируса, включително вирус на херпес симплекс [214], вирус на грип [215] и вирус на човешка имунна недостатъчност тип 1 (HIV-1) [216] и вероятно се простира до реклами (вижте по-долу). Представянето на MHC клас II е в съответствие с процеса на аутофагия, тъй като е цитозолен защитен механизъм. Аутофагията също участва в кръстосаното представяне на извънклетъчните антигени на MHC клас II [214]. Наистина, представянето на МНС на извънклетъчния овалбумин е по-ефективно, когато механизмът за аутофагия (и особено ATG5) функционира и е доказано, че поглъщането на извънклетъчен материал включва неканонична форма на аутофагия, наречена LC{17}}свързана фагоцитоза ( LAP) [217].

След като присъстват в LAP-some, някои извънклетъчни антигени могат да бъдат изложени чрез представяне на MHC клас II [218]. Автофагията също участва до известна степен в представянето на MHC клас I, въпреки че по-голямата част от епитопите се представят чрез механизъм, строго зависим от транспортера, свързан с комплекса за обработка на антиген (TAP) [219]. TAP-независимо представяне, медиирано от аутофагия, досега беше показано само при условия на изчерпване на TAP [219,220]. Ако този начин на представяне наистина съществува, това остава спорно [221] и се обсъжда другаде [204,222,223].

За да предотвратят представянето на MHC, Ads отделят голяма част от своя геном, а именно региона E3, за да подкопаят системата за представяне на MHC в клетките [224–228]. В повечето (ваксинни) вектори тези гени отсъстват и скорошна работа предполага, че увеличаването на представянето на антиген от MHC може да подобри ефективността на Ad ваксината [229,230]. Автофагията играе решаваща роля в обработката на Ad антигени за представяне на MHC клас II при Ad-индуциран имунитет [108,229].

Монтеспан и др. показаха, че Ads индуцират аутофагия при проникване в ендозома и че влизащите частици, изчистени от аутофагия в този процес, се представят ефективно на имунната система [108]. Това наблюдение е в съответствие с проучването, публикувано от Klein et al. което показва, че в контекста на онколитичните реклами, вирусните антигени узряват чрез JNK-зависима форма на аутофагия [229]. Въпреки това, автофагията в контекста на рака играе двойна роля. Като пазител на хомеостазата, аутофагията ограничава инициирането на тумор [231], докато при напреднал рак аутофагията действа като процес на оцеляване, за да благоприятства туморния растеж [232,233]. По този начин, в контекста на онколитичните вектори, тумор-специфичните характеристики на аутофагията трябва да бъдат внимателно оценени.

3. Аденовируси като (ваксинни) вектори

Векторизацията на вирус включва използване на неговите естествени свойства, като същевременно минимизира свързания биологичен риск. В тези условия Ads са отлични векторни кандидати за разработване на ваксина [234]. Аденовирусните вектори са стабилни, лесно се произвеждат до висок титър и имат голям капацитет за клониране. Това позволява вмъкването на трансген, т.е. да се експресира антиген по избор. Те имат широк спектър на инфекциозност и трансдуцират неделящи се клетки, а геномът им е неинтегративен [1]. Както е описано по-горе, те също провокират възпалителен отговор в антиген-представящи клетки (APCs), който служи като адювантна функция за усилване на имунния отговор, необходим за ефикасно ваксиниране [2,3,142,235,236].

Освен това, получените от Ad вектори са широко използвани в предклинични и клинични изпитвания, за да се докаже тяхната безопасност [237,238]. За да се елиминира нежеланата част от цикъла на репликация, вирусната репликация трябва да бъде потисната, за да се предотврати клетъчен лизис и вирусно размножаване. Развитието на аденовирусен вектор започна през началото на 90-те години като платформа за широк набор от терапевтични подходи, като генна терапия, онколитични вектори и разработване на ваксини. Повечето от ранните разработки на вектори са модифицирани версии на вируси от вида C.

