Неструктурният протеин 4B на вируса Zika взаимодейства с DHCR7, за да улесни вирусната инфекция

РЕЗЮМЕ

Вирусът Zika (ZIKV) развива неструктурни протеини, за да избегне имунния отговор и да осигури ефективна репликация в клетките гостоприемници. Наскоро беше съобщено, че холестеролният метаболитен ензим 7-дехидрохолестерол редуктаза (DHCR7) влияе върху вродените имунни отговори при ZIKV инфекция. Въпреки това, жизненоважният неструктурен протеин и механизмите, включени в DHCR7-медиираното вирусно избягване, не са добре изяснени. В това проучване ние демонстрирахме, че ZIKV инфекцията улеснява експресията на DHCR7. Трябва да се отбележи, че повишеният DHCR7 на свой ред улеснява ZIKV инфекцията и блокирането на DHCR7 потиска ZIKV инфекцията. Механично, ZIKV неструктурният протеин 4B (NS4B) взаимодейства с DHCR7, за да индуцира експресия на DHCR7. Освен това, DHCR7 инхибира фосфорилирането на TANK-свързваща киназа 1 (TBK1) и интерферон регулаторен фактор 3 (IRF3), което води до намаляване на производството на интерферон-бета (IFN-) и интерферон-стимулирани гени (ISG). Следователно, ние предлагаме ZIKV NS4B да се свърже с DHCR7, за да потисне активирането на TBK1 и IRF3, което от своя страна инхибира IFN- и ISG, като по този начин улеснява избягването на ZIKV. Това проучване разширява прозренията за това как вирусните неструктурни протеини антагонизират вродения имунитет, за да улеснят вирусната инфекция чрез метаболитни ензими на холестерола и междинни продукти.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

1. Въведение

Като флавивирус, пренасян от комари, вирусът Zika (ZIKV) първоначално е идентифициран от макак резус в Уганда през 1947 г. Претърпяла няколко огнища в световен мащаб, епидемията от ZIKV се превърна в кумулативна глобална заплаха за здравето поради експлозивното разпространение по пътищата на комарите, световното пътуване на асимптоматични преносители и предаване по полов път. Повечето ZIKV инфекции в минали епидемии са били асимптоматични или леки (Wang et al., 2016), но в последните няколко епидемии ZIKV инфекцията е довела до опустошителни заболявания, включително неврологични последствия по време на бременност (микроцефалия и смърт на плода) и неврологични разстройства (синдром на Guillain-Barre) при възрастни (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson and Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). Вродената имунна система е първата и критична линия на имунната защита на гостоприемника срещу вирусна инфекция. След ZIKV инфекция, вирусната РНК се разпознава от интрацелуларен индуцируем от ретиноева киселина ген I (RIG-I) (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006), който инициира низходящия вроден имунен реакции, включително активиране на TANK свързваща киназа 1 (TBK1), фосфорилиране на интерферон регулаторен фактор 3 (IRF3) и след това водещо до производство на интерферони тип I (IFN-I) (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016; Xia et al., 2018) и експресията на десетки интерферон-стимулирани гени (ISG) с различни антивирусни ефекти (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Имунната система на гостоприемника произвежда IFN и ISG, за да ограничи вирусната инфекция, но самият ZIKV е развил различни механизми за бягство, за да осигури успешно оцеляване и репликация в клетката гостоприемник, като например кодиране на специфични неструктурни (NS) протеини. Геномната РНК на ZIKV генерира седем неструктурни протеина, включително NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5 (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 набира деубиквитиназа USP8 на гостоприемника, за да стабилизира каспаза-1 и отслабва сигнализирането на IFN тип I, за да облагодетелства ZIKV инфекцията (Zheng et al., 2018). Съобщава се, че мутант NS1 се свързва с TBK1 и намалява фосфорилирането на TBK1, което води до намалено производство на IFN (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 се свързва и изолира човешки скелетни протеини (14-3-3ε и 14-3-3η) (Riedl et al., 2019), докато NS4A взаимодейства с MAVS, за да атенюира RIG-I- и MDA{{50} }медиирани вродени имунни отговори (Ma et al., 2018). По-специално, ZIKV NS5 свързва и разгражда преобразувателя на сигнала и активатора на транскрипция 2 (STAT2), за да отслаби сигнализирането на IFN тип I (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). Освен това е доказано, че NS5 взаимодейства с RIG-I и потиска K63-свързаното полиубиквитиниране на RIG-I, като по този начин потиска производството на IFN (Li et al., 2020). Освен това е доказано, че ZIKV NS2A, NS2B, NS4A и NS4B преодоляват производството на IFN чрез насочване към дискретни елементи в пътя на RIG-I (Xia et al., 2018). За да се постигне ефективна репликация в клетките на бозайници, ZIKV също разчита на липидните метаболитни компоненти на клетката гостоприемник, за да образува обвивка и пълно сглобяване на вирусни частици (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). Холестеролът е един от липидните компоненти на клетъчните мембрани и участва в множество биологични функции (Ikonen, 2008). Хомеостазата на клетъчния холестерол е тясно модулирана от синтеза на холестерол, включително абсорбцията от липопротеиновите частици и освобождаването към извънклетъчните акцептори. На практика всички клетки на бозайници са зависими от метаболизма на холестерола (Luo et al., 2020). Натрупващите се доказателства показват, че метаболизмът на холестерола участва във вродения имунен отговор срещу вирусна инфекция (Blanc et al., 2013; Petersen et al., 2014; York et al., 2015). При вирусна инфекция синтезът на холестерол е значително променен и придружен от повишена експресия на IFN-I и ISG в макрофагите (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). Като ключов ензим в метаболизма на холестерола, холестерол-25-хидроксилазата (CH25H) превръща холестерола в 25-хидроксихолестерол (25HC), който е идентифициран като биологичен продукт, който допринася за вродения имунен отговор срещу голямо мнозинство на вируси, включително човешки имунодефицитен вирус 1 (HIV-1), вирус на везикуларен стоматит (VSV), вирус на херпес симплекс 1 (HSV-1), вирус на ебола (EBOV), ZIKV, миши гама херпесен вирус ( MHV68), вирус на треска от долината на Рифт (RVFV) и вирус на руски пролетно-летен енцефалит (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). Текущите проучвания са ограничени в изследването как метаболитните продукти на холестерола (напр. 25HC) могат да манипулират сигналната трансдукция и да участват във вродения имунитет. Към днешна дата ензимите или междинните продукти преди биосинтезата на холестерола все още не са добре изяснени. Като жизненоважен метаболитен ензим на холестерола, 7-дехидрохолестерол редуктазата (DHCR7) може да изтрие двойната връзка С (7-8) в В пръстена на стеролите и да катализира холестерола от 7-дехидрохолестерола ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-DHC също е предшественик на витамин D и мутациите на DHCR7 са свързани с по-високи нива на витамин D, което предполага, че DHCR7 показва сложни биологични ефекти при превръщането на холестерола и витамин D (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016a). Добре представено проучване показа, че мълчанието на DHCR7 може да активира пътя на PI3K-AKT3, водещ до фосфорилиране на IRF3 Ser385 и насърчаване на производството на IFN за инхибиране на множествена вирусна инфекция in vitro и in vivo (Xiao et al., 2020). Обаче, разбирането на DHCR7-медиирания метаболизъм на холестерола при ZIKV NS протеиново медиирано имунно избягване е слабо дефинирано. Тук ние изясняваме различен механизъм, който ZIKV NS4B е насочен към DHCR7, ключов ензим в синтеза на холестерол, за отслабване на IFN-I отговора и улесняване на ZIKV инфекцията. Открихме, че ZIKV инфекцията повишава експресията на DHCR7. Интересното е, че подобреният DHCR7 насърчава ZIKV инфекцията, докато събарянето или насочването на DHCR7 с инхибитори може да потисне ZIKV инфекцията. Освен това, ZIKV NS4B може да свърже DHCR7 и по този начин да индуцира експресия на DHCR7, което инхибира активирането на TBK1 и IRF3 и води до намалено производство на IFN- и ISG. Следователно, ние предлагаме свързването на ZIKV NS4B с DHCR7 да намалява активирането на IRF3, което от своя страна инхибира IFN- и ISG, за да улесни избягването на ZIKV. Това проучване разширява новите прозрения за това как ZIKV неструктурният протеин премахва вродения имунитет, за да улесни вирусната инфекция чрез взаимодействие с метаболитните ензими на холестерола.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Материали и методи

