Протеазата Calpain2a ограничава вродения имунитет, като се насочва към TRAF6 при телестните риби
Dec 19, 2023
Свързаният с TNF рецептор фактор 6 (TRAF6) играе ключова роля в сигналната трансдукция както в антибактериалните, така и в антивирусните сигнални пътища. Въпреки това, регулаторните механизми на TRAF6 при по-ниски гръбначни са по-малко докладвани. В това проучване ние идентифицираме калпаин2а като член на семейството на калциево-зависими протеази с уникална хидролитична ензимна активност и функционира като ключов регулатор за антибактериален и антивирусен имунитет при телести риби. При липополизахаридна (LPS) стимулация, нокдаунът на калпаин2а насърчава регулирането нагоре на възпалителните цитокини. Механично, калпаин2а взаимодейства с TRAF6 и намалява протеиновото ниво на TRAF6 чрез хидролиза. След загуба на ензимна активност, мутантният калпаин2а конкурентно инхибира образуването на димер и авто-убиквитинирането на TRAF6. Нокдаунът на калпаин2а също насърчава клетъчния антивирусен отговор. Мутантен калпаин2а, лишен от хидролазна активност, потиска убиквитинирането на IFN регулаторен фактор (IRF) 3/7 от TRAF6. Взети заедно, тези констатации класифицират калпаин2а като отрицателен регулатор на вродените имунни отговори чрез насочване към TRAF6 в риби телести.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Като първа линия на защита срещу нахлуващи патогени, вроденият имунитет играе важна роля в защитата на тялото от бактериална инвазия и вирусни инфекции. Рецепторите за разпознаване на образи (PRRs) на мембраната незабавно разпознават свързаните с патогени молекулярни модели (PAMP) 1–3. Трите най-широко изследвани PRR във вродения имунитет са Toll-подобни рецептори (TLR), RIG-I-подобни рецептори (RLR) и NOD-подобни рецептори (NLR), които разпознават различни PAMP и задействат сигнални каскади за активиране на провъзпалителни цитокини и антивирусен фактор4–6. TNF рецептор-свързаният фактор (TRAF) 6 е незаменима част от борбата срещу бактериалната инвазия и вирусните инфекции. Като важен сигнален път, активиран от липополизахарид (LPS), пътят на ядрения транскрипционен фактор-κB (NF-κB) е очертан подробно. Повечето от протеиновите функции в NF-κB сигналния път са широко проучени 1,7. Факторът на миелоидна диференциация 88 (MyD88) първо се активира от TLR в отговор на LPS, а IRAK4 действа като медиатор чрез активиране на IRAK1 и IRAK2, които свързват MyD88 с TRAF68–11. Ubc13 и Uev1A катализират K63-свързаното убиквитиниране на TRAF6, което прехвърля K63 убиквитиновата верига към TAB2 и TAB3, което води до активиране на TAK112–16. TRAF6-регулиран IKK активатор 2 (TRIKA2), който е съставен от TAK1, TAB1 и TAB2, активира инхибитор на IκB киназа (IKK) / фосфорилиране17–19. Транскрипционният фактор NF-κB навлиза в ядрото и насърчава производството на възпалителни цитокини20. Когато TLR7/9 разпознае вируса, комплексът MyD88- IRAKs-TRAF6 предава сигнали към IFN регулаторен фактор (IRF) 7, насърчава убиквитинирането на IRF7 и активира неговото фосфорилиране в ядрото 21,22. В сигналния път на RLR, RIG I и ген 5, свързан с диференциация на меланома (MDA5), активират митохондриален антивирусен сигнален протеин (MAVS) 23, 24. Агрегирането на MAVS е важна характеристика на началото на предаването на RLR сигнал 23, 25, 26. TRAF2/3/6 са първите фактори, активирани от MAVS27,28. TRAF3 ще активира сигнализирането на TBK1-IRF3, а комплексът MAVS-TRAF6 ще активира сигнализирането на NF-κB, което насърчава експресията на IFN-127,29.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Молекулярният механизъм на активиране на TRAF6 вече е демонстриран. TRAF6 в димерна форма претърпява автоубиквитиниране под катализата на Ubc13 и Uev1A, което е свързано с домейна на безименния пръст и ZF домейна на пръстите. Моделът на TRAF6/Ubc13~UB потвърждава важната роля на димера TRAF6 в агрегацията и предаването на убиквитиновата верига K6330. Освен това се съобщава, че домейнът на безименния пръст и ZF пръстите набира E2~ub конюгати в кристалния модел TRAF6 на зебра и беше открито, че TRAF6 може да образува хетеродимер с TRAF5 от същото TRAF семейство за първи път16. Семейните протеини за деубиквитиниране: A20, CYLD, USP2a, USP4 и USP20 са насочени към TRAF6, за да премахнат K63-свързаното убиквитиниране и да намалят сигнализирането надолу по веригата 31–35. Дрождевата двухибридна система отсява взаимодействието между UBE2O и TRAF6 и потвърждава, че това взаимодействие пряко влияе върху активирането на TRAF6 от MyD8836. В процеса на сигнална трансдукция надолу по веригата на TRAF6, ECSIT като междинен протеин взаимодейства съответно с TRAF6 и TAK1 и това взаимодействие засилва свързването на TRAF6 и TAK137. При LPS-индуцирано TLR4 сигнализиране, PRDX пречат на TRAF6 да набира ECSIT, за да достави убиквитиновата верига K63 и също така инхибира BECN1, активиран от TRAF6 в пътя на автофагията38. MST4 активира фосфорилирането на TRAF6 при Thr463 и Thr486 и инхибира димеризацията и убиквитинирането на TRAF639. При бозайниците механизмът за регулиране на протеина на TRAF6 е широко проучен в антибактериалния и антивирусния имунитет. Изследването на TRAF6 при по-ниски гръбначни обаче е по-слабо проучено. Имунният отговор при телестните риби разчита главно на TLR и RLR пътищата за осъществяване на имунния отговор след инфекция с патоген. Следователно е изключително важно да се изследва регулаторният механизъм на TRAF6-медиираните сигнални пътища. calpain2 (m-calpain) е семейство от калций-зависими протеази, което се състои от повече от 16 члена в бозайници и много други организми40. Най-ранното изследване на семейството на протеините калпаин е свързано с движението на клетките41. калпаин насърчава клетъчната миграция и е установено, че инхибира миграцията на неутрофили и активирането на p38 MAPK и ERK MAPK42. Активността на хидролазата е една от важните функции на калпаина. При имунната регулация, калпаин -2 насърчава освобождаването на NF-κB чрез хидролизиране на IkB и активира сигналния път43. В това проучване ние установихме, че калпаин2а взаимодейства с TRAF6 и действа като отрицателен регулатор в антибактериалните и антивирусните реакции при риба телеост, miiuy croaker (Miichthys miiuy). calpain2a насърчава разграждането на нивото на TRAF6 протеин чрез своята хидролазна активност. Междувременно, мутантният калпаин2а без хидролазна активност инхибира образуването на K63 убиквитиновата верига чрез инхибиране на димера на TRAF6. Отразено е, че както калпаин2а, така и мутантният калпаин2а прекратяват убиквитинирането на TRAF6 до ECSIT/BENC1/IRF3/IRF7. calpain2a спира процеса на сигнализиране на NF-κB и IFN чрез насочване към TRAF6. Нашите резултати предоставят молекула за изследване на TRAF6-медиираната имунна регулация при нисши гръбначни животни.
Резултати
calpain2a взаимодейства с TRAF6 и отрицателно регулира NF- κB сигнализирането.