3.1. Развитие на аденовирусен вектор, подход между поколенията

Първото поколение на Ad вектор е направено чрез изтриване на E1 и E3 региона от вирусния геном, по-специално кодиращ незабавния ранен транскрипционен фактор, предотвратявайки репликацията на тези вектори. Тези вектори имаха капацитет за клониране от около 8 kb за вмъкване на трансген с регулаторни последователности [239–241]. Векторите от първо поколение са произведени в клетки на човешки ембрионален бъбрек (HEK), стабилно трансформирани с част от Ad5 вирусния геном, който допълва Е1 региона в транс [242–247]. Един от основните недостатъци на тази система е, че тя позволява възстановяването на репликационно-компетентни геноми след спонтанна рекомбинация [248]. Допълнителната делеция на E3, която не е необходима за производството на вектор, увеличава размера на трансгенната касета [243] и насърчава по-добър имунен отговор [240].

За съжаление, Ad векторите от първо поколение не са напълно инертни по отношение на транскрипцията и все още предизвикват силен имунен отговор срещу вирусни капсидни протеини, които се експресират на изходни нива [141,249,250]. Този лентивекторен имунитет допринася за векторната токсичност и краткотрайното елиминиране на трансдуцирани клетки [145]. Второто поколение Ad вектори допълнително има Е2 и Е4 регионите отстранени от векторния геном. Е2 кодира репликационните ензими и Е4 допълнителни регулаторни протеини [251–253]. Това позволи пространство за 10,5 kb трансгенни последователности, включително до четири експресионни касети [254]. По същия начин, допълнителните делеции силно намаляват нежеланата рекомбинация и удължената трансгенна експресия [255]. Това вероятно е резултат от намалена аберантна вирусна генна експресия, която допълнително намалява анти-векторния имунитет [141,250,251]. Аденовирусните вектори от трето поколение са концептуално различни. Те се състоят от пакетиран векторен геном и непакетиран вирусен геном (помощен вирус), който произвежда векторни частици. Такива вектори са известни също като "зависими от помощник", "безсърдечни" или "висококапацитетни" (HC-Ad) вектори. Те имат най-високия възможен капацитет за клониране и могат да носят последователности до 36 kb [256–258]. В рекламите с голям капацитет липсва каквато и да е вирусна кодираща последователност, с изключение на ITR и кратък сигнал за капсулиране, който позволява опаковане на генома и който отсъства от помощния вирус [259–262]. Тази стратегия ни позволи най-накрая да преодолеем повечето анти-векторен имунитет, позволявайки дългосрочната експресия на трансгени [263–267]. HC-Ads обаче не са част от текущия векторен репертоар на ваксини.

3.2. Аденовирус като ваксинен вектор

Преди да изследваме как са използвани Ad векторите, заслужава да се отбележи, че ваксинацията срещу самите вируси тип 4 и тип 7 ​​на Ad вид B е разработена в началото на 1970 г. [268]. Тази перорална жива ваксина е задължителна от 2011 г. за военни новобранци в САЩ и драстично намали нивата на инфекция, достигайки практически нула [269–271]. Това подчерта присъщата ефективност и безопасност на Ads като ваксина и отвори полето за използване на Ads като платформа за ваксиниране. Към днешна дата над 200 рекламни ваксини са влезли в клинични изпитвания [272]. Много от тях са насочени срещу инфекциозни патогени като ХИВ-1 и Ебола [230,273,274]. Базираните на аденовируси ваксини не са лишени от недостатъци. Наскоро разработена анти-HIV ваксина, базирана на вида C вирус Ad5, използва смес от вектори, експресиращи HIV-1 gag, pol и nef гените [275,276]. Векторите са безопасни, имуногенни и добре поносими. За съжаление полученото клинично изпитване STEP трябваше да бъде преждевременно спряно [277–279]. Не само е доказано, че тази ваксина не предпазва от ХИВ инфекция, но епидемиологичните данни предполагат, че ваксинацията с Ad в този случай повишава риска от ХИВ инфекция [280–282]. Наличието на съществуващ имунитет срещу Ad5 беше идентифицирано като потенциален рисков фактор след ваксинация [283,284]. Въпреки това, това наблюдение не е потвърдено в подобни проучвания [285,286] и остава механично неясно [287,288]. Освен ХИВ, базирани на реклами векторни ваксини са разработени в борбата срещу ебола (Ad-EBOV), повтаряща се заплаха в Западна Африка [289]. Всички ваксини Ad-EBOV използват гликопротеина на ебола (GP) като антиген на ваксината. Първоначалните предклинични изпитвания при гризачи и примати използват Ad5 и показват защита в продължение на 3 месеца с производството на неутрализиращи антитела и CD8 плюс активиране [273,290–292]. Тази ваксина е преминала фаза II на клинично изпитване; въпреки това съществуващият имунитет към Ad5 във ваксинираната популация е довел до вариации в нивото на предизвикани неутрализиращи антитела [293–297]. За да се преодолее този проблем, са разработени ваксини, базирани на по-малко разпространения вид D Ad26 [186,298,299].

