Екстрацелуларната ацидоза ограничава едновъглеродния метаболизъм и запазва стволовите Т клетки

Натрупването на киселинни метаболитни отпадъчни продукти в туморната микросреда инхибира ефекторните функции на лимфоцитите, раздуващи тумора (TIL). Въпреки това, остава неясно как киселинната среда влияе на метаболизма и диференциацията на Т клетките. Тук показваме, че продължителното излагане на киселина препрограмира вътреклетъчния метаболизъм на Т клетките и митохондриалната годност и запазва стволовостта на Т клетките. Механично, повишената екстрацелуларна ацидоза уврежда усвояването и метаболизма на метионин чрез регулиране надолу на SLC7A5, следователно променя отлагането на H3K27me3 в промоторите на ключови гени на стволовите Т клетки. Тези промени насърчават поддържането на състояние на „подобна на ствола памет“ и подобряват дългосрочната in vivo устойчивост и антитуморната ефикасност при мишки. Нашите открития не само разкриват неочаквана способност на извънклетъчната ацидоза да поддържа стволовите свойства на Т-клетките, но също така подобряват нашето разбиране за това как метаболизмът на метионин влияе върху стволовостта на Т-клетките.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Адоптивният трансфер на тумор-антиген-специфични Т клетки представлява голям напредък в областта на терапията на рака, тъй като е довел до пълна регресия на някои злокачествени заболявания. Неговата терапевтична ефикасност зависи до голяма степен от устойчивостта и състоянието на диференциация на прехвърлените Т клетки 1,2. По-малко диференцираните Т-клетки на паметта са предпочитаната популация за адаптивен Т-клетъчен трансфер (ACT) поради техните подобни на стволови клетки свойства на самообновяване и мултипотентност 3,4. В действителност е доказано, че използването на подобни на стволови Т клетки на паметта за ACT постига превъзходни антитуморни отговори5. В сравнение с терминално диференцираните ефекторни Т клетки, стволовите Т клетки показват различни отличителни белези6. Както човешки, така и миши стволови подобни Т-клетки се характеризират с тяхната експресия на антиген-преживени и свързани с насочване молекули, включително високи нива на CD62L и CCR7 (реф. 7). Нашето разбиране за транскрипционните профили, епигенетичните модификации и метаболитните пътища, които регулират подобните на стволови Т клетки, драстично напредна през последните години8-10. Съобщава се, че няколко транскрипционни фактора, като TCF1, KLF2 и LEF1, играят съществена роля в задвижването или поддържането на стволови Т клетки9. Трябва да се отбележи, че TCF1 е ключовият транскрипционен фактор, който насърчава генерирането на дълготрайни Т клетки на паметта11. По време на хронични инфекции, малка част от TCF1+ стволови Т клетки поддържат Т клетъчни отговори срещу вторична инфекция1,12. Епигенетичните промени осигуряват средство за Т клетките както да инициират транскрипционните промени, които са в основата на придобиването на характеристиките на клетките на паметта, така и да поддържат тези модели на транскрипционна експресия13. Множество проучвания показват, че триметилирането на хистон H3 при K4 (H3K4me3), свързана с активирането модификация, се получава в генни локуси, свързани с паметта, включително TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 и SELL, по време на диференциацията на наивни CD{{47 }} Т клетки в Т клетки на паметта, докато триметилирането на Н3 при K27 (H3K27me3), репресивна модификация, се губи в тези локуси 13–15. Обратно, асоциираните с ефектор гени (GZMB, PRF1, IFNG и TBX21) демонстрират намалени репресивни и повишени активиращи епигенетични модификации в тези локуси в ефекторни Т клетки 13, 16. И накрая, натрупването на доказателства предполага, че метаболитните вериги диктуват решенията за съдбата на Т клетките и оформят техните епигенетични и функционални състояния17. Краткоживеещите ефекторни Т-клетки са силно гликолитични и зависят от метаболизма с един въглерод18,19, докато стволовите Т-клетки на паметта показват различни метаболитни профили, характеризиращи се с повишено окисление на мастни киселини (FAO) и митохондриален резервен респираторен капацитет (SRC), кардиналът характеристики, включени в дългосрочната устойчивост 20–22. Следователно, метаболитното препрограмиране е важно за ефективното придобиване на стволовост и дългосрочно оцеляване на Т клетките.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Имуносупресивната туморна микросреда (TME), характеризираща се с ниско pH, хипоксия, лишаване от глюкоза и обогатяване с млечна киселина, е ключовата бариера, възпрепятстваща правилното разрастване, диференциация и функционалност на Т клетките 23, 24. Наистина, метаболитният стрес, наложен от TME, уврежда капацитета и годността на митохондриите, предизвиквайки интратуморна Т-клетъчна метаболитна недостатъчност и дисфункция 25–28. Интересно е, че повечето тумор-инфилтриращи лимфоцити (TILs) са дисфункционални, но малка част притежава памет, подобна на стъбло, или свойства на прекурсор7,29. Тази подгрупа TIL, подобна на стебло, запазва пролиферативния потенциал и устойчивост и е свързана с благоприятен отговор на блокада на имунна контролна точка (ICB) и TIL-ACT при хора с рак11,30. Предишни проучвания показват, че повишената екстрацелуларна ацидоза (↑[H+]) потиска цитолитичната активност на Т клетките както in vitro, така и in vivo 31–33. В допълнение, киселинният TME има значително влияние върху активността и диференциацията на туморно-инфилтриращите миелоидни клетки, като дендритни клетки (DCs) и тумор-асоциирани макрофаги (TAMs) 34-36. Въпреки това, въздействието на ↑[H+] върху стволовостта на Т клетките и метаболитната годност остава до голяма степен неизвестно. Тук съобщаваме, че дългосрочната in vitro експозиция на ↑[H+] улеснява диференциацията на човешки и миши стволови подобни CD8+ Т клетки за сметка на крайните ефекторни CD8+ Т клетки. Ние открихме, че дългосрочното лечение с ↑[H+] ремоделира метаболизма на Т-клетките и поддържа митохондриалния респираторен капацитет. Освен това, постоянната експозиция на ↑[H+] нарушава усвояването и метаболизма на метионин, което впоследствие води до намалено отлагане на H3K27me3 на гени, свързани с паметта, като по този начин улеснява поддържането на състояние на „памет, подобна на ствола“. И накрая, адоптивният трансфер на Т клетки, култивирани в ↑[H+]-условия, показва мощна антитуморна активност in vivo, в съответствие с техния по-малко изтощен фенотип. По този начин, нашето проучване разкрива неочакваната роля на извънклетъчната ацидоза за запазване на стволовостта на Т клетките чрез ремоделиране на клетъчния метаболизъм и епигенетичните модели.