2.1. Клетъчни линии

U251 клетки бяха закупени от Китайския център за събиране на типови култури (CCTCC) (Ухан, Китай). Клетки от бъбрек на Cercopithecus aethiops (Vero), клетки от човешки ембрионален бъбрек (HEK 293T) и клетки от човешки белодробен аденокарцином (A549) бяха закупени от Американската колекция от тъканни култури (ATCC). Клетките се поддържат в модифицирана среда на Dulbecco Eagle Medium (DMEM) (Gibco), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS) (Gibco), пеницилин (100 U/mL) и стрептомицин сулфат (100 ug/mL) при 37 °C и 5 % CO2. Клетките на Aedes albopictus (C6/36) се култивират в минимална есенциална среда (MEM), допълнена с 10% FBS, пеницилин (100 U/mL) и стрептомицин сулфат (100 ug/mL) при 28 °C с 5% CO2.

2.2. ZIKV амплификация, титруване и инфекция

ZIKV изолатът z16006 (GenBank номер за достъп, KU955589.1) се култивира в C6/36 клетки и ZIKV се разделя на аликвотни части във флакони за замразяване и се съхранява при 80°С. ZIKV титрите се измерват чрез анализ на плака. Клетките бяха заразени с ZIKV при посочената множественост на инфекцията (MOI) в продължение на 2 часа, последвано от промиване с фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS) и след това култивирани, събрани и изследвани.

2.3. Плазмиди и реактиви

Експресионният плазмид pcDNA3.1(þ)-3 Flag се използва за клониране на отделни ZIKV гени от съответните фрагменти на ZIKV cDNA. За да се конструира pGEX6p-1-NS4B, ZIKV NS4B беше субклониран в pGEX6p-1 вектор с помощта на ClonExpress II комплект за клониране в една стъпка (Vazyme Biotech, Nanjing, Китай). cDNAs, кодиращи човешки DHCR7, RIG-I, TBK1 и IRF3, клонирани в pCAGGS-HA вектор или pcDNA3.1 (þ)-3 Flag вектор, бяха конструирани чрез стандартен метод на молекулярно клониране. Мисенс мутацията G410S на DHCR7 е конструирана чрез използване на метода на сайт-насочена мутагенеза. Моноклонален заешки анти-ZIKV плик (GTX133314) е закупен от GeneTex (Ървайн, Калифорния, САЩ). Заешко поликлонално анти-DHCR7 (A8049), заешко моноклонално анти-ISG15 (A2416), заешко моноклонално анти-TBK1 (A3458), заешко моноклонално анти-P-TBK1 при Ser172 (AP1026), заешко поликлонално анти-IRF3 (A11118), анти -заешки IgG (ac005) и анти-миши IgG (ac011) са закупени от ABclonal Technology (Wuhan, China). Антимиши FITC и анти-заешки Cy3 вторични антитела бяха закупени от Abbkine (Wuhan, Китай). Заешко моноклонално анти-P-IRF3 при Ser396 (29047S) и заешко моноклонално анти-ISG56 (14769S) бяха закупени от Cell Signaling Technology (CST, Бостън, Масачузетс, САЩ). Миши моноклонален анти-Flag (F3165), заешки моноклонален анти-HA (H6908) и миши моноклонален анти-GAPDH (G9295) са закупени от Sigma (Сейнт Луис, МО, САЩ). Миши моноклонални антиген-антитела на антифлавивирусна група (MAB10216) бяха закупени от Millipore (Масачус, САЩ). Липофектамин 2000 (11668-027) и Тризол (15596018) са закупени от Invitrogen Corporation (Карлсбад, Калифорния, САЩ). Poly (I: C) е закупен от InvivoGen (Сан Диего, Калифорния, САЩ).

2.4. Анализ на плака

Супернатантът, съдържащ ZIKV, се разрежда с DMEM без серум и се инфектират Vero клетки в 12-плака с ямки за 2 часа, последвано от промиване с 1 mL PBS два пъти. DMEM, съдържащ 2% FBS и 2% агароза с ниска точка на топене, се смесват добре в съответствие с обемно съотношение 1:1 и към всяка ямка се добавя 1 mL смес. Заразените клетки се култивират при 37 ° С с 5% CO2 в продължение на 5-7 дни. Клетките се фиксират с 4% параформалдехид за 1 час и се оцветяват с 0.5% кристално виолетово за 30 минути. 12-Плаката с ямки се промива с вода и се изчисляват плаките.