Въпреки това, Ad26 е по-малко имуногенен при хора, което води до намалена ефективност на ваксинацията и изисква основно усилване с помощта на ваксина, базирана на вируса на морбили (MVA). Този режим на ваксиниране е достигнал фаза III на клинични изпитвания [289,300,301]. Използването на нечовешки рекламни вектори също е в процес на разработка [184]. Използването на ChAd3 от шимпанзе като платформа за ваксина срещу EBOV показа защита при гризачи и шимпанзета [302,303], а клиничните изпитвания, използващи тези вектори, са на различни етапи на развитие [17,300,301,304–306].

Доскоро ваксините срещу ХИВ-1 и EBOV бяха двата основни примера за прилагане на ваксини, базирани на рекламен вектор, но те не са единствените. Правени са различни опити за използване на вектори на Ad ваксина срещу различни патогени като Mycobacterium tuberculosis [307–310], вирус на денга [311–313], хепатит B и C [314–320], бяс [321–324] или грип [325–328]. Въпреки това, тяхната ефикасност винаги е била под очакванията (за повече подробности вижте [18,142,300,329]). Кандидатът за ваксина EBOV остава единствената практически приложена Ad ваксина и се използва с някои ограничения в Демократична република Конго. Тази ваксина е базирана на типа Ad26 (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO) и към май 2020 г. 20 339 души са получили първата доза ваксинация, а 9560 са били напълно ваксинирани [230 301 330].

Аденовирус-векторизираните ваксини получиха голям обществен тласък в отговор на пандемията от SARS-CoV-2. Неотложността на ситуацията направи възможно да се извлече полза от тяхното развитие, включително опита, натрупан с ваксини, създадени срещу коронавируси, които са причинили предишни регионални огнища на SARS-CoV-1 [331]. Коронавирусният шип (S) гликопротеин е идентифициран като най-добрият антиген на ваксината за имунитет към коронавирусни инфекции [332,333]. Към днешна дата четири Ad векторни ваксини, всички кодиращи шиповия антиген, са в напреднало състояние и са разрешени за спешна употреба в големи части на света. Приложените векторни стратегии са малко по-различни, но по същество включват използването на вектори от първо поколение. Те варират от използване на вектори, базирани на вид C Ad5- (Ad5-nCoV), преодоляване на съществуващ имунитет с висока векторна доза (CanSino) [187,334], до използването на по-малко разпространен вирус на вид D Ad26, като се използва стабилизиран пиков гликопротеин (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Алтернативен подход използва ChAdOx1-S-(AZD1222), Ad вектор от шимпанзета [336,337]. Единствената използвана ваксина, базирана на хетероложна стратегия за първично усилване за преодоляване на векторния имунитет (Gam-COVIDVac/Sputnik V), прилага първо базиран на Ad26- вектор и след това в бустерната инжекция използва вектор Ad5 [338,339]. Във всички случаи данните от клиничните изпитвания са много обещаващи, показвайки високи нива на индуциран защитен имунитет и в няколко държави е разрешено спешно използване за използването на базирани на реклами ваксини. Освен това епидемиологичните проучвания на текущите кампании за ваксиниране в различни страни предполагат огромен успех при използването на базирани на реклами ваксини срещу SARS-CoV-2.