За да получим представа за свързаните с TRAF6-протеини в отговора на вродения имунитет при телестите риби, ние характеризирахме интерактома TRAF6 на моя кроак, използвайки афинитетно пречистване и масспектрометрия. Сортирани по интензитет на количествено определяне без етикет (LFQ), ние прихванахме част от данните и ги показахме (фиг. 1а). Сред протеините, свързани с TRAF6-, калпаин2а може би регулира активността на TRAF6 и засяга TRAF6-медиираните сигнални пътища. Първо, връзката между calpain2a и TRAF6 на ниво протеин трябва да бъде изследвана, ние проверихме взаимодействието на calpain2a с TRAF6 в клетъчни линии на бъбрек на кракер Miiuy (MKC). Ендогенни коимунопреципитационни експерименти показват, че калпаин2а взаимодейства с TRAF6 (фиг. 1b, c). Както е показано от експерименти с преходна трансфекция и коимунопреципитация, свръхекспресираните калпаин2а и TRAF6 взаимодействат един с друг (Фиг. 1d, e). Всички те показват, че калпаин2а взаимодейства с TRAF6 и са необходими допълнителни експерименти, за да се изследва механизмът на тяхното действие. Чрез множествено подравняване на последователности на човешки, миши, риба зебра и може би кракер calpain2a протеини, calpain2a е еволюционно запазен между риби и бозайници (фиг. 1f). За да определим функцията на калпаин2а във вродения имунитет, ние изследвахме дали калпаин2а е свързан с активиране на NF-кВ, индуцирано от LPS стимулация. Ние трансфектирахме клетки от епителиома папулозум кипринид (EPC) с NF-кВ луциферазен репортер, вътрешен контролен ренила луциферазен репортер и вектор, кодиращ калпаин2а или празен вектор. calpain2a значително намалява NF-кВ репортерната активност при LPS стимулация по дозозависим начин (фиг. 1g). Освен това, провъзпалителни цитокини като IL-1 и IL-8 промотор, реагиращи на LPS стимулация, са значително намалени в калпаин2а-свръхекспресирани EPC клетки (фиг. 1h, i), което предполага потенциална роля на калпаин2а във възпалителната сигнализация пътища, индуцирани от LPS стимулация.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Отрицателна регулация на LPS-индуцирано NF-κB сигнализиране от калпаин2а.
За да изследваме потенциалната роля на калпаин2а в сигнализирането на NF-кВ, ние трансфектирахме калпаин2а в MKC с времеви градиент на LPS и оценихме провъзпалителните цитокини, реагиращи на LPS. Свръхекспресията на калпаин2а доведе до понижаване на експресията на IL-1, IL-8 и IL-6 (фиг. 2а). След това проектирахме две специфични за calpain2a малки интерфериращи РНК (siRNAs), които ефективно намаляват calpain2a (фиг. 2b, d). Нокдаунът на калпаин2а значително засилва LPS-индуцираните провъзпалителни цитокини, включително IL-1 и IL-8 в MKC и Miiuy клетъчни линии на червата на горбала (MIC) (Фиг. 2c, e). В групата от LPS-стимулирани клетки, нокдаунът на калпаин2а засилва клетъчната пролиферация. По същия начин, при липса на каквато и да е стимулация, открихме, че нокдаунът на калпаин2а също засилва клетъчната пролиферация (фиг. 2f). За да се определи дали калпаин2а инхибира протеини в LPS-индуцирано NF-кВ сигнализиране, калпаин2а значително инхибира ендогенното протеиново ниво на TRAF6, но не и MyD88, IRAK4 или TAK1 (фиг. 2g). В обобщение, кинетиката на калпаин2а и експресията на провъзпалителни цитокини предполага функционално участие на калпаин2а в LPS-индуцираното NF-кВ сигнализиране.
Фиг. 1 калпаин2а взаимодейства с TRAF6 и инхибира NF-κB сигналния път. Списък на интерактом TRAF6 въз основа на интензитета на количествено определяне без етикет (раздел). b, c MKC клетки, посяти в 6 cm2 блюда. След 24 часа клетъчните лизати се имунопреципитират (IP) с анти-TRAF6 или анти-калпаин2а афинитетни гелове. След това имунопреципитатите и клетъчните лизати се анализират от IB съответно с анти-TRAF6 и анти-калпаин2а Abs. d, e HEK 293 клетки, посяти в 6 cm2 блюда, бяха трансфектирани с плазмидите calpain2a-Flag и TRAF6-Myc (2 ug всеки). След 24 часа клетъчните лизати се имунопреципитират (IP) с анти-Myc d или анти-Flag e афинитетни гелове. След това имунопреципитатите и клетъчните лизати се анализират от IB съответно с анти-Myc и анти-Flag Abs. f Същите аминокиселини сред човешки calpain2a (Hu-calpain2), миши calpain2a (Mu-calpain2), calpain2a от риба зебра (ZF-calpain2a) и miiuy calpain2a на крак (M-calpain2a) са подчертани с черен фон. g–I EPC клетки бяха трансфектирани с calpain2a-Flag или празен вектор заедно с репортерите на NF-кВ, IL-1 и IL-8 луцифераза. На 24-ия час след трансфекцията клетките не са третирани (Mock) или са третирани с LPS в продължение на 6 часа. Стойността на луциферазната активност се постига спрямо луциферазната активност на Renilla (n=3 на група). Western blot анализът беше използван за измерване на експресията на преходно трансфектирания калпаин2а флаг. Експресията на тубулин се използва като контрола на натоварването. Данните бяха анализирани чрез двупосочен ANOVA (g, h, i). **p < 0.01. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента.
Взаимодействието на калпаин2а с TRAF6.
Анализът на домейна беше направен с помощта на консервираната база данни на домейни (CDD) NCBI. calpain2a се състои от три домена: домейн на цистеинова протеаза (CysPc) от семейството на Calpain (aa 46-339), домейн III на голяма субединица на Calpain (aa 360-499) и С-терминален Penta-EF ръчен домейн ( аа 500-697). За да определим кой домейн(ове) на calpain2a е необходим за взаимодействието му с TRAF6, създадохме три мутанта за съкращаване: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) и calpain (500-697) (фиг. 3а). HEK293 клетки бяха трансфектирани с calpain2a-Flag див тип (WT), calpain2a-Flag съкратени мутанти или TRAF6-HA вектор. Открихме, че както калпаин2а с пълна дължина, така и три съкратени мутанта могат да взаимодействат с TRAF6 (фиг. 3в). TRAF6 се състои от С-терминален TRAF домейн, навита намотка домейн, домейн Zinc fingers и домейн Ring finger38. За да изследваме кой домейн(ове) на TRAF6 е необходим за взаимодействието му с калпаин2а, ние направихме серия от съкратени мутанти на TRAF6, включително TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36 }}) и TRAF6 (400-574). Междувременно направихме мутанти на домейна: TRAF6ΔRing (в който домейнът на безименния пръст е изтрит), TRAF6ΔZF (в който домейнът на Zinc fingers е изтрит), TRAF6ΔCC (в който домейнът на спиралата е изтрит) и TRAF6ΔTRAF-C ( в който С-краен TRAF домейн е изтрит) (фиг. 3b). calpain2a взаимодейства с TRAF6 с пълна дължина, както и съкращения на TRAF6, които съдържат С-терминален TRAF домейн, домейн със спирала, домейн на цинкови пръсти (фиг. 3d, f), но не и с домейн на безименния пръст (фиг. 3e) . Анализите на луциферазата показват, че свръхекспресията на калпаин2а и тези съкратени мутанти значително инхибират NF-кВ и IL-1 репортерната активност в EPC клетки (фиг. 3h). Освен това бяха изследвани субклетъчните колокализации на калпаин2а с TRAF6. Трансфектирахме EPC клетки с TRAF6-GFP и празен вектор или calpain2a-mCherry. Конфокалният микроскопски анализ показа, че зелените сигнали на TRAF6 се припокриват с червените сигнали на калпаин2а, което показва, че калпаин2а се локализира съвместно с TRAF6 в EPC клетки (фиг. 3i, j). Тези данни показват, че структурната основа на множество домейни на TRAF6 (C-терминален TRAF домейн, домейн със спирала, домейн на цинкови пръсти), но не и домейнът на безименния пръст, е определящ за връзката му с калпаин2а (фиг. 3g).