2.5. Производство и инфекция на лентивирус

Прицелните последователности на shRNA за човешкия DHCR7 бяха както следва: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. Векторът pLKO.1, носещ разбъркана shRNA за отрицателна контрола (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) или специфичната целева последователност беше трансфектиран в клетки HEK293T заедно с psPAX2 и pMD2.G с липофектамин 2{{19} }00. Вирусни частици, съдържащи супернатанти, се събират 36 часа след трансфекцията и след това се центрофугират при 210 g за 10 минути. Безклетъчната супернатантна фаза се филтрува през 0.45 μm филтър за отстраняване на клетъчните остатъци. U251 клетки бяха заразени с лентивирусни частици в присъствието на 8 ug/mL полибрен. След 48 часа култура, U251 клетки бяха избрани с пуромицин (2 ug/mL, Sigma). Ефективността на нокдаун на sh-DHCR7 се определя чрез RT-PCR и Western blot анализ.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

2.6. Western blot

Клетките се лизират с RIPA буфер, допълнен с протеазни инхибитори и фосфатазни инхибитори върху лед за 1 час, след което се центрофугират при 4°C, 13,000 g за 1{{10}} min за събиране на клетката лизат. Концентрацията на протеин в клетъчния лизат се измерва чрез протеинов анализ на бицинхонинова киселина (BCA). Протеинът се разделя чрез SDS-PAGE и след това се прехвърля върху мембрана от поливинил дифлуорид (PVDF). PVDF мембраната беше блокирана с имуноблотинг блокиращ буфер TBST (10 mmol/L Tris-HCl, рН 7.4, 0.15 mol/L NaCl и 0.05% Tween-20), съдържащ 5% BSA за 1 час. След промиване с TBST, мембраната се инкубира с първични антитела и втори антитела и впоследствие се открива с помощта на хемилуминесцентна система за изображения (Bio-Rad).

2.7. Анализ на общия холестерол

Общият холестерол в клетките се открива чрез използване на комплект за анализ на общ холестерол в тъканите от Applygen Technologies Inc. (Пекин, Китай). Стандартът от 5 mmol/L холестерол се подлага на серийно разреждане с безводен етанол, за да се начертае стандартната крива, и количествата общ клетъчен холестерол се изчисляват съгласно стандартните криви. Експериментът беше проведен по процедурата, предоставена от производителя.

2.8. Ко-имунопреципитационни анализи

HEK293T клетки бяха трансфектирани с посочените плазмиди. Клетките бяха събрани и лизирани с RIPA лизисен буфер, допълнен с протеазни инхибитори. След центрофугиране при 18, 000 g за 15 минути при 4°С, клетъчните лизати бяха събрани и имунопреципитирани от Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) в продължение на 4 часа при 4°С. Свързаните протеини се елуират с 2 зареждащ буфер и се анализират чрез имуноблотинг.

2.9. PCR в реално време

Общите РНК се екстрахират от клетки с помощта на TRIzol реагент (Invitrogen Life Technologies) и cDNA се произвежда с M-MLV комплект за обратна транскриптаза (Promega, Madison, WI, USA). RT-PCR се извършва с помощта на SYBR RT-PCR комплекти (DBI Bio-science) на Roche LC480. mRNA на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) беше зададена като ендогенна референция за нормализиране на mRNA и нивата на генна експресия бяха изчислени с помощта на метода 2 ΔΔCT. Последователностите на RT-PCR праймери са показани в допълнителна таблица S1. 2.10. Конфокална микроскопия

Клетките U251 се трансфектират с плазмид и се култивират в продължение на 3 0 часа, след което се промиват три пъти с PBS. Клетките се фиксират с 4% параформалдехид за 15 минути и се просмукват с PBS, съдържащ 0,1% TritonX -100 за 5 минути. След промиване с PBS, клетките се запечатват с PBS, съдържащ 5% BSA за 30 минути. Клетките се промиват три пъти с PBS и се инкубират с анти-НА, анти-FLAG и анти-флавивирус, след това се инкубират с анти-миши FITC и анти-заешки Cy3 вторични антитела. Клетките се оцветяват с 40,6-диамидино-2-фенилиндол дихидрохлорид (DAPI) и се извършват с помощта на конфокален микроскоп Olympus.

2.11. GST падащи тестове

Плазмидът pGEX6p-1-NS4B се трансфектира в Escherichia coli (Е. coli) щам BL21. GST и GST-NS4B бяха индуцирани от IPTG с крайна концентрация от 0.5 mmol/L, и културите бяха отгледани за допълнителни 6-8 часа при 37 C. И след това GST протеинът и GST- NS4B протеин се пречиства от Е. coli бактерии. Протеинът GST или GST-NS4B се инкубира с перли от глутатион сефароза (Novagen) и се промива три пъти с PBS. GST и GST-NS4B протеин се инкубират с еукариотния слят протеин HA-DHCR7, който произхожда от плазмиди, кодиращи HA-DHCR7-експресирани HEK293T клетъчни лизати в продължение на 4 часа при 4°С. Утайките се промиват пет пъти, кипват се в 2 SDS зареждащ буфер и се открива чрез Western blot с анти-GST и анти-HA антитела.

2.12. HA-DHCR7 сайт-насочена мутагенеза

Подходящи двойки мутагенни праймери (допълнителна таблица S1) бяха синтезирани и използвани за генериране на мутиралата конструкция чрез PCR. HA-DHCR7 беше използван като шаблон за PrimeSTAR® HS Premix (Takara). След PCR, плазмидът от див тип, останал в PCR продукта, се смила селективно от DpnI (New England Biolabs). Усвоеният PCR продукт се трансфектира в Е. coli щам DH5. Желаният мутант беше потвърден чрез анализ на последователността на Sanger.

растение цистанче, повишаващо имунната система

2.13. Статистически анализ

Всички експерименти бяха повторени поне три пъти с подобни резултати. Данните са изразени като средно стандартно отклонение (SD). Значимостта на променливостта се определя от двустранния несдвоен t-тест на Student за двугрупова или еднопосочна ANOVA с теста за множество сравнения на Dunnett или двупосочна ANOVA с теста за множество сравнения на Sidak за множество групови сравнения, използвайки софтуера GraphPad Prism (версия 8.0.1). Стойност на P < 0.{{10}}5 се счита за статистически значима, а P > 0.05 се определя като статистически незначима. За всички данни, значимостта е представена като *P <0,05, **P <0,01 и ***P <0,001.

3. Резултати

3.1. ZIKV инфекцията индуцира експресия на DHCR7

Натрупващите се доказателства показват, че метаболизмът на холестерола влияе върху вродените имунни отговори на гостоприемника срещу флавивирусна инфекция, като ZIKV и вируса на денга (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 кодира ензим, който трансформира 7-DHC в холестерол, последната стъпка в биосинтезата на холестерола (Moebius et al., 1998). Първо открихме експресия на DHCR7 при ZIKV инфекция. Човешки астроцит U251 беше инфектиран със ZIKV, което в зависимост от дозата увеличи експресията на DHCR7 както при mRNA, така и при протеин (фиг. 1A-C). За да потвърдим феномена, след това изследвахме експресията на DHCR7 във Vero клетки и открихме, че ZIKV инфекцията значително индуцира експресия на DHCR7 (фиг. 1D–F), което е в съответствие с резултатите в U251 клетки.