4. Модулиране на аденовирусната (ваксина) векторна ефикасност, капсидът води пътя

Дизайнът на вектора на аденовирус (ваксина) трябва да вземе предвид няколко фактора. Те включват поддържане на продължителна и продължителна експресия на кодирания антиген и активиране на имунологичен контекст (адювантен ефект), който позволява ефикасно преобразуване на експресията на антиген в постоянен адаптивен имунитет, насочен срещу имуногена, но не и срещу самия вектор. Имунологичният контекст се осигурява от вроденото имунно активиране, което векторът на ваксината предизвиква по време на приложение. В този контекст ефективността, с която вродените имунни сензори откриват вектора, е важна и от своя страна ще определи амплитудата на адаптивния отговор. Както е описано в разделите по-горе, вроденото имунно усещане се осъществява главно на ниво след влизане, съпътстващо проникването на Ad ендозома. Ефективната експресия на антигена (ваксина) зависи тогава от баланса между нивото на изчистване на вектора спрямо успешното доставяне и експресия на векторни геноми към ядрото. С развитието на капсидни дисплейни вектори, експресията на трансгена не е необходима за предизвикване на имунно активиране. Тази стратегия се основава на вмъкването на представляващ интерес епитоп в Ad капсидните протеини, което позволява директното му излагане на имунната система. Дори ако този подход има някои предимства, повечето вектори на ваксини разчитат на генетично кодирани гени. За допълнително четене относно капсидните дисплейни вектори, моля, вижте тези прегледи, [340,341].

Съществуващият имунитет срещу вирусен вектор (напр. 30–90 процента срещу вида C вирус Ad5, в зависимост от географското местоположение) може да намали усвояването на вектора и да намали експресията на антиген и произтичащия имунен отговор [342–344]. Разработени са няколко стратегии за намаляване на анти-векторния имунитет и наскоро бяха прегледани [249]. Накратко, неутрализиращите антитела разпознават главно хиперпроменливата верига от екзони и като следствие са специфични за серотипа [178–180]. Следователно тези хиперпроменливи бримки могат да бъдат заменени с тези на друг, по-малко разпространен серотип [178,345]. Това предотвратява неутрализирането и инактивирането на вектора. Тъй като Ad5 е най-сероразпространеният тип, използването на редки серотипове като Ad26, Ad35 или нечовешки Ads също ще избегне този проблем [177,346–350].

Въпреки това, основен недостатък на използването на редки видове е тяхната по-ниска имуногенност, което ги прави по-малко ефективни по отношение на разработването на ваксини [298]. Следователно, стратегиите за намаляване на анти-векторния имунитет трябва да бъдат разработени успоредно със стратегиите за повишаване на векторната имуногенност, за да се получи най-ефективният вектор. Дори ако първоначалното ниво на неутрализиращи антитела срещу вектора е ниско, ваксинирането с даден тип вектор може да предизвика отговор, който предотвратява бъдещата му употреба. Подготвянето на анти-векторния отговор също се извършва на ниво след влизане, когато векторните частици се сортират и обработват като самите антигени. Извличането на имунологично благоприятен контекст за успех на ваксинацията може да дойде за сметка на повишеното зареждане за векторен имунитет. Разбирането на параметрите, които определят съдбата на рекламните вектори след приемането, може да предостави възможност за векторен дизайн.

4.1. Стабилността е във вида

Рецепторно-медиираното поглъщане и излизане от ендо-лизозомния компартмент са отличителни белези на Ad инфекцията и векторната трансдукция. Първоначалното поемане се определя от взаимодействието на вирусните влакна и молекулите на пентона с клетъчните рецептори. Фибрите и пентоните са общи за всички реклами, но според техния вид те се ангажират с различни клетъчни рецептори (Таблица 1). Вирусите от вид C използват CAR и навлизащите частици излизат от ранен ендозомален компартмент [79]. Ако вирусите от вид C (Ad5) са проектирани да съдържат влакнеста молекула от вирус от вид B (Ad16), получената частица (Ad5F16) след това излиза от лизозомно отделение (както е показано чрез оцветяване с лизозомния маркер LAMP1) вместо от ранния ендозома [351]. Това забавено бягство от лизозомите е характеристика, споделена с всички тествани вируси от вид B [111,352,353].