Фиг. 2 calpain2a отрицателно регулира LPS-индуцирания NF-кВ сигнален път. IL-1, IL-8 и IL-6 иРНК в MKC, трансдуцирани с calpain2a-Flag или празен вектор и третирани с физиологичен разтвор (0) или провокирани с LPS за различни пъти (2 часа, 4 часа, 6 часа, 8 часа, 10 часа) (n=3 на група). b, d MKC клетки и MIC клетки бяха трансфектирани със si-calpain2a #1 и si-calpain2a #2 (100 nM) или si-ctrl (100 nM). На 48-ия час след трансфекцията експресията на калпаин2а се измерва чрез qRT PCR (n=3 на група). Нивото на протеин калпаин2а се определя чрез Western blotting. c, e IL-1, IL-8 иРНК в MKC и MIC, стабилно трансдуцирани със si-calpain2a #1 или si-ctrl (контролен вектор) и третирани с физиологичен разтвор (0) или провокирани с LPS за различни пъти (4 часа, 8 часа) (n=3 на група). f MKC клетки бяха трансфектирани или със si-ctrl, или със si-calpain2a #1. На 36-ия час след трансфекцията, клетките бяха стимулирани с LPS в продължение на 12 часа, след което беше измерен анализ на клетъчна пролиферация (n=3 на група). Скала, 100 μm. g calpain2a-Flag беше трансфектиран в MKC клетки, които бяха провокирани с LPS в различно време (3 часа, 6 часа, 9 часа). Имуноблот анализ на клетъчни лизати с посочени Abs. Относителното ниво на иРНК се нормализира към експресията на гена, кодиращ -актин във всяка проба. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента. Данните бяха анализирани чрез двупосочен ANOVA (a, c, e, f) или еднопосочен ANOVA (b, d). *p <0,05, **p <0,01.
Фиг. 3 Взаимодействието на калпаин2а с TRAF6. a, b Схематични диаграми на организацията на домейна в miiuy croaker calpain2a, TRAF6 и мутанти бяха използвани в това изследване. „+“ представлява взаимодействието с TRAF6 или calpain2a, „-“ означава липса на взаимодействие. c HEK293 клетки бяха трансфектирани с макет, calpain2a-Flag див тип (WT) и calpain2a-Flag съкратени мутанти, или TRAF6-HA, както е посочено. 24 часа след трансфекцията, трансфектираните клетки бяха екстрахирани и клетъчните лизати бяха подложени на имунопреципитация с анти-НА антитяло, последвано от IB, използвайки анти-НА или анти-Flag антитяло. d–f HEK293 клетки бяха трансфектирани с макет, TRAF6-HA див тип (WT) и TRAF6-HA съкратени мутанти или calpain2a-Flag, както е посочено. На 24-ия час след трансфекцията трансфектираните клетки се екстрахират и клетъчните лизати се подлагат на имунопреципитация с анти-НА антитяло d, f или анти-Flag антитяло e, последвано от IB, използвайки анти-НА или анти-Flag антитяло. g Мястото на взаимодействие на TRAF6 и калпаин2а. h EPC клетките бяха трансфектирани с TRAF6-HA, calpain2a-Flag или съкратени мутанти на calpain2a-Flag заедно с NF-кВ и IL-1 луциферазни репортери. След 36 часа след трансфекцията, стойността на луциферазната активност беше постигната спрямо активността на ренила луцифераза (n=3 на група). I j EPC клетки бяха трансфектирани с макет, calpain2a-mCherry и TRAF6-GFP. Оцветените с DAPI ядра са показани в синьо. calpain2a беше открит с червена флуоресценция, а TRAF6 беше открит със зелена флуоресценция. Мащабна лента, 10 μm. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA (h). **p <0,01.
calpain2a инхибира нивото на експресия на TRAF6 протеин чрез протеолитична активност.
За да изследваме регулаторния механизъм на калпаин2а върху TRAF6, първо проучихме дали калпаин2а има ефект върху TRAF6 на ниво протеин. calpain2a-Myc и TRAF6-Flag бяха ко-трансфектирани в EPC клетки, протеиновото ниво на TRAF6 беше частично разградено на 30 h (фиг. 4а). Както е показано на Фиг. 4b, калпаин2а стимулира разграждането на TRAF6 по дозозависим начин. В присъствието на калпаин2а, той не повлиява нивото на тРНК на TRAF6, което показва, че калпаин2а засяга само протеиновото ниво на TRAF6. Междувременно анализът на инхибиторния циклохексимид (CHX) демонстрира, че калпаин2а може да ускори полуживота на протеина TRAF6 (фиг. 4в). Свръхекспресията на калпаин2а в MKC клетки води до дестабилизиране на ендогенния TRAF6 (фиг. 4d). За да се изследва дали разграждането на TRAF6, медиирано от калпаин2а, зависи от убиквитин-протеазома, автофагозома, лизозомни пътища или други, EPC клетките бяха третирани с реагентите, които инхибираха тези пътища: MG132, 3-MA и NH4Cl. Въпреки това, калпаин2а-медиираната дестабилизация на TRAF6 не беше обърната от протеазомния инхибитор MG132, автофагичния инхибитор 3-MA или лизозомния инхибитор NH4Cl (фиг. 4е). След това EPC клетките бяха третирани с реагентите: E-64 (инхибитор на калпаин, който инактивира активността на калпаин хидролаза) и PMSF (инхибитор на неспецифична серин протеаза). Установихме, че инхибиторът на калпаин E-64 предотвратява разграждането на ниво TRAF6 протеин (фиг. 4f). Както е показано на Фиг. 4g, E -64 също обръща разграждането на ендогенните нива на TRAF6 протеин от калпаин2а.
Фиг. 4 калпаин2а инхибира експресията на TRAF6 протеин. a Експериментът с градиент на времето на празни вектори или плазмиди calpain2a-Myc заедно с TRAF6- Flag беше проведен в EPC клетки. Клетъчните лизати бяха подложени на IB с анти-Myc, анти-Flag и анти-тубулин Abs. РНК се екстрахира от клетки и се транскрибира обратно, след което TRAF6 и актин се амплифицират чрез PCR праймери. b EPC клетки се посяват в 12-плаки с гнезда за една нощ и котрансфектирани с TRAF6-Flag и калпаин2a-Myc (0.3, 0.6, или {{ 18}}.9 ug) за 48 часа. Експресията на TRAF6-Flag и calpain2a-Myc протеини беше открита чрез Western blotting. РНК се екстрахира от клетки и се транскрибира обратно, след това TRAF6 и актин се амплифицират чрез PCR праймери. c calpain2a-Myc или празни вектори бяха котрансфектирани с TRAF6-Flag в EPC клетки. На 36-ия час след трансфекцията, трансфектираните клетки бяха третирани с циклохексимид (CHX) за 2 или 4 часа. d MKC клетки бяха трансфектирани с calpain2a-Flag или празни вектори. На 48-ия час след трансфекцията, клетъчните лизати бяха подложени на IB с анти-TRAF6, анти-Flag и анти-Tubulin Abs. e, f EPC клетките бяха трансфектирани с посочените плазмиди в присъствието или отсъствието на MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 или 75 μM) или PMSF за 6 h преди извършването на имуноблот анализ. g MKC клетки бяха трансфектирани с calpain2a-Flag в присъствието или отсъствието на E{{50}} (50 или 75 μM) за 6 часа преди да бъде извършен имуноблот анализ. h calpain2a-Flag и calpain2a-ΔCysPc-Flag бяха котрансфектирани с TRAF6-HA в EPC клетки. На 48-ия час след трансфекцията клетъчните лизати се подлагат на IB с посочени Abs. I calpain2a-Flag и calpain2a-ΔCysPc-Flag бяха котрансфектирани в MKC клетки. На 48-ия час след трансфекцията, клетъчните лизати бяха подложени на IB с анти-TRAF6, анти-Flag и анти-Tubulin Abs. j IL-1, IL-8 mRNA в MKC, стабилно трансдуцирана с calpain2a-Flag и calpain2a-ΔCysPc-Flag и третирана с физиологичен разтвор (0) или провокирана с LPS в продължение на 4 часа (n=3 на група). Относителното ниво на иРНК се нормализира към експресията на гена, кодиращ -актин във всяка проба. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента. Данните бяха анализирани чрез двупосочен ANOVA (j). **p <0,01.