Резултати

↑[H+ ] експозицията насърчава CD8+ T стволови клетки

За да определим дали извънклетъчният ↑[H+ ] влияе върху диференциацията на стволови подобни Т клетки, ние извършихме поточен цитометричен анализ на ключови стволови подобни фенотипове върху човешки Т клетки, култивирани в продължение на 12 дни в контролна среда, ↑[H+ ] среда, съдържаща 10 mM млечна киселина (имитираща концентрацията на лактат в патофизиологични ситуации 23, 35) или кисела среда (~pH 6,6, чрез солна киселина) (фиг. 1а). По-висок дял от стволови подобни CD8+ Т клетки, включително ранна памет (CD45RO− CD27+ ) и централна памет (CD45RO+ CD27+), се наблюдава в Т клетки, кондиционирани в ↑ [H+] спрямо контролна среда (разширени данни Фиг. 1а). Освен това открихме, че Т клетките, култивирани в среда ↑[H+], имат по-висок процент стволови клетки (CCR7+ CD62L+) (Фиг. 1b). Трябва да се отбележи, че забелязахме значително повишена експресия на TCF1, ключовият фактор, управляващ подобна на ствола и централна диференциация на паметта, на ниво протеин както в човешки, така и в миши CD8+ Т клетки, изложени на ↑[H+] (фиг. 1c и Разширени данни Фиг. 1b). В допълнение, имаше ефект, зависим от концентрацията на [H+], върху експресията на CCR7 и TCF1 (разширени данни Фиг. 1с). В съответствие със стволовия фенотип на ↑[H+]-кондиционирани Т клетки, производството на вътреклетъчен интерферон- (IFN-) и фактор на туморна некроза (TNF-) е значително намалено в тези клетки (фиг. 1d).