Освен това, хибридният Ad5F16, както и вирусите от вид B предизвикват по-силен провъзпалителен отговор от вирусите от вид C [159,351]. Това се дължи на повишеното откриване чрез интралуминален TLR9 в имунните клетки [354]. В допълнение, увреждането на лизозомната мембрана, за разлика от ранното увреждане на ендозома, причинява силен оксидативен стрес. Разкъсването на лизозома освобождава съвместно лизозомни хидролази като катепсин В, които могат да увредят митохондриите, като по този начин усилват реакцията на увреждане чрез активиране на инфламазома [355–357]. Процесът на поемане на Ad дестабилизира капсида, позволявайки освобождаването на вирусния протеин VI [103,106]. След това освободеният протеин VI прониква през мембраната от ендо-лизозомния компартмент, за да позволи на вируса да получи достъп до цитозола. Сравняването на видовете C и B показва, че и двата вируса са еднакво ефективни при навлизане в цитозола и доставяне на генома, но се различават по своята кинетика на бягство [111]. Фактът, че обикновена смяна на влакна може да прехвърли влизането и имуногенните свойства от вируса на вид B към вируса на вид C, е забележителен. Той предоставя доказателство за концепцията, че могат да бъдат проектирани хибридни вектори със специфични свойства. Основната разлика изглежда е, че освобождаването на протеин VI се забавя при вирусите от вид B (или хибридния вирус) и може да изисква подкисляване или друг, неизвестен тригер за разглобяване.

Тъй като освобождаването на протеин VI се забавя в този случай, това може да отразява повишена стабилност на капсида. В действителност е показано, че видове C Ad5 вируси освобождават влакнеста молекула при клетъчно свързване, стъпка, за която се предполага, че отслабва капсида и започва процеса на разглобяване за освобождаване на протеин VI. В този контекст е доказано, че Ad5 без влакна е по-малко стабилен от естествените частици [358]. Обратно, незрелите, хиперстабилни Ts1 Ad2/5 не освобождават фибри или протеин VI и са лоши индуктори на възпаление, тъй като те нито задействат TLR9, нито причиняват увреждане на мембраната [114,138,359,360].

Дали смяната на влакна с вид B предотвратява първоначалното освобождаване на влакна и прави капсида на вида C по-стабилен не е изследвано, но е вероятно. Стабилността на капсида може да бъде съществен фактор за съдбата на капсида след влизане и, като разширение, характеристика, която може да бъде използвана за дизайн на вектор. Вирусите от вид B може да са по-стабилни поради използването на различен рецептор или чрез уникално взаимодействие влакно-пентон. Обратно, видовете F вируси Ad40/41 заразяват стомашно-чревния тракт и имат повишена капсидна стабилност поради техния тропизъм и тяхната адаптация към суровата чревна среда [24,361]. Червата имат присъща температура, която е с няколко градуса над горните дихателни пътища, насочени към вируси от вида C (37 ◦C срещу 33 ◦C) [362]. По този начин, Ad40/41 са по същество по-термостабилни, поддържайки процеса на инфекция [24], което ги прави също трудни за размножаване [24,361,363].

Освен това им липсва RGD мотив в молекулата на пентона, което води до допълнително намалено навлизане в клетката [92]. Не е известно дали тези уникални капсидни свойства се превръщат в бягство от лизозомно отделение или частично разглобяване/дефекти на освобождаване на протеин VI при влизане. Обратно, тези свойства могат да осигурят контекст за разработването на приложения за орална ваксина. За разлика от влакната от вид B, векторите, съдържащи влакна от вид F, имат намалено имунно активиране [364], когато се прилагат при стандартни условия на околната среда. Ако даден човешки Ad вид сега бъде изваден от контекста и използван като вектор на ваксина, може да си струва да разгледаме естествения тропизъм на този вектор, за да потърсим улики за прогнозиране на поведението му. Използваният в момента ваксинен вектор на базата на Ad26 е вирус от вид D и неговият естествен тропизъм са очите и стомашно-чревния тракт [365]. Вид D вируси, включително Ad26, са по-малко имуногенни от Ad5 [366] и е показано, че преминават към късния ендозомален компартмент, вероятно включващ забавено освобождаване на протеин VI.