Cistanche ползи - укрепва имунната система

3.2. Насочването към DHCR7 предизвиква критична анти-ZIKV активност

За да се оценят ефектите на DHCR7 срещу ZIKV инфекция, клетките U251 и A549 бяха трансфектирани с HA-DHCR7 кодиращ плазмид и след това заразени с ZIKV (MOI=1). Резултатите показват, че свръхекспресията на DHCR7 значително повишава експресията на ZIKV mRNA (фиг. 2A и B). По-специално, с натрупването на DHCR7 протеин, експресията на ZIKV структурен протеин Е също се повишава (Фиг. 2C и D). В допълнение, ние допълнително проведохме анализ на плака, използвайки супернатантата от Фиг. 2C и открихме, че свръхекспресията на DHCR7 значително повишава единиците, образуващи плака, в сравнение с контролната група (Фигура 2E и F). Съобщава се, че миссенс мутацията G410S на DHCR7 премахва ензимната активност (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). За по-нататъшно определяне на ефектите на DHCR7 върху ZIKV инфекцията, ние след това конструирахме неактивен мутант на DHCR7 (G410S). В сравнение с дивия тип на DHCR7, мутантът G410S може значително да инхибира ZIKV инфекцията (фиг. 2G). Ние също направихме конфокален микроскопски анализ, за ​​да потвърдим наблюдението. Както е показано на Фиг. 2H, свръхекспресията на DHCR7 повишава ZIKV инфекцията. За да определим дали ендогенната DHCR7 ензимна активност е критична за ZIKV инфекцията, ние проектирахме две къси щифтови РНК (shDHCR7-1 и sh-DHCR7-2), специфично насочени към DHCR7 и генерирани DHCR7-заглушени клетки U251 линии с shRNA система (фиг. 3A). Накрая избрахме sh-DHCR7-1 заради по-високата му ефективност на заглушаване. В сравнение с трансдуцирана от клетъчна линия контролна shRNA, тези DHCR7 нокдаун клетки показват по-ниска чувствителност към ZIKV инфекция (фиг. 3B и C). След това използвахме селективния DHCR7 инхибитор AY9944, който предотвратява 7-DHC превръщането в холестерол (Xu et al., 2011), за който е доказано, че инхибира DHCR7 ензимната активност (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). В сравнение с контролата, прилагането на AY9944 дозозависимо инхибира ZIKV инфекцията в U251 клетки (фиг. 3D–F). Анализът на плака също беше извършен в клетки Vero за допълнителна оценка на ефектите на DHCR7 и показва, че AY9944 може значително да потисне ZIKV инфекцията (фиг. 3G и H). По-специално, конфокалната микроскопия показа, че ZIKV E протеинът е значително намален в присъствието на AY9944 (Фиг. 3I). Тези констатации показват, че насочването към DHCR7 може да инхибира ZIKV инфекцията.

Фиг. 1. ZIKV инфекцията индуцира експресия на DHCR7. Клетките A–F U251 и Vero бяха инфектирани със ZIKV (MOI ¼ 0, 1 и 2) за 24 часа и нивата на вътреклетъчната РНК на ZIKV (A, D) и DHCR7 (B, E) бяха определени от RT-PCR с GAPDH като вътрешна контрола. Относителните протеинови нива на DHCR7 и ZIKV обвивките бяха открити чрез Western blot (C, F). Данните са от поне три независими експеримента (средно SD) или представителни данни (C, F). Статистическата значимост се изчислява с помощта на еднопосочен ANOVA с теста на Dunnett за множество сравнения (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, стандартно отклонение.

3.3. DHCR7 инхибира активирането на TBK1 и IRF3, за да намали производството на IFN- и ISGs

Тъй като DHCR7 е жизненоважният ензим за превръщането на 7-DHC в холестерол (Moebius et al., 1998) и ZIKV инфекцията може да увеличи експресията на DHCR7, ние по този начин измерваме нивото на холестерола при ZIKV инфекция. Разкрихме, че ZIKV инфекцията има малък ефект върху синтеза на холестерол в U251 и Vero клетки (Фиг. 4A и B), въпреки че DHCR7 е увеличен (Фиг. 1A-D). Като се има предвид подобреният DHCR7 при ZIKV инфекция и ключовите роли на IFNs в противопоставянето на ZIKV инфекцията, ние след това определихме ефекта на DHCR7 върху IFN-I сигналния път. Контролните и DHCR7-заглушаващи U251 клетки бяха заразени със ZIKV или трансфектирани с поли(I:C) и беше изследвана експресията на IFN. В сравнение с контролната група, ZIKV инфекцията или третирането с поли(I:C) значително засили експресията на IFN в DHCR7-заглушаващи U251 клетки (Фиг. 4C и D). ISG са ефекторите на действията на интерферона и играят основна роля във вродената имунна защита срещу ZIKV инфекция. Ние също така показахме, че блокирането на DHCR7 може значително да подсили експресията на ISG15 и ISG56 както на нивата на иРНК, така и на протеина (фиг. 4E–J). Последователно лечението с инхибитор на DHCR7 AY9944 може да индуцира експресия на IFN-, ISG15 и ISG56 (фиг. 4K, L). Важно е, че неактивният мутант G410S може частично да обърне инхибиторните ефекти на DHCR7 върху експресията на IFN- и ISG (фиг. 4M, N). Активирането на TBK1 и IRF3 е от съществено значение за индукцията на IFNs-ISGs, поради което след това изследвахме ефекта на DHCR7 върху експресията и активирането на TBK1 и IRF3. Ние демонстрирахме, че DHCR7 не само зависи от дозата инхибира нивото на протеина, но също така потиска нивото на фосфорилирането на TBK1 и IRF3 (фиг. 5A-C). Освен това, неактивният мутант G410S не напълно обърна инхибиторните ефекти на DHCR7 върху фосфорилирането на IRF3 и TBK1 (фиг. 5D). В противоречие с констатациите за свръхекспресия на DHCR7, лечението с AY9944 може да индуцира активиране на IRF3 и TBK1 в U251 клетка (фиг. 5E).