За да изследваме по-добре статуса на диференциация на Т клетките, извършихме анализ на секвениране на РНК (RNA-seq) и открихме, че дългосрочната експозиция in vitro ↑[H+] води до различен транскрипционен профил (Разширени данни Фиг. 1d). Излагането на ↑[H+] доведе до забележително намалена експресия на гени, кодиращи ефекторни молекули, като PRF1, GZMB и IFNG, и ко-инхибиторния рецептор BTLA (фиг. 1e, f и разширени данни, фиг. 1e). За разлика от това, ↑[H+]-култивираните Т клетки демонстрират по-висока експресия на BACH2, CCR7, LEF1 и TCF7, които корелират със стволовостта на Т клетките (фиг. 1e, f и разширени данни, фиг. 1e). Анализът на обогатяване на набор от гени (GSEA) показа, че транскрипционният модел, индуциран от експозицията на ↑[H+], е подобен на този на Т клетките на паметта (фиг. 1g и разширени данни, фиг. 1f). Освен това анализът на количествената полимеразна верижна реакция (qPCR) потвърди повишена експресия на mRNA на BACH2, KLF2, LEF1 и TCF7 след лечение с ↑[H+] (фиг. 1h). Взети заедно, тези наблюдения подкрепят факта, че лечението с ↑[H+] значително оформя транскрипционните профили на Т клетките, за да се установи стволовостта. Трябва да се отбележи, че ние открихме, че лечението с ↑[H+] инхибира Т клетъчната пролиферация и изкривява разпределението на клетъчния цикъл към G1 фазата и далеч от S фазата (допълнителна фигура 1a-c). След това изследвахме Т клетъчното активиране при лечение с ↑[H+] по време на TCR стимулация и установихме, че експозицията на ↑[H+] няма значителен ефект върху експресията на маркери за активиране на Т клетки или размера на клетката (допълнителна фигура 2a,b). Освен това, ние допълнително потвърдихме, че експозицията на ↑[H+] след активиране на Т клетки все още може да индуцира подобно на стволо състояние на Т клетките (допълнителна фигура 2c–f). Тези констатации изключват възможността Т-клетките, изложени на ↑[H+], да са просто рефрактерни на стимулация, за разлика от приемането на стволови състояние.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Предишни доклади показват, че киселинната среда рязко инхибира цитолитичната активност на Т клетките както in vitro, така и in vivo 23, 31. Ние също така открихме, че краткотрайната експозиция на ↑[H+] нарушава производството на цитокини, но има слабо въздействие върху стволовия фенотип в Т клетките (разширени данни Фиг. 1g–i и Допълнителна фигура 3a–c). Освен това, инхибиторните ефекти на производството на цитокини чрез експозиция на ↑[H+] са преходни и обратими, тъй като отстраняването на ↑[H+] бързо възстановява производството на цитокини от Т клетките (разширени данни Фиг. 1h). По този начин, инхибирането на ефекторната функция на Т клетките от киселинната среда е много бързо, докато препрограмирането на стволовостта на Т клетките изисква продължителна експозиция на ↑[H+]. Тъй като лактатът присъства в разтвора или в неговата недисоциирана форма (млечна киселина), или като йонна сол (натриев лактат), ние след това се опитахме да определим дали натриевият лактат показва подобни ефекти върху стволовостта на Т клетките и открихме, че натриевият лактат също насърчава сигнатури за стволовост, въпреки че неговата ефикасност е много по-ниска от тази на лечението с млечна киселина (10 mM) (разширени данни Фиг. 1j, k и Допълнителна фигура 4a-f). Тези констатации предполагат както значението на ↑[H+], така и разликата му от лечението с лактатни йони при индуцирането на стволовиден фенотип на CD8+ Т клетки.

Фиг. 1|↑[H+] експозицията улеснява диференциацията на стволови CD8+ Т клетки. Схема на активиране на човешки Т клетки при посочените условия: pH 7,4 (–↑[H+ ], контрола), pH 6,6 (+↑[H+ ], солна киселина) или 10 mM млечна киселина (+↑[H+ ]). PBMCs, мононуклеарни клетки на периферната кръв. b, Представителни профили на експресия на CCR7 и CD62L в човешки CD8+ Т клетки при различни условия на ден 12. n=3 независими проби. c, Представителни хистограми и количествено определяне на експресията на TCF1 в човешки CD8+ Т клетки при различни условия на ден 12. n=3 независими проби. MFI, среден интензитет на флуоресценция. d, човешки Т клетки се разширяват както в a за 12 дни и се стимулират с форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), съдържащ брефелдин А (BFA) за 4,5 часа. Профилът на вътреклетъчната експресия на IFN- и TNF- е изобразен за Т клетки в състояние на pH 7,4 (вляво), 10 mM млечна киселина (в средата) или pH 6,6 (вдясно). n=3 независими проби. e, f, RNA-seq анализ на човешки Т клетки, които са били размножени в контрола (рН 7,4) или млечна киселина (10 тМ). Топлинна карта на избрани гени (e) и вулканичен график на всички гени, в които гените, свързани с паметта, ефектора и изтощените Т клетки, са маркирани (f). В диаграмата на вулкана оста x представлява стойностите на log2-трансформирана промяна на гънките (FC) за клетки, третирани с млечна киселина спрямо контролите на ден 12, а оста y представлява коригираните P стойности. n=4 независими проби. g, графика на GSEA, сравняваща контрола с кондиционирани с млечна киселина Т клетки за ефектор спрямо обогатяване на паметта. NES, нормализиран резултат за обогатяване. h, Количествена mRNA експресия на транскрипционни фактори, свързани с стволови клетки на Т клетки (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) в Т клетки при посочените условия. n=3 независими проби. Данните са представени като средна стойност ± sem. Статистическите анализи са определени чрез несдвоен двустранен t-тест на Student (b–d,h). Номиналните P стойности и нивата на фалшиво откриване (FDR) бяха изчислени с метода по подразбиране на софтуера GSEA (g).