За да се определи дали разграждането на TRAF6 зависи от хидролазната активност на калпаин2а. Възползвайки се от предишни структурни и биохимични изследвания на калпаин2а при бозайници, ние мутирахме остатъците от цистеин, хистидин и аспарагин на калпаин2а до аланин (калпаин2а C105A, H262A, N286A и 3 A), който загуби координацията на каталитичната триада44–46. Ние наблюдавахме, че разграждането на TRAF6 не е повлияно от тази мутация (допълнителна фигура 1а). И така, ние мутирахме протеазния домейн, който е домейнът на цистеин протеаза (CysPc) от семейство Calpain на calpain2a (означен като calpain2a-ΔCysPc). Нито свръхекспресираният TRAF6, нито ендогенният TRAF6 се повлияват от калпаин2а-ΔCysPc (фиг. 4h, i). Въпреки това, провъзпалителните цитокини IL-1 и IL-8 се повлияват едновременно от див тип или мутирал калпаин2а при LPS стимулация (фиг. 4j). Мутантен калпаин2а, лишен от хидролазна активност, не влияе на протеиновото ниво на TRAF6, но мутантният калпаин2а, лишен от хидролазна активност, все още засяга експресията на провъзпалителни цитокини надолу по веригата. Това предизвика нашето разследване на потенциалните механизми, чрез които калпаин2а регулира TRAF6. Взети заедно, тези резултати разкриват, че калпаин2а регулира NF-кВ сигнализирането чрез потискане на експресията на нивата на TRAF6 протеин, чрез неговата активност на калпаин хидролаза.
calpain2a инхибира активността на TRAF6 убиквитин-лигаза.
След това проучихме молекулярните механизми, чрез които калпаин2а регулира негативно TRAF6-активираната NF-кВ сигнализация и дали взаимодействието на калпаин2а с TRAF6 при загуба на ензимна активност модулира неговата активност на убиквитин лигаза. Ние третирахме MKC клетки с LPS и след това имунопреципитирахме TRAF6. Анализът на убиквитиниране с пречистени рекомбинантни протеини потвърди, че калпаин2а и калпаин2а-ΔCysPc намаляват убиквитинирането на TRAF6 (фиг. 5а). Както е показано на Фиг. 5b, c, както калпаин2а, така и калпаин2а-ΔCysPc значително намаляват WT и K63 убиквитинираните протеини на TRAF6. Концентрационните градиенти на калпаин2а и калпаин2а-ΔCysPc намаляват WT и K63 убиквитинираните протеини на TRAF6 по дозозависим начин. calpain2a-ΔCysPc все още предотвратява агрегацията на K63 убиквитинова верига на TRAF6, без да повлиява нивото на TRAF6 протеин (фиг. 5d, e). След това трансфектирахме MKC клетки, за да експресираме Myc-маркиран TRAF6 в присъствието или отсъствието на Flag-маркиран калпаин2a-ΔCysPc, след това проведохме експерименти за имунопреципитация с анти-Myc антитяло и анализирахме чрез имуноблот с анти-UB. Такова убиквитиниране на TRAF6 беше значително отслабено от калпаин2а-ΔCysPc (фиг. 5f). Стимулиран от LPS, TRAF6 доставя K63-свързана убиквитинова верига към TAK1, което стимулира автофосфорилирането на TAK1 и активира NF-κB18. WT и K63 убиквитиновите протеини на TAK1 бяха значително повишени в присъствието на TRAF6, докато TAK1-свързаното убиквитиниране беше инхибирано в присъствието на calpain2a-ΔCysPc (фиг. 5g, h). Тези данни подкрепят, че мутантният калпаин2а без хидролазна активност по подобен начин инхибира TRAF6 убиквитин лигазната активност, без да засяга нивата на TRAF6 протеин.
Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система
calpain2a инхибира хомоолигомеризацията на TRAF6.
Убиквитиновата верига Lys63, синтезирана от TRAF6, играе ключова роля в сигналната трансдукция. Съобщава се, че димеризацията на TRAF6 е от съществено значение за синтеза на неговата убиквитинова верига16. Моделът на димеризация е тясно свързан с комбинацията от Ubc13 за получаване на K63 убиквитиниране 16, 30. За да проверим дали рибата TRAF6 може да образува димери, използвахме TRAF6 плазмиди с различни тагове: Myc-маркиран TRAF6 и HA-маркиран TRAF6 за ко-IP експерименти. IP анализът се извършва с помощта на анти-HA антитяло, HATRAF6 взаимодейства с Myc-TRAF6 (Фиг. 6а). За да се изследва инхибиторният ефект на калпаин2а във взаимодействието на TRAF6-димера, маркиран с флаг калпаин2а, маркиран с HA TRAF6 и маркиран с Myc TRAF6 бяха временно експресирани в клетки HEK293. Както се очакваше, TRAF6-димерното взаимодействие беше намалено в присъствието на калпаин2а (фиг. 6b). В същото време, за да се избегне наличието на разграждане на TRAF6 от калпаин2а. Трансфектирахме маркиран с флаг calpain2a-ΔCysPc и открихме, че взаимодействието на димера TRAF6- постепенно намалява в присъствието на calpain2a-ΔCysPc (фиг. 6в). Както е показано на Фиг. 6d, e, ние открихме, че HA-TRAF6 подобрява WT и K63 убиквитиниране на Myc-TRAF6. Докато клетките HEK293 бяха ко-трансфектирани с калпаин2а и калпаин2а-ΔCysPc, засиленото убиквитиниране ще бъде потиснато. Тези резултати предполагат, че както дивият тип калпаин2а, така и мутантният калпаин2а, лишен от хидролазна активност, инхибират TRAF6 хомоолигомеризацията и авто-убиквитинирането.
calpain2a инхибира доставянето на убиквитиниране на TRAF6 към ECSIT и BECN1.