3.4. ZIKV NS4B взаимодейства с DHCR7, за да инхибира фосфорилирането на TBK1 и IRF3

Натрупващите се доказателства разкриват, че ZIKV е развил специфични NS протеини, за да улесни ефективната репликация в клетките на гостоприемника чрез директно избягване на вродения и адаптивен имунитет на гостоприемника чрез множество дискретни механизми. Извършихме ко-IP анализ за скрининг на индивидуалния ZIKV NS протеин, който може да взаимодейства с DHCR7. HEK293T клетки бяха ко-трансфектирани с pCMV-DHCR7-HA и плазмид, експресиращ индивидуален NS протеин, слят с Flag-tag. Както е показано на фиг. 6A, DHCR7 се свързва само с NS4B, но не успява да взаимодейства с други NS протеини. По-нататък бяха проведени реципрочни ко-IP анализи и показаха, че NS4B протеин взаимодейства с DHCR7 в HEK293T клетки (Фиг. 6B и C). За да потвърдим взаимодействието на NS4B и DHCR7, след това извършихме конфокален микроскоп и открихме, че протеинът NS4B и протеинът DHCR7 са колокализирани в цитоплазмата (фиг. 6D). Тестът за падане на GST допълнително демонстрира взаимодействието на NS4B и DHCR7 (фиг. 6E). Освен това, преходна трансфекция на NS4B в U251 клетки може драстично да индуцира експресия на DHCR7 (фиг. 6F). Важно е, че NS4B може в зависимост от дозата да блокира фосфорилирането както на TBK1, така и на IRF3, което корелира положително с повишеното активиране на TBK1 и IRF3 в отговор на DHCR7 (фиг. 6G и H). Въпреки това, свръхекспресията на NS4B в клетките HEK293T значително намалява протеиновото ниво на TBK1, но има малък ефект върху протеина IRF3 (фиг. 6G и H). За допълнително потвърждаване на тези наблюдения, NS4B беше трансфектиран в DHCR7 нокдаун U251 клетки и показа инхибиторни ефекти върху нивата на ендогенен протеин и фосфорилиране на TBK1 и IRF3 (Фиг. 6I). Взети заедно, тези резултати показват, че ZIKV NS4B взаимодейства с DHCR7 и засилва експресията на DHCR7, за да блокира активирането на TBK1 и IRF3 и след това да улесни ZIKV инфекцията.

Фиг. 2. Свръхекспресията на DHCR7 насърчава репликацията на ZIKV. A-D U251 и A549 клетки бяха трансфектирани с HA-вектор или HA-DHCR7 при посочените концентрации за 12 часа и след това заразени със ZIKV за още 36 часа. Нивата на ZIKV РНК бяха открити чрез RT-PCR с GAPDH като вътрешна контрола (A, B), а нивата на протеин на ZIKV обвивката, HA-DHCR7 и GAPDH бяха открити чрез Western blot (C, D). E, F Vero клетки бяха заразени с ZIKV-съдържащ супернатант от Фиг. 2C за 48 часа, за да се определят ZIKV копия чрез анализ на плака. Клетките G U251 бяха трансфектирани с HA-вектор, HA-DHCR7 или HA-DHCR7 (G410S) за 12 часа и инфектирани с ZIKV за 36 часа, и протеиновите нива на ZIKV обвивката, HA-DHCR7 и GAPDH бяха открити чрез Western blot. H U251 клетки бяха трансфектирани с HA-вектор или HA-DHCR7 (1 ug) в продължение на 12 часа, инфектирани със ZIKV в продължение на 36 часа и впоследствие инкубирани с миши анти-флавивирусни и заешки анти-HA антитела, след което бяха оцветени с FITC-конюгирани антимиши и Cy3-конюгирани анти-заешки вторични антитела. Ядрата се оцветяват с DAPI. Изображенията се визуализират чрез конфокална микроскопия. Скала ¼ 100 μm. Данните са от поне три независими експеримента (средно SD) или представителни данни (C, D, E, G, H). Статистическата значимост се изчислява с помощта на двустранния несдвоен t-тест на Student (F) или еднопосочен ANOVA с теста на Dunnett за множество сравнения (A, B). *P <0,05, ***P <0,001. SD, стандартно отклонение.