Повишеният [H+] задейства метаболитно препрограмиране

Отвъд отделните транскрипционни програми, стволовите Т-клетки също придобиват преференциално уникални метаболитни атрибути, включително повишен FAO и ограничен гликолитичен метаболизъм 17, 20, 37. За да проучим метаболитните характеристики на дългосрочно in vitro ↑[H+ ]-експонирани Т-клетки, извършихме обогатяващ анализ на генната онтология (GO) и открихме значителни разлики в експресията на гени, свързани с метаболитни пътища, като метаболизма на малки молекули и гликолиза (фиг. 2а). Наистина, дългосрочните ↑[H+]-кондиционирани Т клетки показват намалена гликолиза и метаболизъм на аминокиселини в контраст с повишения метаболизъм на дълговерижни мастни киселини (разширени данни Фиг. 2a, b). За разлика от дългосрочната експозиция на ↑[H+], краткосрочното лечение с ↑[H+] инхибира само гликолизата, но няма значителни ефекти върху FAO (допълнителна фигура 5а). Количественият PCR анализ допълнително потвърди, че гените за гликолиза SLC2A1, SLC2A3 и LDHA са значително намалени в ↑[H+]-експонирани Т клетки (разширени данни Фиг. 2c). Обратно, кондиционирането на ↑[H+] насърчава експресията на карнитин палмитоилтрансфераза 1 (кодирана от CPT1A), ограничаващ скоростта ензим, участващ във FAO (разширени данни Фиг. 2c). За по-нататъшно изясняване на метаболитните промени, предизвикани от ↑[H+], ние извършихме безпристрастен метаболомичен анализ и открихме 285 различни междинни продукти в Т клетки, култивирани с ↑[H+] спрямо контролите (разширени данни, фиг. 2d). По-специално, излагането на ↑[H+] значително намалява гликолитичните междинни продукти и някои незаменими аминокиселини, вместо да увеличава множество видове карнитин, активираната форма на мастни киселини, която се прехвърля в митохондриите за окисление (Разширени данни Фиг. 2e–g). Анализът на метаболитния поток с помощта на [13C6]глюкоза или [13C16]палмитат показа, че експозицията на ↑[H+] драстично възпрепятства включването на [13C6]глюкоза в междинни продукти на TCA и млечна киселина, като същевременно насърчава включването на [13C16]палмитат в ацетил-CoA и цитрат, подкрепяйки идеята че извънклетъчната ацидоза потиска гликолизата и повишава FAO в Т клетките (фиг. 2b-e). Тези ↑[H+]-кондиционирани Т клетки показват ограничения по отношение на усвояването на хранителни вещества, както се вижда от намалената консумация на [13C6]глюкоза и абсорбцията на липидни аналози (BODIPY FL C16), находка, която може да се дължи на повишен електрохимичен градиент (Разширени данни Фиг. 2h, i).