Както е показано на Фиг. 5d, ние открихме, че калпаин2а пречи на процеса на убиквитилиране от TRAF6 до TAK1. Съобщава се, че ECSIT е действал като адаптерен протеин на TAK1 и TRAF6 за насърчаване на NF-кВ сигнализиране чрез LPS стимулация37. За да проверим дали ECSIT има споменатите функции в риба телеост, ние извършихме множество подравнявания на последователности на ECSIT протеини в хора, мишки и майтап (допълнителна фигура 1b). Ние трансфектирахме EPC клетки с NF-кВ луциферазен репортер, ECSIT значително засили NF-кВ репортерната активност след LPS стимулация (допълнителна фигура 1в). Свръхекспресията на ECSIT в MKC клетки доведе до повишаване на нивото на mRNA на TNF- (допълнителна фигура 1d). След трансфектирани риби ECSIT и TRAF6 в HEK293 клетки, ние открихме, че TRAF6 взаимодейства с ECIST (Фиг. 7а). По подобен начин, ECSIT и TAK1 бяха ко-трансфектирани и двата протеина също поддържаха взаимодействие (фиг. 7b). Впоследствие, за да проверим дали calpain2a-ΔCysPc инхибира образуването на TRAF6-ECSIT комплекса, ние трансфектирахме трите плазмида в HEK293 клетки и открихме, че calpain2a-ΔCysPc предотвратява TRAF6-ECSIT комплекса (фиг. 7c). ). За проверка на процеса на предаване на убиквитиновата верига в NF-κB сигнализиране. Както е показано на Фиг. 7d, TRAF6 може да насърчи повсеместното разпространение на ECSIT; както се очаква, calpain2a-ΔCysPc инхибира процеса, чрез който TRAF6 предава убиквитиновата верига към ECSIT. BECN1 е важен протеин в LPS-индуцираната автофагия. Потвърдено е, че убиквитинирането на K63 може да модифицира и активира BECN1. Деубиквитиниращият ензим А20 премахва убиквитинирането на BECN1 и инхибира автофагията, причинена от LPS, а TRAF6 е E3 лигаза, отговорна за убиквитинирането на BECN1 в този сигнал47. Както е показано на Фиг. 7е, TRAF6 взаимодейства с BECN1 и насърчава убиквитинирането на BECN1. След това трансфектирахме BECN1, TRAF6, calpain2a и calpain2a-ΔCysPc в HEK293 клетки, TRAF6 насърчава убиквитинирането на BECN1. calpain2a-ΔCysPc инхибира процеса, чрез който TRAF6 предава убиквитиновата верига към BECN1 (фиг. 7f). Тези резултати предполагат, че дивият тип калпаин2а и мутантният калпаин2а без хидролазна активност инхибират способността за убиквитиниране на TRAF6 в LPS-индуцирана автофагия и NF-кВ сигнализиране.
Отрицателна регулация на антивирусния отговор от калпаин2а.
В пътя на RLR, TRAF6 действа като E3 лигаза, привлечена от MAVS за активиране на NF-κB, производството на IFN и цитокини. След това проверихме дали калпаин2а играе роля в предотвратяването на TRAF6 в IFN-медиирания антивирусен процес. В EPC клетки, IFN-1, ISRE и IRF3 управлявани от промотор луциферазни репортери бяха експресирани. Ние открихме, че калпаин2а значително намалява тези управлявани от промотор луциферазни активности по дозозависим начин при стимулиране на Ploy (I: C) и инфекция с рабдовирус (SCRV) на Siniperca cheats (фиг. 8a, b). Нокдаунът на калпаин2а значително засили Ploy(I: C) и SCRV-задействаната генна експресия, включително Viperin, Mx1 и ISG15 (фиг. 8c, d). Нокдаунът на калпаин2а доведе до по-висока експресия на клетъчна жизнеспособност при SCRV инфекция в MKC клетки (фиг. 8е). Както е показано на Фиг. 8f, анализите на клетъчна пролиферация разкриха, че нокдаунът на калпаин2а засилва клетъчната пролиферация при SCRV инфекция. Свръхекспресията на калпаин2а рязко насърчава размножаването на вируса, както се отразява от вирусната репликация след SCRV инфекция (фиг. 8g). calpain2a и calpain2a-ΔCysPc значително намаляват IFN-1, ISRE и IRF3 управлявани от промотор луциферазни репортери при Ploy(I:C) стимулация и SCRV инфекция (допълнителна фигура 2a, b). Тези резултати предполагат, че калпаин2а може да регулира негативно RLR сигналния път чрез инхибиране на TRAF6, като по този начин инхибира активирането на IFN.
Фиг. 5 калпаин2а инхибира активността на TRAF6 убиквитин-лигаза. a Убиквитиниране на ендогенен TRAF6 в MKC клетки, трансдуцирани с calpain2a-Flag и calpain2a-ΔCysPc-Flag и непредизвикани (-) или провокирани с LPS (+), оценени чрез имуноблот анализ с анти-убиквитин след имунопреципитация с анти-TRAF6 и входен имуноблот анализ с посочени абс. b, c HEK293 клетки бяха котрансфектирани с TRAF6-HA и WT-убиквитин-His или K63O убиквитин-His (в който се съхранява само лизин 63) заедно с calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. d, e HEK293 клетки бяха котрансфектирани с TRAF{{30}}HA и WT-ubiquitin-His или K63O-ubiquitin-His (в които се запазва само лизин 63) заедно с calpain2a-Flag ({{45 }}.5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. f Убиквитиниране на свръхекспресиран TRAF6 в MKC клетки, трансдуцирани с calpain2a-ΔCysPc-Flag, оценено чрез имуноблот анализ с анти-убиквитин след имунопреципитация с анти-Myc и входящ имуноблот анализ с посочени Abs. g, h HEK293 клетки бяха котрансфектирани с TAK1-Myc, TRAF6-HA и WT-ubiquitin-His или K63O-ubiquitin-His (в които се съхранява само лизин 63) заедно с calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. Всички имунопреципитати и входен имуноблот анализ с анти-Myc, анти-Flag, анти-HA и анти-Tubulin Abs. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента.
calpain2a потиска убиквитинирането на IRF3 и IRF7 от TRAF6.
Съобщава се, че в антивирусния сигнал, задействан от комплекса MAVS-TRAF3/6, активността на TRAF6 е необходима за активирането на IRF3 и NF-κB48. Както е показано на Фиг. 9a, b, TRAF6 насърчава WT и K63-свързаното убиквитиниране на IRF3 и това подобрение се инхибира от експресията на calpain2a-ΔCysPc. Междувременно, когато вирусът задейства TLR-зависим сигнален сигнал, TRAF6 е тясно свързан с IRF7 и насърчава убиквитинирането на IRF7 заедно с активирани антивирусни фактори 22, 49, 50. TRAF6 насърчава WT и K63-свързаното убиквитиниране на IRF7 и това подобрение се инхибира от експресията на calpain2a-ΔCysPc (фиг. 9c, d). Тези данни предполагат, че дивият тип калпаин2а и мутантен калпаин2а без хидролазна активност инхибират TRAF6-медиираната убиквитинация на IRF3 и IRF7.
Дискусия
TRAF6 е един от седемте члена на фамилията фактори, свързани с рецептора на тумор некротизиращ фактор (TNF) (TRAFs), който е идентифициран като сигнален адаптер и упражнява сигнална трансдукция 51, 52. Фамилията TRAF съдържа домейна на безименния пръст, който притежава Е3 лигазната активност. E3 лигазите с HECT домейна насърчават полиубиквитинирането на субстрата, а E3s с Ring домейна изискват E2~ub за предаване на полиубиквитиниране 53, 54. Потвърдено е, че димерът Ub-свързващ ензим Ubc13/Uev1A участва в агрегацията на TRAF6 полиубиквитинация16. Докато K124 на TRAF6 на мишка е нокаутиран, TRAF6 ще загуби активността на K63 авто-убиквитиниране и мутацията на това място елиминира убиквитинирането на TRAF6-медиирания NEMO и активирането на TAK1, IKK и NF-κB55 . Това е точно, защото PRDX1 се свързва с домейна TRAF6 Ring Finger, съдържащ се в K124, и елиминира убиквитинирането на TRAF638. Съобщава се, че убиквитинирането на TRAF6 е тясно свързано с димеризацията на неговия N-терминален домейн (домейн на безименния пръст и ZF пръстите). Множество N-терминални сайтове за взаимодействие с Ubc13 бяха мутирани и Ubc13 не можеше да предаде poly~ub към TRAF616. Взаимодействието между калпаин2а и TRAF6 мутанти показа, че повечето от домейните на TRAF6 взаимодействат с калпаин2а, с изключение на домейна на безименния пръст. Поради взаимодействието между calpain2a и домейна на ZF пръстите на TRAF6, ние спекулирахме, че calpain2a може да инхибира авто-убиквитирането чрез блокиране на димеризацията на TRAF6. Впоследствие проверихме взаимодействието на различни тагове на TRAF6. Тъй като експресията на мутантен калпаин2а без хидролазна активност се увеличава, взаимодействието на различни тагове на TRAF6 отслабва. HA-маркиран TRAF6 насърчава убиквитинирането на Myc-маркиран TRAF6, а мутантният калпаин2а инхибира убиквитинирането, засилено от HA-маркирания TRAF6. Като междинен продукт в процеса на предаване на сигнала TRAF6-TAK1, ECSIT се свързва към С-терминалния домейн на TRAF6 (CC домейн и TRAF-C домейн) и е потвърдено, че участва в NF-κB сигнализирането37. Експресията на провъзпалителни цитокини намалява в ECSITKD THP-1 клетки. Въпреки това, след свръхекспресия на ECSIT в ECSITKD THP-1 клетки, гени като IRF7, IL-1 и CD44 се увеличават значително37. PRDX1 се свързва с домейна на безименния пръст на TRAF6 и инхибира убиквитинирането на ECSIT и BECN1 в NF-кВ и сигнали за автофагия чрез инхибиране на образуването на TRAF6 полиубиквитиниране38. При телест риба потвърдихме, че ECSIT активира NF-κB сигнален път, взаимодейства съответно с TRAF6 и TAK1 и предава полиубиквитиновата верига, произведена от TRAF6. calpain2a се свързва с ZF домейна, CC домейна и TRAF-C домейна на TRAF6, което инхибира взаимодействието на TRAF6-ECSIT. Ние потвърдихме, че мутантният калпаин2а без хидролазна активност предотвратява полиубиквитиновата верига от TRAF6 до ECSIT и BECN1.