4. Дискусия

IFN от тип I и техните ISG надолу по веригата се изправят срещу голяма серия от патогени и играят решаваща роля в имунната защита на гостоприемника срещу ZIKV (Lazear et al., 2016). За да избегне IFN-медиираното наблюдение и да постигне достатъчна репликация, ZIKV развива NS протеини, насочени към различни точки от IFN сигналния път, за да избягат от клетъчната вродена имунна система (Lee et al., 2021). Проучванията за монтиране показват, че ZIKV NS1, NS3, NS4A и NS5 инхибират отделни модули на пътя на RIG-I/IFN-I и улесняват вирусната инфекция, използвайки независими и разнообразни механизми (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016 ; Ma et al., 2018; Riedl et al., 2019; Xia et al., 2018; Zheng et al., 2018). Въпреки това, специфичният механизъм на ZIKV NS4B, противодействащ на имунната рестрикция, е слабо дефиниран. ZIKV NS4B е изключително хидрофобен протеин, състоящ се от 251 аминокиселини и е разположен в мембраната на ендоплазмения ретикулум с N-терминал (Zou et al., 2014). Инхибирането на NS4B на сигналния път на IFN-I е идентифицирано в различни флавивируси (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al. др., 2021). Скорошно проучване съобщава, че щамът ZIKV INMI1, изолиран в Бразилия, използва NS4B, за да антагонизира низходящия сигнален път на IFN-I чрез раздробяване на фосфорилирането на STAT1 и вследствие на това прекъсване на ядрения транспорт на STAT1 (Fanunza et al., 2021). В това проучване открихме различен механизъм, при който ZIKV NS4B премахва производството на IFN чрез потискане на фосфорилирането на TBK1 и IRF3, компонентът нагоре по веригата на сигналния път на IFN-I. Трябва да се отбележи, че аминокиселинното заместване (G18R) е открито в ZIKV NS4B, което допринася за намаленото производство на IFN и отслабената експресия на ISG и следователно улеснява вирусната инфекция при мишки, което показва значението на NS4B като определящ фактор за патогенезата (Gorman et al ., 2018). Появяващите се доказателства показват критичното значение на метаболизма на холестерола, участващ във вродения имунен отговор (Akula et al., 2016; Dang et al., 2017; Reboldi et al., 2014; York et al., 2015). Въпреки че е документирано, че няколко междинни продукти в метаболизма на холестерола имат широки антивирусни ефекти (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013; Xiao et al., 2020), нашето проучване илюстрира нов механизъм че холестеролният метаболитен ензим DHCR7 участва в ZIKV инфекция чрез отслабване на активирането на TBK1 и IRF3, за да се улесни вирусната инфекция. Като ключов ензим, участващ в метаболизма на дезмостерол и холестерол, DHCR7 представлява превключване на превръщането на 7-DHC във витамин D в кожни клетки, изложени на UVB (Prabhu et al., 2016b). Освен това, DHCR7 е позициониран не само в шлюза на пътя на Bloch, но и в края на пътя на Kandutsch-Russell (Prabhu et al., 2016a, 2016b), който играе жизненоважна роля в контролирането на синтеза на холестерол. Взаимодействието на DHCR7 и неговото взаимодействие с други ензими по няколко пътя може да даде възможност на множество функции в различни видове клетки или органи. Предишно проучване разкри, че блокирането на DHCR7 може да намали дезмостерола, непосредствения прекурсор на биосинтезата на холестерола, като по този начин предлага достатъчна защита срещу HCV инфекция (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). Важно е, че Xiao et al. са показали, че VSV инфекцията намалява експресията на DHCR7, което води до намален холестерол, но много повече 7-натрупване на DHC в макрофагите и черния дроб (Xiao et al., 2020). Макрофагите, третирани с 7-DHC, предизвикват засилен антивирусен отговор; докато добавянето на холестерол показва незначителна защита. Инхибиторите на DHCR7 и прилагането на 7-DHC могат да бъдат полезни подходи за борба с вирусни инфекции като HIN1, HSV и VSV. В това проучване открихме, че DHCR7 инхибиторът AY9944 може да потисне ZIKV инфекцията. Въпреки това, нашето проучване разкри, че ZIKV инфекцията индуцира експресия на DHCR7, но има малък ефект върху биосинтезата на холестерола в глиалните клетки. Не изследвахме нивото на 7-DHC експресия след ZIKV инфекция, въпреки това си струва да проучим допълнително дали 7-DHC и AY9944 имат синергична терапевтична ефикасност за лечение на пациенти, които са били заразени със ZIKV инфекция в мозъка. Свръхекспресията на DHCR7 насърчава ZIKV инфекцията, докато лечението с DHCR7 селективен инхибитор (AY9944) силно повишава производството на IFN срещу ZIKV инфекция. Активирането на TBK1 и IRF3 е жизненоважно за инициирането на IFN-I сигнализация. Предишно изследване показа, че заглушаването на DHCR7 или 7-DHC лечението активира PI3K-AKT3 пътя за фосфорилиране на IRF3, но не и TBK1 в макрофагите (Xiao et al., 2020). Въпреки това, нашите открития показаха, че DHCR7 в зависимост от дозата намалява експресията на IRF3 и TBK1, както и фосфорилирането на IRF3 и TBK1. Тези изследвания предполагат, че DHCR7 може да допринесе за ZIKV инфекция в независим от метаболизма на холестерола механизъм в мозъка. Добре е изяснено, че ZIKV използва NS протеини за директно взаимодействие с различни компоненти на RIG-I/IFN-I пътя, за да избегне имунния отговор и да улесни вирусната репликация. По-рано докладвахме за взаимодействието на ZIKV NS5 с RIG-I за намаляване на производството на IFN (Li et al., 2020). Други демонстрират, че ZIKV NS1 и NS2B са насочени към TBK1, NS3 са насочени към RIG-I и MDA5, за да намалят производството на IFN-I и ISG (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). Въпреки това, функцията на ZIKV NS протеините, насочени към метаболизма на холестерола, остава до голяма степен неуловима. В това проучване ние също така илюстрирахме неотчетено взаимодействие между холестеролния метаболитен ензим DHCR7 и ZIKV NS протеини. Показахме DHCR7, специфично свързан с NS4B, а не с други NS протеини. Предоставихме критичните доказателства, че ZIKV NS4B взаимодейства с DHCR7 и значително индуцира неговата експресия, което беше в съответствие с резултатите в U251 клетки при ZIKV инфекция. Важно е, освен директното демонстриране на ангажираността на DHCR7 и ZIKV NS4B, ние също открихме, че ZIKV NS4B повишава експресията на DHCR7, за да инхибира фосфорилирането на TBK1 и IRF3 и да улесни ZIKV инфекцията. В съгласие с нашите резултати, скорошно проучване разкри, че дефицитът на DHCR7 може да активира IRF3 и IFN-сигнализиране за инхибиране на VSV и други вируси в макрофагите.

Фигура 3. Нокдаун на DHCR7 намалява ZIKV инфекцията в U251 клетки. Клетките U251 бяха трансдуцирани с лентивирусни частици, съдържащи shRNA срещу DHCR7 (shDHCR7-1 и sh-DHCR7-2) или нецелева последователност (sh-NTC), последвано от селекция на пуромицин за 14 дни. Ефективността на нокдаун се определя чрез RT-PCR. B, C DHCR7-заглушаващи U251 (sh-DHCR7) и sh-NTC U251 клетки бяха фалшиво инфектирани или инфектирани с ZIKV (MOI=1) за 36 часа. Вътреклетъчното ниво на ZIKV РНК се открива чрез RT-PCR с GAPDH като вътрешна контрола (В) и протеиновите нива на ZIKV обвивката, DHCR7 и GAPDH се откриват чрез Western blot (С). D, E U251 клетки бяха третирани с DHCR7 инхибитор AY9944 при посочената концентрация в продължение на 2 часа, след това инфекция с ZIKV (MOI=1) в продължение на 48 часа. Клетките бяха подложени на RT-PCR за откриване на ZIKV РНК (D). Протеиновите нива на ZIKV обвивката, DHCR7 и GAPDH бяха открити чрез Western blot (E). F U251 клетки бяха третирани с DHCR7 инхибитор AY9944 при посочената концентрация в продължение на 36 часа и DHCR7 и GAPDH бяха открити чрез Western blot. G, H Vero клетки бяха инфектирани със ZIKV-съдържащ супернатант от Фиг. 3E за 48 часа, за да се определят ZIKV копия чрез анализ на плака. I U251 клетки бяха третирани с AY9944 при посочената концентрация в продължение на 2 часа, след това инфекция с ZIKV при MOI=1 в продължение на 36 часа. Изображенията се визуализират чрез конфокална микроскопия. Скала ¼ 100 μm. Данните са от поне три независими експеримента (средно SD) или представителни данни (C, E, F, G и I). Статистическата значимост се изчислява с помощта на еднопосочен ANOVA с теста на Dunnett за множество сравнения (A, D, H) или двупосочен ANOVA с теста на Sidak за множество сравнения (B). ***P <0,001. SD, стандартно отклонение.