Ограниченото усвояване на хранителни вещества и превключването на клетъчния метаболизъм може да доведе до промени в сигналните мрежи в Т клетките. Анализът на обогатяване на GO на Т клетки, третирани с млечна киселина, разкри, че повечето от засегнатите гени са включени предимно в PI3K–AKT, mTOR и TCR сигнализиране (разширени данни Фиг. 3а). mTOR сигнализирането играе централна роля в интегрирането на имунни сигнали и метаболитни сигнали за правилното активиране на Т клетките, а инхибирането на mTOR сигнализирането изкривява клетките към образуване на CD8+ Т клетки на паметта вместо ефекторна диференциация38–40. Нашият GSEA анализ показа, че активността както на AKT-mTOR, така и на NF-кB сигнализирането в ↑[H+]-кондиционираните Т клетки е намалена в сравнение с тази в контролните Т клетки (Фиг. 2f и Разширени данни Фиг. 3b). Това беше допълнително потвърдено от намаленото фосфорилиране на S6 (при Ser235 и Ser236), 4EBP1 (при Thr37 и Thr46), AKT (при Ser473) и NF-кB (при Ser536) в ↑[H+]-кондиционирани Т клетки (фиг. 2g,h и разширени данни Фиг. 3c). Известно е, че mTOR е критичен регулатор на различни биологични процеси, включително размер на клетката, генериране на енергия и протеинов синтез41. Наистина, ние открихме, че размерът на клетката на ↑[H+]-кондиционираните Т клетки е намален в сравнение с този на контролните Т клетки (Разширени данни Фиг. 3d). След това оценихме зависимия от биоенергия протеинов синтез в ↑[H+]-кондиционирани Т клетки, използвайки SCENITH, новоразработен метод, който използва включването на пуромицин като отчитане на нивата на протеинов синтез42. Както се очакваше, експозицията на ↑[H+] потиска синтеза на енергийно интензивен протеин (фиг. 2i), което предполага, че енергийният метаболизъм в CD8+ Т клетките е променен. Тези резултати са в съответствие с предишни констатации, че инхибирането на активността на mTOR от рапамицин повишава експресията на транскрипционни фактори, свързани със стеблото (разширени данни, фиг. 3e, f). Вземайки нашите резултати заедно, ние заключаваме, че дългосрочната експозиция на ↑[H+] организира метаболитен превключвател и потиска активността на mTOR, като по този начин улеснява придобиването и поддържането на стволови Т клетки.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

↑[H+ ]-медиирано ограничение на метаболизма на метионин запазва епигенетичната стволовост