Следователно, блокирането на подкисляването на късния ендозомален компартмент допълнително намалява неговата имуногенност [113]. За разлика от човешките реклами, познанията за нечовешките реклами, използвани също при ваксиниране и векторизация, са много ограничени. Рекламите, получени от шимпанзета, включително ChAd3, са тясно свързани с вируси от вид D [367,368]. Интересното е, че Ad5 векторите са по-имуногенни от получените от шимпанзета Ad вектори и имат по-висок трансдукционен потенциал. Това наблюдение не е свързано с разликите в пентоновия RGD мотив или влакното и неговата механична причина остава неизвестна [369]. Потенциалните разлики в стабилността на капсида не са изследвани. Друг нечовешки Ad, използван като вектор, е кучешкият Ad тип 2 (CAV-2). Този вектор има забележителното свойство да трансдуцира неврони селективно, но не и околните глиални клетки, за разлика от контролен вектор Ad5, въпреки че и двата вектора използват един и същ рецептор [370–372]. Тази способност може да бъде свързана с повишена стабилност на капсида, позволяваща премахване на покритието само в невронни клетки. Кучетата имат телесна температура, която е ~2 ◦C по-висока от тази на хората, което потенциално води до повишена стабилност на CAV-2 капсида [373], аналогично на вида F вируси. CAV-2 слабо предизвиква вроден имунен отговор, в съответствие с липсата на ефективно разглобяване в прицелните клетки [372]. По този начин CAV2 векторите могат да бъдат друг пример, при който биофизично свойство, свързано с неговия естествен тропизъм или гостоприемник, има потенциала да осигури нови векторни свойства.

4.2. Фина настройка на капсидната структура, примерът за протеин VI във вид C Ad2/5

Ако стабилността на капсида и освобождаването на протеин VI определят съдбата на вирусния капсид надолу по веригата, възниква въпросът дали това може да бъде модифицирано в Ad векторите, т.е. да се припишат нови свойства на вирусните вектори (Фигура 3). По-голямата част от нашето разбиране за това как Ads проникват в ендо-лизозомния компартмент идва от вида C вируси Ad2/5. Откриването на протеин VI като мембранен литичен фактор беше от съществено значение за разбирането на този процес [103,106]. Протеин VI кодира N-терминална амфипатична спирала, която е действителната мембранна литична част на протеина. По време на производството на вирус, протеин VI се експресира като прекурсорен протеин, който се свързва с хексонови тримери чрез амфипатичната спирала [42,374]. Комплексът се внася в ядрото чрез транспортни сигнали, кодирани в N- и С-края на протеин VI, които се отстраняват по време на сглобяването и узряването на вируса от вирусната протеаза. С-терминалният 11 аминокиселинен пептид също активира протеазата, осигурявайки интелигентен начин за свързване на сглобяването на вируса с екранирането на амфипатичната спирала. Мутантният вирус Ts1 Ad2/5 има дефект в опаковката за протеазата и нито един от капсидните протеини, включително протеин VI, не се обработва. Получените частици са свръхстабилни, задържат влакна и не разгръщат протеин VI.

Като следствие, Ts1 частиците се сортират в лизозоми при рецептор-медиирана ендоцитоза. Точното местоположение на протеин VI в зрелия вирус не е ясно, но разцепеният N-край се локализира към вътрешната повърхност на хексон на периперсоналните екзони [37,104,375]. Показано е, че две точкови мутации в протеин VI, G33A и S28C повишават стабилността на Ad5 капсида (Фигура 3A) [376,377]. Първият мутант предшества N-терминалното място на разцепване на протеаза в протеин VI и нарушава обработката. Получените частици са частично незрели и се характеризират с дефект на ендозомен лизис, което предполага, че N-краят на протеин VI стабилизира интра-вирионните протеин-протеинови взаимодействия [376]. Вторият мутант е избран заради способността му да образува вътрешномолекулни дисулфидни мостове [377].

Вирусът съдържа частично непреработени протеини, потенциално включващи протеин VII, но изненадващо не показва никакви дефекти на инфекциозност, въпреки повишената му стабилност. Не е известно дали някой от вирусите има променен профил на имунно активиране. Друга точкова мутация в протеин VI, която засяга съдбата на вируса, е мутацията на протеин VI L40Q, директно разположена в амфипатичната спирала (Фигура 3A) [378,379]. Вирусите с тази мутация узряват нормално, но са частично дефектни за етапа на ендозомен лизис. За разлика от гореспоменатите мутанти, L40Q вирионите са по-малко стабилни от техните двойници от див тип. Вместо забавяне, протеин VI, както и пентон, се освобождават преждевременно от капсида L40Q. Вирионите L40Q са по-малко инфекциозни и подлежат на частично лизозомно сортиране. Въпреки това, L40Q мутацията не премахва напълно мембранния лизис и някои вируси излизат в цитозола, което води до обща ~ четирикратно намалена инфекциозност на L40Q вектор [379,380]. Наблюденията показват, че амфипатичната спирала допринася със своето взаимодействие за стабилността на частиците. Не е известно дали и как L40Q мутацията променя имуногенното свойство на Ad5 векторите. Последните наблюдения показват, че освобождаването на протеин VI от капсида се задейства от вътрешна конкуренция с протеин VII за едни и същи или припокриващи се места на свързване в екзони [375].