Фиг. 4. DHCR7 инхибира производството на IFN- и ISG. Клетките A, B U251 и Vero бяха заразени със ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 и 1) за 24 часа и клетъчният холестерол беше измерен чрез комплект за анализ на тъканен общ холестерол. C–H DHCR7-заглушаващи U251 (sh-DHCR7) и sh-NTC U251 клетки бяха инфектирани с ZIKV (MOI ¼ 1) или третирани с Poly(I: C) (1 ug/mL) в продължение на 6 часа. Общата клетъчна РНК се екстрахира и се подлага на RT-PCR за експресията на иРНК с GAPDH като вътрешна контрола. Относителните експресии на IFN- и ISGs бяха нормализирани до тези на sh-NTC проби във фиктивната група и промените на гънките бяха показани прекомерни. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) и ISG56 (G, H). I, J DHCR7-заглушаващи U251 (sh-DHCR7) и sh-NTC U251 клетки бяха инфектирани с ZIKV (MOI ¼ 1) или трансфектирани с Poly(I: C) (1 ug/mL) за 24 часа, и протеиновите нива на ISG15, ISG56 и GAPDH бяха открити чрез Western blot. Клетките K U251 бяха третирани с посочената доза AY9944 в продължение на 2 часа, след това инфектирани с ZIKV (MOI=1) в продължение на 6 часа. Нивото на IFN-RNA се открива чрез RT-PCR с GAPDH като вътрешна контрола. L U251 клетки бяха третирани с посочената доза AY9944 в продължение на 2 часа и след това заразени с ZIKV (MOI=1) в продължение на 24 часа. Протеиновите нива на ISG15, ISG56 и GAPDH бяха открити чрез Western blot. M U251 клетки бяха трансфектирани с HA-вектор, HA-DHCR7 или HA-DHCR7 (G410S) в продължение на 24 часа и инфектирани с ZIKV (MOI=1) в продължение на 6 часа. Нивата на IFN-RNA се откриват чрез RT-PCR с GAPDH като вътрешна контрола. N U251 клетки се трансфектират с HA-вектор, HA-DHCR7 или HA-DHCR7 (G410S) за 24 часа и след това се заразяват с ZIKV (MOI=1) за 24 часа. Протеиновите нива на ISG15, ISG56 и GAPDH бяха открити чрез Western blot. Данните са от поне три независими експеримента (средно SD) или представителни данни (I, J, L, N). Статистическата значимост се изчислява с помощта на еднопосочен ANOVA с теста на Dunnett за множество сравнения (A, B, K, M) или двупосочен ANOVA с теста на Sidak за множество сравнения (C–H). ns, P > 0.05, ***P < 0.001. SD, стандартно отклонение.

Фиг. 5. DHCR7 инхибира активирането на TBK1 и IRF3. A, B HEK293T клетки бяха котрансфектирани с TBK1-кодиращ плазмид заедно с DHCR7-експресиращ плазмид или празен вектор (А). HEK293T клетки бяха котрансфектирани с IRF3-кодиращ плазмид, RIG-I кодиращ плазмид, заедно с DHCR7-експресиращ плазмид или празен вектор (В). Клетките се събират 24 часа след трансфекцията и се подлагат на Western blot с посочените антитела [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-PIRF3(S396), анти-HA и анти-GAPDH ]. C U251 клетки бяха трансфектирани с посочената доза DHCR7 експресиращ плазмид или празен вектор за 24 часа. След това клетките бяха инфектирани със ZIKV (MOI ¼ 1), събрани 6 часа след заразяването и подложени на Western blot с посочените антитела [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-P-IRF3( S396), анти-НА и анти-GAPDH]. D U251 клетки бяха трансфектирани с HA-вектор, HA-DHCR7 или HA-DHCR7 (G410S) за 24 часа. След това клетките бяха заразени с ZIKV (MOI ¼ 1), събрани 6 часа след заразяването и подложени на Western blot с посочените антитела [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-PIRF3(S396) анти-НА и анти-GAPDH]. Клетките E U251 бяха третирани с посочената доза AY9944 за 2 часа и инфектирани със ZIKV (MOI ¼ 1) за 6 часа, след което бяха подложени на Western blot с посочените антитела [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти -IRF3, анти-P-IRF3(S396) и анти-GAPDH]. Данните са от поне три независими експеримента и са показани като представителни данни (A–E).

Фиг. 6. ZIKV NS4B взаимодейства с DHCR7, за да инхибира фосфорилирането на TBK1 и IRF3. A HEK293T клетки бяха котрансфектирани с плазмиди, кодиращи HA-DHCR7, и плазмиди, кодиращи ZIKV неструктурни протеини (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B и FLAG-NS5) или празен контролен плазмид за 3 0 ч. Клетъчните лизати се имунопреципитират с анти-Flag антитела и след това се анализират чрез имуноблотинг с посочените антитела. B, C HEK293T клетки бяха котрансфектирани с плазмиди, кодиращи HA-DHCR7, плазмиди, кодиращи FLAG-NS4B, или празен контролен плазмид за 30 часа. Клетъчните лизати се имунопреципитират с анти-НА антитяло (В) или анти-FLAG антитяло (С) и след това се анализират чрез имуноблотинг с посочените антитела. D U251 клетки бяха трансфектирани с FLAG-NS4B плазмид заедно с плазмиди, кодиращи с HA-DHCR7. Локализацията на FLAG-NS4B (зелено), HA-DHCR7 (червено), ядрен маркер DAPI (син) и сливането бяха анализирани с конфокална микроскопия. Скала ¼ 10 μm. Е клетъчни лизати от HEK293T клетки, трансфектирани с HA-DHCR7, се инкубират с GST протеин или GST-NS4B протеин, който се инкубира с глутатион-сефароза перли. Смесите бяха открити чрез Western blot с анти-НА и анти-GST антитела (отгоре). Лизати от трансфектирани HEK293T клетки и пречистените протеини бяха открити чрез Western blot с анти-НА и анти-GST антитела (отдолу). F U251 клетки бяха трансфектирани с плазмид, кодиращ FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). Относителните протеинови нива на DHCR7, FLAG-NS4B и GAPDH бяха открити чрез Western blot. G, H HEK293T клетки бяха котрансфектирани с NS4B-експресиращ плазмид или празен вектор, заедно с TBK1-кодиращ плазмид (F), IRF3-експресиращ плазмид и плазмиди, кодиращи RIG-I (G) . Клетките се събират 24 часа след трансфекцията и се подлагат на Western blot с посочените антитела [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-P-IRF3(S396), анти-FLAG и антиGAPDH ]. I DHCR7-заглушаващи U251 (sh-DHCR7) и sh-NTC U251 клетки бяха трансфектирани с NS4B-експресиращ плазмид или празен вектор. Клетките се събират 6 часа след трансфекцията и се подлагат на Western blot с посочените антитела [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-P-IRF3(S396), анти-FLAG и антиGAPDH ]. Данните са представителни за три независими експеримента.

5. Изводи

В обобщение, предишно проучване разкри, че ензимът на метаболизма на холестерола DHCR7 участва във вродения имунен отговор срещу различни вирусни инфекции. Нашето проучване показа, че ZIKV NS4B взаимодейства с DHCR7 и индуцира експресия на DHCR7. Повишеният DHCR7 значително инхибира активирането на TBK1 и IRF3 и води до намалено производство на IFN- и ISG, което по този начин улеснява ZIKV инфекцията в глиалните клетки. Тези открития разкриха нов механизъм за избягване на вирусен имунитет, чрез който ZIKV преодолява имунния отговор чрез директно насочване към DHCR7 с NS4B.