Натрупването на доказателства предполага, че едновъглеродният метаболизъм диктува решенията за съдбата на Т-клетките и оформя техните функционални състояния 43, 44. Нашият RNA-seq анализ показа слабо обогатяване за едновъглеродния метаболитен процес и сигнатурата на цикъла на метионин в Т клетките, изложени на дългосрочно, а не на краткосрочно лечение с ↑[H+] (Фиг. 3a, Разширени данни, Фиг. 4a, и допълнителна фигура 5b). Съответно, експозицията на ↑[H+] инхибира експресията на гени, кодиращи ензими, свързани с цикъла на метионин (MTR, AHCY и BHMT), както и метаболизма на фолат (SHMT1 и SHMT2) (Разширени данни Фиг. 4b). Допълнителен метаболомичен анализ разкрива, че Т клетките, култивирани в млечна киселина, показват значително намаляване на вътреклетъчните метаболити, участващи в метиониновия цикъл, включително метионин, S-аденозилметионин (SAM) и S-аденозилхомоцистеин (SAH), но повишени нива на серин и хомоцистеин (разширен Данни Фиг. 4c). Проследяването на [13C5]метионин допълнително потвърди, че усвояването и вътреклетъчното изобилие на метионин, 13C-белязан вътреклетъчен SAM (m+5), SAH (m+4) и 5'-метил-тиоаденозин (MTA, m +1) са значително намалени в ↑[H+]-експонирани Т клетки (Фиг. 3b–d и Разширени данни Фиг. 4d). Трябва да се отбележи, че добавянето на екзогенен метионин възстановява усвояването и вътреклетъчното изобилие на [13C5]метионин, както и съответните междинни продукти в ↑[H+]-експонирани Т клетки (фиг. 3c,d и разширени данни, фиг. 4d), което предполага, че екзогенният метионин добавката може да възстанови усвояването на метионин и метаболизма на ↑[H+]-експонираните Т клетки. След това проучихме дали ограничаването на метионин може да доведе до стволови Т клетки. Ние открихме, че лишаването от метионин наистина насърчава индукцията на TCF1+ CD8+ Т клетъчна популация, но няма ефект върху експресията на CD62L и CD44 (Разширени данни Фиг. 4e,f). За по-нататъшно изследване на ролята на метаболизма на метионин в ↑[H+]-индуцираната Т клетъчна стволовост, ние култивирахме Т клетки с ↑[H+] среда, допълнена с метионин, SAM или SAH. Фенотипът на Т клетъчната стволовост, индуциран от извънклетъчна ацидоза, наистина е частично забранен чрез добавяне на метионин или SAM, но не и SAH (Фиг. 3e и Разширени данни Фиг. 4g–i). Вътреклетъчният метионин се превръща в SAM, важен донор на метилова група за ДНК и реакции на метилиране на хистон (разширени данни Фиг. 5а). По този начин, ние характеризирахме моделите на метилиране на хистони и открихме, че повишеният [H+] значително намалява общите нива на H3K27me3 в Т клетките, но няма значителен ефект върху експресията на други маркери за метилиране на хистони (Фиг. 3f и Разширени данни Фиг. 5b). Както се очакваше, добавянето на метионин към Т клетки при ↑[H+] експозиция възстанови общото ниво на експресия на H3K27me3 (фиг. 3f). Специфичното намаляване на нивото на H3K27me3, наблюдавано в Т клетки, които са били подложени на дългосрочно лечение с ↑[H+], ни накара да предположим, че експозицията на ↑[H+] селективно регулира метилтрансферазата, специфична за отлагането на H3K27me3. Наистина, ние наблюдавахме значително намалена експресия на EZH2, ключова метилтрансфераза за H3K27me3, както на ниво иРНК, така и на протеин в ↑[H+]-експонирани Т клетки (Разширени данни Фиг. 5c, d). Освен това, инхибирането на активността на EZH2 от силно специфичен инхибитор, GSK126, повишава експресията на TCF1, както и процента на CCR7+ CD62L+ CD8+ Т клетки (Разширени данни Фиг. 5e,f) , което беше в съответствие с предишен доклад, че EZH2 може да регулира потенциала на Т клетките на паметта чрез селективни епигенетични модификации45. За да идентифицираме промени в целия геном в епигенетичните модели на ↑[H+ ]-индуцираната Т-клетъчна стволовост, ние проведохме CUT&Tag-seq анализ и открихме минимални промени в пропорционалността на отлагането на H3K4me3 и H3K27me3 сред различните третирани групи по промотора, генното тяло и междугенни региони (Разширени данни Фиг. 5g). По-конкретно, епигеномното профилиране разкри понижено ниво на репресивен хистонов маркер H3K27me3 в генни локуси, свързани с паметта (например TCF7, CCR7, ID3, LEF1 и KLF2) в дългосрочно ↑[H+]-третирани Т клетки (Фиг. 3g) . Важно е, че добавянето на метионин при експозиция на ↑[H+] възстановява частично нивото на H3K27me3 в горните локуси, както и тяхната генна експресия, което предполага важна роля на метионина в епигенетичната модулация на тези гени, свързани с паметта (фиг. 3g и Разширени данни Фиг. 5h). В съответствие с предишно проучване14, ефекторни гени като PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 и NR4A2 благоприятно придобиха активиращ модел на метилиране на хистони (H3K4me3hi и H3K27me3lo) (Фиг. 3g). Трябва да се отбележи, че заетостта на H3K4me3 в промоторните региони на тези ефекторни гени е била нарушена в Т клетки, култивирани при ↑[H+] експозиция и са възстановени чрез добавяне на метионин (Фиг. 3g). Като цяло, тези констатации показват, че ↑[H+]-медиирано разрушаване на цикъла на метионин насърчава епигенетичното запазване на Т клетъчната стволовост.

Няколко преносители на метионин (SLC), включително SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 и SLC43A2, могат да медиират транспортирането на метионин46. За да проучим как експозицията на ↑[H+ ] намалява усвояването и метаболизма на метионин в Т клетките, ние анализирахме моделите на експресия на различни SLCs и открихме, че ↑[H+ ] драстично намалява експресията на SLC7A5 и SLC38A2, но има малко влияние върху експресията на SLC38A1 (Разширено Данни Фиг. 6a,b). В допълнение, експозицията на ↑[H+] намалява експресията и активността на MYC (разширени данни Фиг. 6c,d), за които се съобщава, че регулират експресията на транспортери на метионин като SLC7A5 (реф. 47). Освен това демонстрирахме висока заетост на MYC на промотора SLC7A5 и в по-малка степен на промотора SLC38A2 (разширени данни, фиг. 6e). Важно е, че значително намалено свързване на MYC към тези локуси се наблюдава в дългосрочно ↑[H+]-третирани Т клетки (разширени данни Фиг. 6e). В съответствие с тези наблюдения, свръхекспресията на MYC забележително възстановява експресията на SLC7A5 и SLC38A2 в ↑[H+]-експонирани Т клетки (разширени данни Фиг. 6f). Тези резултати подкрепят важната роля на MYC в намалената експресия на транспортери на метионин при експозиция на ↑[H+]. Интересното е, че открихме, че добавянето на метионин може също така да възстанови експресията на MYC и SLC7A5 в ↑[H+]-експонирани Т клетки (разширени данни Фиг. 6g), което предполага, че добавянето на метионин може да възстанови способността за усвояване на метионин от Т клетките чрез регулиране на експресията на транспортера на метионин SLC7A5 по MYC-зависим начин. Предишно проучване показа, че SLC7A5 е най-изобилният транспортер на метионин в активирани Т клетки47. Това, заедно с нашите предишни открития, предполага, че SLC7A5 може да играе важна роля в ↑[H+]-индуцираното ограничение на метионин и поддържането на подобно на стъбло състояние. Наистина, ние открихме, че свръхекспресията на SLC7A5 частично уврежда ↑[H+ ]-индуцирания стволовиден фенотип (разширени данни Фиг. 6h, i), допълнително подкрепяйки участието на метиониновия транспортер SLC7A5 в ↑[H+ ]-индуцирана Т-клетъчна памет -подобен фенотип. Чрез анализиране на различни тумор-инфилтриращи CD8+ Т клетъчни субпопулации, открихме намалена експресия както на MYC, така и на SLC7A5 в подобни на паметта CD8+ TILs (Разширени данни Фиг. 7a,b), което е в съответствие с нашите in vitro открития. По този начин, тези констатации предполагат, че оста MYC-SLC7A5-метионин може потенциално да допринесе за запазване на подобно на паметта състояние на TIL.