Фиг. 6 калпаин2а отслабва автоубиквитинирането на TRAF6. a HEK293 клетки бяха трансфектирани с TRAF6-Myc, TRAF6-HA или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и IP анализирани с НА антитяло. b HEK293 клетки бяха трансфектирани с TRAF6-Myc, TRAF6-HA, празен вектор или calpain2a-Flag. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и IP анализирани с НА антитяло. c HEK293 клетки бяха трансфектирани с TRAF6-Myc, TRAF6-HA, празен вектор или различни концентрации на calpain2a-ΔCysPc-Flag. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и IP анализирани с НА антитяло. d, e HEK293 клетки бяха котрансфектирани с TRAF6-Myc, TRAF6-HA и WT-ubiquitin-His или K63O-ubiquitin-His (в които се съхранява само лизин 63) заедно с calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. Имунопреципитатите и входящият имуноблот анализ с анти-Myc, анти-Flag, анти-HA и анти-Tubulin Abs. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента.
Фиг. 7 калпаин2а инхибира TRAF6-медиираната убиквитинация на ECSIT и BECN1. a HEK293 клетки бяха трансфектирани с ECSIT-Myc, TRAF6-Flag или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и IP анализирани с Flag антитяло. b HEK293 клетки бяха трансфектирани с TAK1-Flag, ECSIT-Myc или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и IP анализирани с Myc антитяло. c HEK293 клетки бяха трансфектирани с TRAF6-Myc, ECSIT-HA, празен вектор или различни концентрации на калпаин2а-ΔCysPc-Flag. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и IP анализирани с Myc антитяло. d HEK293 клетки бяха котрансфектирани с ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His заедно с calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. e HEK293 клетки бяха трансфектирани с BECN1-Flag, TRAF6-Myc или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и IP анализирани с Myc антитяло. f HEK293 клетки бяха котрансфектирани с BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His заедно с calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. Имунопреципитатите и входовете с анти-Myc, анти-Flag, анти-HA и анти-Tubulin Abs. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента.
Забелязваме, че калпаин2а има хидролазна активност като една от семейството на калций-зависими протеази. m-калпаин (калпаин-2) играе положителна регулаторна роля в NF-κB сигналния път на HepG2 чернодробни клетки. Независимо от 26 s протеазомния подход, калпаин2а хидролизира IkB, за да освободи транскрипционния фактор NF-κB. Специфичният инхибитор на протеина калпаин предотвратява разграждането на IkB 56. За калпаина обаче има малко изследвания върху вродения имунен отговор на рибите. В MKC клетки, свръхекспресията на калпаин2а инхибира NF-кВ низходящите провъзпалителни цитокини, индуцирани от LPS. Това явление противоречи на резултатите в HepG2 чернодробни клетки. Възможно е видовата специфика на семейството на калпаинови протеини да е причинила различни ефекти. По подобен начин използвахме специфичния инхибитор на калпаиновия протеин E -64, за да предотвратим хидролизиране на TRAF6 от калпаин2а. Мутантен калпаин2а, лишен от хидролазна активност, инхибира активността на TRAF6 убиквитин лигаза, без да повлиява неговите протеинови нива. Не открихме ензимно-активни места за калпаин2а. Според предишни проучвания при бозайници, трите места: са цистеин (C105A), хистидин (H262A) и аспарагинови остатъци (N286A). Въпреки това, нашите експерименти потвърждават, че трите активни места на miiuy croaker calpain2a не влияят върху експресията на нивата на TRAF6 протеин, но мутантният calpain2a без домейн на хидролаза го прави. Затова избрахме да мутираме целия ензим-активиращ структурен домейн. Въпреки че протеинът калпаин2а е относително запазен при бозайници и по-ниски гръбначни, специфичните места на ензимна активност заслужават допълнително изследване.
растение цистанче, повишаващо имунната система
В обобщение, ние идентифицирахме калпаин2а като отрицателен регулатор на LPS-индуцирано NF-кВ сигнализиране и индуцирано от вирус IFN активиране (Фиг. 9е). В масовата спектрометрия калпаин2а може да взаимодейства с TRAF6 и ние демонстрирахме това явление чрез ендогенен експеримент за коимунопреципитация. Открихме, че калпаин2а участва в регулирането на LPS-индуцирания NF-κB сигнален път. В допълнение TRAF6 също играе важна роля в антивирусните сигнални пътища. Използвахме SCRV и Ploy (I: C), за да стимулираме IFN сигналния път и открихме, че калпаин2а може също да инхибира IFN сигнализирането чрез регулиране на протеиновото ниво и автоубиквитинирането на TRAF6. Тъй като TLR3 може да разпознае структурата на двойноверижната РНК (dsRNA), произведена от вирусни инфекции. Ние сме по-заинтересовани от изясняване на регулирането на калпаин2а на TRAF6-медиирания IFN сигнален път, но не изключваме потенциална връзка между сигналния път на калпаин2а и TLR3. calpain2a насърчава разграждането на TRAF6 по хидролитичен начин и взаимодейства с TRAF6, за да инхибира образуването на димери и авто-убиквитиниране. Това инхибиране предотвратява взаимодействието на TRAF6 и ECSIT и процеса на трансфер на убиквитиниране от TRAF6 към ECSIT, BECN1, IRF3 и IRF7. Нашите текущи резултати ще допринесат за разбирането на механизмите на отрицателна регулация чрез насочване към TRAF6 във вродени имунни отговори. В допълнение, това изследване показва ключовата роля на хомоолигомеризацията и авто-убиквитинирането на TRAF6 в процеса на вродения имунен отговор на рибите. Едновременно с това калпаин2а се предлага като протеин на регулаторния механизъм за инхибиране на имунния отговор на TRAF6 и предотвратяване на нормалните и подредени сигнални пътища. Прозренията са полезни за разбирането на имунологията на гръбначните и еволюцията на имунната система на гръбначните.