Препратки

Акула, МК, Ши, М., Дзян, З., Фостър, СЕ, Мяо, Д., Ли, АС, Джан, X., Гавин, Р.М., Форде, С.Д., Жермен, Г., Карпентър, С., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Контрол на вродения имунен отговор чрез мевалонатния път. Нац. Immunol. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. Ограничаването на флавивирусите. Virol. грях. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. Транскрипционният фактор STAT-1 свързва макрофагалния синтез на 25-хидроксихолестерол с антивирусния отговор на интерферона. Имунитет 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Избухване на синдрома на Guillain-Barre, свързано с инфекция с вируса Zika във Френска Полинезия: случай - контролно изследване. Lancet 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I разпознава 5' регион на геноми на вируса на денга и зика. Cell Rep. 24, 320–328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Метаболитен препрограмирането от вируса Зика провокира възпаление в човешката плацента. Нац. Общ. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Оксистероловото ограничаване на синтеза на холестерол предотвратява активирането на инфламазома AIM2. Клетка 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Вирусът на хепатит С NS4B блокира взаимодействието на STING и TBK1 за избягване на вродения имунитет на гостоприемника. J. Hepatol. 59, 52–58.

Фанунца, Е., Гранди, Н., Куарту, М., Карлети, Ф., Ермелино, Л., Милия, Дж., Корона, А., Капобианки, М.Р., Иполито, Г., Трамонтано, Е., 2021 г. INMI1 Zika вирусът NS4B антагонизира интерферонното сигнализиране чрез потискане на STAT1 фосфорилирането. Вируси 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε и TBK1 са основни компоненти на сигнализирането на IRF3 пътека. Нац. Immunol. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Мутации в Δ{{ 3}}стерол редуктазен ген при пациенти със синдром на Smith-Lemli-Opitz. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3rd, KH, Ruckert, C ., Йънг, MC, Жу, З., Робъртсън, С. Джей, Макнали, К. Л., Йе, Дж., Као, Б., Майсорекар, ИУ, Ебел, Г. Д., Барич, Р. С., Бест, С. М., Артьомов, М. Н., Гарсия -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Имунокомпетентен миши модел на инфекция с вируса Zika. Клетъчен гостоприемник микроб 23, 672–685.e6.

Грант, А., Пония, С.С., Трипати, С., Баласубраманиам, В., Миорин, Л., Сурисо, М., Шварц, МС, Санчес-Секо, МП, Еванс, М.Дж., Бест, С.М., Гарсия-Састр , A., 2016. Вирусът Zika е насочен към човешки STAT2, за да инхибира сигнализирането на интерферон тип I. Микроб клетъчен гостоприемник 19, 882–890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Инфекцията с бразилски изолат на вируса Zika генерира RIG-I стимулираща РНК и вирусният NS5 протеин блокира индукцията и сигнализирането на IFN тип I. Евро. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. Ефект на нов инхибитор на биосинтеза на холестерола (AY 9944) върху серумни и тъканни стероли при плъхове. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. Клетъчен трафик на холестерол и компартментализация. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 125–138.

Като, Х., Такеучи, О., Сато, С., Йонеяма, М., Ямамото, М., Мацуи, К., Уемацу, С., Юнг, А., Кавай, Т., Иши, К. Дж., Ямагучи , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Различни роли на MDA5 и RIG-I хеликази при разпознаването на РНК вируси. Nature 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. DHCR7 мутации, свързани с по-висок статус на витамин D, позволяват ранна човешка миграция към северните ширини. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Вирусът Zika инхибира производството на интерферон тип I и надолу по веригата сигнализация. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Миши модел на патогенезата на вируса Zika. Cell Host Microbe 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Криеница: взаимодействието между вируса Zika и имунния отговор на гостоприемника. Преден. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Глобална липидна карта дефинира мрежа, която е от съществено значение за репликацията на вируса Zika. Нац. Общ. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. Консервативното място NS5 е необходимо за вируса Zika, за да ограничи RIG-I сигнализирането. Преден. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Хидроксихолестеролът защитава гостоприемника срещу инфекция с вируса Zika и свързаната с нея микроцефалия в миши модел. Имунитет 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. Инхибитор на биосинтеза на холестерол блокира вирулентността на Staphylococcus aureus . Наука 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Индуцираната от интерферон холестерол-25-хидроксилаза като цяло инхибира навлизането на вируса чрез производство на 25- 25-хидроксихолестерол. Имунитет 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Механизми и регулиране на хомеостазата на холестерола. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. Терминалните ензими на синтеза на холестерол, DHCR24 и DHCR7, взаимодействат физически и функционално. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Неструктурният протеин 4A на вируса Zika блокира RLR-MAVS сигнализирането. Преден. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Молекулярно клониране и експресия на човешката делта7-стерол редуктаза. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Инхибиране на сигнализирането на алфа/бета интерферон от протеина NS4B на флавивирусите. J. Virol. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Инхибиране на интерфероновото сигнализиране от вируса на денга. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 100, 14333–14338.

Петерсън, Дж., Дрейк, М. Дж., Брус, Е. А., Риблет, А. М., Дидигу, Калифорния, Уилен, К. Б., Малани, Н., Мале, Ф., Лий, Ф. Х., Бушман, Ф. Д., Чери, С., Домс, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Основният регулаторен път на клетъчния стерол е необходим за инфекция с вируса на Андите. PLoS Pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020 г. Продължаващата заплаха от възникващи флавивируси. Нац. Microbiol. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: жизненоважен ензим за превключване между производството на холестерол и витамин D. Прог. Lipid Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. Медиираното от холестерола разграждане на 7-дехидрохолестеролова редуктаза превключва баланса от холестерол към синтез на витамин D. J. Biol. Chem. 291, 8363–8373. Randall, G., 2018. Метаболизъм на липидните капки по време на инфекция с вируса на денга. Тенденции Microbiol. 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Вирус Zika и вродени дефекти – преглед на доказателствата за причинно-следствена връзка. Н. англ. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Възпаление. 25-Хидроксихолестеролът потиска възпалението, предизвикано от интерлевкин-1- след интерферон тип I. Наука 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika virus NS3 имитира клетъчен { {2}}свързващ мотив за антагонизиране на RIG-I- и MDA5-медиирания вроден имунитет. Клетъчен гостоприемник микроб 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Профилирането на липидния метаболит идентифицира метаболизма на дезмостерол като нова антивирусна цел за вируса на хепатит C. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM инхибират репликацията на вируса Zika. Cell Rep. 15, 2323–2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Интерферон-стимулирани гени: сложна мрежа от защити на гостоприемника. Annu. Rev. Immunol. 32, 513–545.