Фиг. 2|↑[H+] експозицията задейства метаболитно препрограмиране и потиска mTOR сигнализирането. a, GO анализ, използващ RNA-seq данни, показващ представителни диференциално експресирани метаболитни гени в контролни и кондиционирани с млечна киселина човешки Т клетки (коригирана P стойност <4, 23 × 10–2). b, Схема на модели на маркиране на [13C6]глюкоза или [13C16]палмитат. c, Процент на посочения m+3 лактат от общия лактат или на m+3 пируват от общия пируват в Т клетките. n=3 независими проби. d, Процент на изотопомер за междинните продукти на TCA, като цитрат (m+2), малат (m+2) и сукцинат (m+2), получени от [13C6]глюкоза. n=3 независими проби. e, Процент на посочения m+2 ацетил-CoA от общия ацетил-CoA или на m+2 цитратния изотоп от общия цитрат в Т клетки от [13C16] палмитат. n=4 независими проби. f, GSEA със статистически анализ на генния набор, свързан с mTORC1 сигнализиране в контрола спрямо кондиционирани с млечна киселина (вляво) или pH 6.{33}}кондиционирани (вдясно) човешки Т клетки. g,h, Поточен цитометричен анализ и количествено определяне за S6, фосфорилиран при Ser235 и Ser236 (g) и 4EBP1, фосфорилиран при Thr37 и Thr46 (h) в човешки CD8+ Т клетки при посочените условия. n=3 независими проби. I, Поточен цитометричен анализ и количествено определяне на енергийно интензивен протеинов синтез в контроли или кондиционирани с млечна киселина или pH 6.6-човешки Т клетки. n=3 независими проби. Данните са представени като средно ± sem. Статистическите анализи са определени чрез едностранен точен тест на Fisher с тест за множество сравнения на Benjamini–Hochberg (a) или несдвоен двустранен t-тест на Student (c–e,g–i). Номиналните P стойности и FDR бяха изчислени с метода по подразбиране в софтуера GSEA (f).

Фиг. 3|Повишеният [H+] променя метаболизма на метионин в Т клетките, за да запази епигенетичната стволовост. графика на GSEA на набора от гени, свързан с едновъглероден метаболизъм и метаболизъм на цистеин и метионин в контрола спрямо кондиционирани с млечна киселина човешки Т клетки. b, Схема на моделите за маркиране на [13C5]метионин. c, Процент на вътреклетъчните SAM (m+5), SAH (m+4) и MTA (m+1), получени от [13C5]метионин, от съответните им общи групи, в Т клетки, култивирани в контролни условия или с 10 mM млечна киселина или 10 mM млечна киселина, допълнена с метионин (10 mM + Met). n=3 независими проби. d, Относително изобилие на [12C5] метионин и [13C5] метионин в Т клетки. e, Представителна хистограма и количествено определяне на TCF1 в човешки CD8+ Т клетки, култивирани при различни условия. n=3 независими проби. f, Ефекти от добавянето на метионин върху метилирането на хистони в човешки Т клетки. H3K4me3, хистон H3 триметилиран при K4; H3K79me2, H3 диметилиран при K79; H3K27me3, H3 триметилиран при K27; H3K9me2, H3 диметилиран при K9. n=3 независими проби. g, изглед на проследяване на генома на представителни генни локуси, показващи H3K27me3 (червено, над линията) или H3K4me3 (синьо, под линията) пикове. CUT&Tag-seq данните са от две независими проби. Данните са представени като средни ± sem номинални P стойности и FDR са изчислени с метода по подразбиране на софтуера GSEA (a). Статистическите анализи бяха извършени с помощта на двупосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с теста на Tukey за множество сравнения (c–f).