Фиг. 8 калпаин2а инхибира SCRV- или Poly(I:C)-индуцирано IFN активиране. ab EPC клетки бяха трансфектирани с различни концентрации на calpain2a-Flag или празен вектор заедно с IFN-1, ISRE и IRF3-пролуциферазни репортери. На 24-ия час след трансфекцията, клетките бяха фалшиво инфектирани или инфектирани с SCRV или Poly(I: C) за 12 часа (n=3 на група). Western blot анализът беше използван за измерване на експресията на преходно трансфектиран калпаин2а-флаг. Експресията на тубулин се използва като контрола на натоварването. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNA в MKC, стабилно трансдуцирана със si-calpain2a #1 или si-ctrl (контролен вектор) и третирана с физиологичен разтвор (0) или провокирана с SCRV или Poly(I: C) за 24 ч. Относителното ниво на иРНК се нормализира към експресията на гена, кодиращ -актин във всяка проба (n=3 на група). e, f MKC клетки бяха трансфектирани или със si-ctrl, или със si-calpain2a #1. На 24-ия час след трансфекцията клетките бяха стимулирани с SCRV в продължение на 24 часа, след което бяха измерени анализ на клетъчната жизнеспособност и анализ на клетъчна пролиферация (n=3 на група). Мащабна лента, 100 μm. g MKC клетки бяха трансфектирани с calpain2a-Flag или pcDNA3.1, след това заразени с SCRV за 24 часа (n=3 на група). Анализът qRT-PCR беше проведен за експресия на вътреклетъчна и супернатантна SCRV РНК. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA (a, b), двупосочен ANOVA (c, d, e, f) или двустранен t-тест на Student (g). *p <0,05, **p <0,01.
Методи
Клетъчна култура.
Клетъчни линии от човешки ембрионален бъбрек (HEK) 293 и клетъчни линии Epitelioma papulosum cyprini (EPC) бяха закупени от American Type Culture Collection и се съхраняваха в нашата лаборатория. Бъбречни клетъчни линии на горбав (M. miiuy) (MKC) и чревни клетъчни линии на горбав Miiuy (MIC) бяха култивирани от бъбречни и чревни тъкани на горбав мииуи57,58. Бъбречни клетъчни линии на Miiuy и чревни клетъчни линии на горбав Miiuy се култивират при 26 градуса във влажен инкубатор, съдържащ 0.5% CO2 в L-15 среда (HyClone, САЩ), допълнена с 15% FBS (Gibco , САЩ), 100 U/ml пеницилин (Gibco, САЩ), 100 ug/ml стрептомицин (Gibco, САЩ) и 20 U/ml хепарин (Solarbio, Китай). Клетките на Epitelioma papulosum cyprini се отглеждат при 26 градуса в овлажнен инкубатор, съдържащ 5% CO2 в среда 199 (Hyclone), допълнена с 10% FBS, 2 mM L-глутамин, 100 U/ml пеницилин и 100 mg/ml стрептомицин. Клетки 293 от човешки ембрионален бъбрек се отглеждат при 37 градуса във влажен инкубатор, съдържащ 5% CO2 в модифицирана среда на Eagle на Dulbecco (DMEM) (Invitrogen), допълнена с 10% FBS, 2 mM L-глутамин, 100 U/ml пеницилин и 100 mg /ml стрептомицин.
Фиг. 9 калпаин2а инхибира TRAF6-медиираната убиквитинация на IRF7 и IRF3. b HEK293 клетки бяха котрансфектирани с IRF3-Myc, TRAF6-HA и WTubiquitin-His или K63O-ubiquitin-His (в които се запазва само лизин 63) заедно с calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Флаг или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. c, d HEK293 клетки бяха котрансфектирани с IRF7-Myc, TRAF6-HA и WT-ubiquitinHis или K63O-ubiquitin-His (в които се съхранява само лизин 63) заедно с calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-флаг или празен вектор. След 24 часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и пречистени с Ni-NTA агароза. Всички имунопреципитати и вход с анти-Myc, анти-Flag, анти-HA и анти-Tubulin Abs. Всички експерименти бяха проведени в най-малко три независими експеримента. e Модел, описващ подробно ролите на калпаин2а в TRAF6-медиираните сигнални пътища. При LPS и вирус, TRAF6 може да се активира, хомо-олигомеризация и авто-убиквитиниране. BECN1, ECSIT, IRF7 и IRF3 са убиквитинирани от TRAF6 и задействат активирането на сигнали надолу по веригата. calpain2a като отрицателен регулатор е насочен към TRAF6, за да инхибира TRAF6-медиираните сигнални пътища.
Препратки
1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Разпознаване на патогени и вроден имунитет. Клетка 124, 783–801 (2006).
2. Takeuchi, O. & Akira, S. Рецептори за разпознаване на образи и възпаление. Клетка 140, 805–820 (2010).
3. Wu, J. & Chen, ZJ Вродено имунно усещане и сигнализиране на цитозолни нуклеинови киселини. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).
4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Тол-подобни рецептори. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).
5. Schlee, M. Главни сензори на патогенна РНК - RIG-I подобни рецептори. Имунобиология 218, 1322–1335 (2013).
6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR протеини: неразделни членове на вродения имунитет и медиатори на възпалителни заболявания. J. Leukoc. Biol. 83, 13–30 (2008).
7. Akira, S. & Hemmi, H. Разпознаване на свързани с патогени молекулярни модели от семейството на TLR. Immunol. Лет. 85, 85–95 (2003).
8. Kawai, T. & Akira, S. Ролята на рецепторите за разпознаване на модели във вродения имунитет: актуализация на Toll-подобни рецептори. Нац. Immunol. 11, 373–384 (2010).
9. Kawagoe, T. et al. Последователен контрол на Toll-подобни рецептор-зависими отговори от IRAK1 и IRAK2. Нац. Immunol. 9, 684–691 (2008).
10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4-споделен NF-kappaB активатор при вроден и придобит имунитет. Тенденции Immunol. 27, 566–572 (2006).
11. Kawai, T. & Akira, S. TLR сигнализиране. Клетъчна смърт Разл. 13, 816–825 (2006).
12. Deng, L. et al. Активирането на IkappaB киназния комплекс от TRAF6 изисква димерен убиквитин-конюгиращ ензимен комплекс и уникална полиубиквитинова верига. Клетка 103, 351–361 (2000).
13. Ninomiya-Tsuji, J. et al. Киназата TAK1 може да активира NIK-I kappaB, както и MAP киназната каскада в IL-1 сигналния път. Nature 398, 252–256 (1999).
14. Takaesu, G. et al. TAB2, нов адаптерен протеин, медиира активирането на TAK1 MAPKKK чрез свързване на TAK1 към TRAF6 в пътя на сигнална трансдукция на IL-1. Mol. клетка. 5, 649–658 (2000).
15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm медиирана транслокация на TRAF6 и TAB2 в интерлевкин-1-индуцираното активиране на NF-kappa BJ Biol. Chem. 276, 41661–41667 (2001).
16. Yin, Q. et al. E2 взаимодействие и димеризация в кристалната структура на TRAF6. Нац. Структура. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).
17. Wang, C. et al. TAK1 е убиквитин-зависима киназа на MKK и IKK. Nature 412, 346–351 (2001).
18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF клетъчно-специфична функция на TAK1 при вродена имунна сигнализация. Тенденции Immunol. 34, 307–316 (2013).
19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. Неочакван обрат в активирането на IKKbeta: TAK1 подготвя IKKbeta за активиране чрез автофосфорилиране. Biochem. J. 461, 531–537 (2014).
20. Emmerich, CH et al. Активиране на каноничния IKK комплекс от K63/M1- свързани хибридни убиквитинови вериги. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247–15252 (2013).
21. Kawai, T. et al. Индукцията на интерферон-алфа чрез Toll-подобни рецептори включва директно взаимодействие на IRF7 с MyD88 и TRAF6. Нац. Immunol. 5, 1061–1068 (2004).
22. Kitagawa, Y. et al. Протеинът на човешки парагрипен вирус тип 2 V инхибира TRAF6-медиираната убиквитинация на IRF7, за да предотврати TLR7- и TLR9- зависима индукция на интерферон. J. Virol. 87, 7966–7976 (2013).
23. Kawai, T. et al. IPS-1, адаптер, задействащ RIG-I- и Mda5-медиирана индукция на интерферон тип I. Нац. Immunol. 6, 981–988 (2005).