Последователно мутантен вирус, лишен от протеин VII, не успява да излезе от ендозома и има дефект в ендозомен лизис [58]. По-нататъшното разбиране на структурната и динамична организация на вътрешния капсид (т.е. протеин VI) и основните протеини (т.е. протеин V и VII) в частицата и по време на влизането в клетката значително ще помогне да се разбере какво определя (обратимата) стабилност на капсида.

Контролирането на ефективността на имунното активиране на Ad векторите е основен интерес за разработването на ваксини и разширяването на MHC представянето на антигени би подобрило разработването на ваксини [381]. Както бе споменато по-рано, аутофагията регулира имунната активация и захранва пептиди към МНС. Автофагията е един от най-старите клетъчни защитни механизми срещу инфекция, но Ads, като адаптирани човешки патогени, не са развили механизми за избягване на автофагия при влизане. Вместо това те изглежда приемат активирането на автофагията и отклоняват отговорността към насърчаване на инфекцията. Протеин VI играе централна роля в контролирането на автофагичния отговор на клетката. Лизисът на аденовирусната мембрана от протеин VI води до набирането на галектин 3 и галектин 8, които се разпознават от клетката като сигнали за опасност (Фигура 3B) [108,109,382]. Откриването на местата за проникване на Ad от галектини активира селективна аутофагия в заразената клетка, както е илюстрирано от набирането на рецептори за аутофагия (напр. NDP52 и p62) и образуването на точки на LC3 [108].

Интересното е, че векторните частици Ad5 успяват да избягат от разкъсаната ендозома и могат да се придвижат до ядрото. Инхибирането на автофагията не засяга вирусната инфекциозност, но забавя доставката на техния геном до ядрото, показвайки, че рекламите отвличат клетъчните машини за своя печалба [108]. Следователно бягството от ендозома позволява на вируса да избегне разграждане чрез автофагия чрез активен процес. Този процес е открит от още един мутант на протеин VI, мутант M1. Всички човешки реклами (и няколко нечовешки реклами) кодират силно запазен PPxY пептиден мотив в протеин VI. В M1 мутанта този мотив беше променен на PGAA (Фигура 3) [104]. Както дивият тип, така и M1 мутантът ефективно освобождават протеин VI при влизане и предизвикват аутофагия след разкъсване на ендозомалната мембрана. Въпреки това, M1 мутантният вирус не е в състояние да избяга ефективно в цитозола и EM изображенията показват, че M1 мутантните вируси са хванати в капан в разкъсани ендозоми, насочени към автофагия.

Следователно е показано, че мутантният вирус M1 има силен дефект на инфекциозност, който се възстановява при фармакологично и генетично инхибиране на аутофагията. Проучването показа, че вирусите от див тип използват техния PPxY мотив, за да наемат убиквитин лигазата NEDD4.2 и да ограничат узряването на автофагозомите достатъчно дълго, за да избягат в цитозола. Освен това, това свойство позволява на вируса да ограничи своето антигенно представяне [108]. Важно е, че M1 мутантният вектор, инжектиран в мишки, води до много по-силен анти-векторен имунитет и намален CD8 плюс отговор към кодирания трансген, показвайки, че простата промяна на капсида може да има дълбоко въздействие върху имуногенността на Ad5 капсида. Не е известно дали някоя от другите мутации на протеин VI засяга имуногенността. Въпреки това, наличието на PPxY мотив във вируса L40Q може да обясни защо векторът запазва относително висока инфекциозност въпреки дефекта на мембранния лизис [379,380]. Тъй като ендозомният лизис е по-малко ефективен и L40Q векторите завършват отчасти в лизозомния компартмент, възможно е предизвиканият имунен отговор да е различен от див тип, Ts1 или M1 Ad5 капсиди.