24. Zust, R. et al. Рибоза 2'-О-метилирането осигурява молекулярна сигнатура за разграничаване на собствена и несобствена иРНК в зависимост от РНК сензора Mda5. Нац. Immunol. 12, 137–143 (2011).
25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ Идентифициране и характеризиране на MAVS, митохондриален антивирусен сигнален протеин, който активира NF kappaB и IRF 3. Cell 122, 669–682 (2005).
26. Xu, LG и др. VISA е адаптерен протеин, необходим за задействано от вирус IFN бета сигнализиране. Mol. клетка. 19, 727–740 (2005).
27. Йошида, Р. и др. TRAF6 и MEKK1 играят основна роля в RIG-I-подобния хеликазен антивирусен път. J. Biol. Chem. 283, 36211–36220 (2008).
28. Liu, S. et al. MAVS набира множество убиквитин Е3 лигази, за да активира антивирусни сигнални каскади. Elife 2, e00785 (2013).
29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT Регулиране на отговорите на интерферон тип I. Нац. Rev. Immunol. 14, 36–49 (2014).
30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. Механизъм на трансфер на убиквитин, насърчаван от TRAF6. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).
31. Boone, DL et al. Убиквитин-модифициращият ензим А20 е необходим за прекратяване на Toll-подобни рецепторни отговори. Нац. Immunol. 5, 1052–1060 (2004).
32. Коваленко, А. и др. Туморният супресор CYLD регулира негативно NF kappaB сигнализирането чрез деубиквитиниране. Nature 424, 801–805 (2003).
33. Той, X. и др. USP2a регулира негативно IL-1бета- и индуцираното от вирус NF kappaB активиране чрез деубиквитиниране на TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39–47 (2013).
34. Xiao, N. et al. Убиквитин-специфичната протеаза 4 (USP4) е насочена към TRAF2 и TRAF6 за деубиквитиниране и инхибира индуцираната от TNFalpha миграция на ракови клетки. Biochem. J. 441, 979–986 (2012).
35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT. Убиквитин-специфичната пептидаза 20 е насочена към TRAF6 и таксата на човешкия Т-клетъчен левкемичен вирус тип 1, за да регулира негативно NF-kappaB сигнализирането. J. Virol. 85, 6212–6219 (2011).
36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O регулира отрицателно TRAF6-медиирано NF-kappaB активиране чрез инхибиране на полиубиквитинирането на TRAF6. Cell Res. 23, 366–377 (2013).
37. Wi, SM et al. Комплексът TAK1-ECSIT-TRAF6 играе ключова роля в сигнала TLR4 за активиране на NF-kappaB. J. Biol. Chem. 289, 35205–35214 (2014).
38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY Инхибирането на активността на TRAF6 убиквитин-лигаза от PRDX1 води до инхибиране на активирането на NFKB и активирането на автофагията. Автофагия 14, 1347–1358 (2018).
39. Jiao, S. et al. Киназата MST4 ограничава възпалителните реакции чрез директно фосфорилиране на адаптера TRAF6. Нац. Immunol. 16, 246–257 (2015).
40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 и Calpain-2: Ин и Ян на синаптичната пластичност и невродегенерация. Тенденции Neurosci. 39, 235–245 (2016).
41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Регулиране на клетъчната миграция: калпаините правят разреза. J. Cell Sci. 118, 3829–3838 (2005).
42. Katsube, M. et al. Калпаин-медиирана регулация на отделните сигнални пътища и клетъчна миграция в човешки неутрофили. J. Leukoc. Biol. 84, 255–263 (2008).
43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Ефектите от инхибирането на калпаин върху разграждането на IkB алфа след активиране на PBMCs: идентифициране на местата на разцепване на калпаин. Neurochem. Рез. 29, 1443–1451 (2004).
44. Томпа, П. и др. Относно последователните детерминанти на разцепването на калпаин. J. Biol. Chem. 279, 20775–20785 (2004).
45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Определяне на специфичността на пептидния субстрат за mu-calpain чрез подход, базиран на пептидна библиотека: значението на първичните странични взаимодействия. J. Biol. Chem. 280, 40632–40641 (2005).
46. DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Предсказване на разцепването на Calpain с помощта на обучение на множество ядра. PLoS One. 6, e19035 (2011).
47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 и A20 регулират 63-свързаното с лизин убиквитиниране на Beclin-1 за контролиране на TLR4-индуцираната автофагия. Sci. Сигнал. 3, ra42 (2010).
48. Loo, YM & Gale, M. Имунна сигнализация от RIG-I-подобни рецептори. Имунитет 34, 680–692 (2011).
49. Линг, Т. и др. TARBP2 инхибира активирането на IRF7 чрез потискане на TRAF6-медиираната K63-свързана убиквитинация на IRF7. Mol. Immunol. 109, 116–125 (2019).
50. Zhou, Z. et al. Zebrafish otud6b регулира негативно антивирусните отговори чрез потискане на K63-свързаното убиквитиниране на irf3 и irf7. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).
51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. Ролята на TRAF6 в сигналната трансдукция и имунния отговор. Микробите заразяват. 6, 1333–1338 (2004).
52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, молекулярен мост, обхващащ адаптивен имунитет, вроден имунитет и остеоимунология. Биоесета 25, 1096–1105 (2003).
53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: структури, функции, механизми. Biochim. Biophys. Acta. 1695, 55–72 (2004).
54. Pickart, CM & Fushman, D. Полиубиквитинови вериги: полимерни протеинови сигнали. Curr. мнение Chem. Biol. 8, 610–616 (2004).
55. Lamothe, B. et al. Специфичното за място автоубиквитиниране на фактор 6, свързано с Lys-63-свързан фактор на туморна некроза, е критичен фактор за активирането на I kappa B киназа. J. Biol. Chem. 282, 4102–4112 (2007).
56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Tumor necrosis factor-alpha-inducible IkappaBalpha протеолиза, медиирана от цитозолен m-calpain. Механизъм, паралелен на убиквитин-протеазомния път за активиране на ядрен фактор-капа В. J. Biol. Chem. 274, 787–794 (1999).
57. Chu, Q. et al. Силно запазена кръгова РНК circRasGEF1B подобрява антивирусния имунитет чрез регулиране на miR-21-3p/MITA пътя при по-ниски гръбначни. J. Virol. 95, e02145–20 (2021).
58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a индуцира аутофагия, за да блокира NF-kappaB сигнализиране и апоптоза, за да улесни инфекцията с Vibrio harveyi. iScience 26, 106105 (2023).
59. Sepulcre, MP и др. Еволюция на разпознаването и сигнализирането на липополизахариди (LPS): TLR4 на рибата не разпознава LPS и регулира негативно активирането на NF kappaB. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).
60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Дългата некодираща РНК NARL регулира имунните отговори чрез микроРНК-медиирана NOD1 низходяща регулация в костни риби. J. Biol. Chem. 296, 100414 (2021).
61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Екзон-интронна циркулярна РНК circRNF217 насърчава вродения имунитет и антибактериалната активност в телеостните риби чрез намаляване на miR-130-3p функция. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).
62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Rhabdovirus-индуцируемата микроРНК -210 модулира антивирусния вроден имунен отговор чрез насочване към STING/MITA в риба. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).
63. Bi, D. et al. Разпознаване на липополизахарид и активиране на NF-kappaB от цитозолен сензор NOD1 в телеста риба. Преден. Immunol. 9, 1413 (2018).
64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 и IRF8 регулират сигнализирането на NF-kappaB чрез насочване към MyD88 в риба Teleost. Преден. Immunol. 11, 606 (2020).
65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k инхибира NF-kappaB сигнализирането чрез насочване към MyD88 за ATG5-медиирано автофагично разграждане в риби телеост. J. Biol. Chem. 298, 101730 (2022).