Излагането на ↑[H+] поддържа митохондриалната годност 

Като се има предвид намаленият енергоемък протеинов синтез в ↑[H+]-кондиционирани Т клетки, ние предположихме, че дългосрочното излагане на ↑[H+] може да доведе до значителни промени в клетъчния енергиен метаболизъм. Както контролните, така и ↑[H+]-кондиционираните Т клетки бяха анализирани с помощта на SCENITH42, за да се изчисли зависимостта от глюкозата, митохондриалната зависимост, гликолитичният капацитет и FAO и капацитетът за окисляване на аминокиселини (Фиг. 4а и Разширени данни Фиг. 8а). В съответствие с нашите резултати от метаболомията и изотопното проследяване, ние наблюдавахме повишен митохондриален метаболизъм в ↑[H+]-експонирани Т клетки, докато скоростите на гликолиза бяха намалени (Фиг. 4b,c и Разширени данни Фиг. 8b), което показва препрограмиране на вътреклетъчния енергиен метаболизъм в ↑[H+]-кондиционирани Т клетки. Анализът на Seahorse допълнително разкри, че ↑[H+ ]-кондиционираните Т клетки показват по-висока степен на потребление на кислород (OCR), както и SRC, основна характеристика на дългоживеещите памет CD8+ Т клетки22 и по-ниска степен на извънклетъчно подкисляване ( ECAR) (Фиг. 4d–h и Разширени данни Фиг. 8c–f). Тъй като повишената митохондриална маса/сливане и намаленият потенциал на митохондриалната мембрана (Δψm) са важни за поддържането на стволовостта на Т клетките48–50, ние допълнително изследвахме количеството и качеството на митохондриите на ↑[H+]-кондиционирани Т клетки и открихме, че ↑[H+ ] лечението повишава митохондриалната маса както в човешки, така и в миши Т клетки (Фиг. 4i,j и Разширени данни Фиг. 8g,h), които също поддържат по-нисък Δψm (Фиг. 4k и Разширени данни Фиг. 8i). Анализът на ултраструктурата чрез електронна микроскопия (ЕМ) разкрива, че изложените на ↑[H+] Т-клетки имат големи, плътно опаковани митохондрии, разпръснати в цитоплазмата и имат много стегнати, тесни кристи в сравнение с контролните Т-клетки, което е в съответствие с публикуваните резултати, свързани към морфологията на митохондриите в Т-клетките на паметта (фиг. 4l,m). В съответствие с това откритие, ние също наблюдавахме повишена генна експресия на няколко критични регулатора на митохондриално сливане в ↑[H+]-кондиционирани Т клетки (разширени данни Фиг. 8j), за които се предполага, че играят необходима роля за генериране на Т клетки на паметта50. Като цяло тези констатации показват, че експозицията на ↑[H+] подобрява митохондриалната маса/сливане и годността за насърчаване на образуването на подобни на стволови Т клетки.

растение цистанче, повишаващо имунната система

↑[H+ ] експозицията повишава CD8+ Т клетъчната антитуморна активност 

Подобните на стволови Т клетки благоприятстват присаждането, разширяването и антитуморната ефикасност при адоптивната имунотерапия51. За да се изследва дали дългосрочно in vitro ↑[H+ ]-поддържани CD8+ Т клетки проявяват повишена експанзия или персистиране при трансфер, CD45.1+ OT-I Т клетки, които са били размножени в контрола или ↑[ H+]-кондиционирана среда се прехвърля адаптивно в CD45.2+C57BL/6N мишки без имплантиран тумор (фиг. 5а). Въпреки че леко повишен брой апоптотични клетки бяха открити при ↑[H+ ] кондициониране (Разширени данни Фиг. 9а), имаше значително по-висок процент на Т клетки в периферната кръв на мишки, прехвърлени с Т клетки, експандирани в ↑[H+ ] състояние в сравнение с тези, експандирани в контролна среда (контролни Т клетки) (фиг. 5b). По подобен начин бяха открити значително по-високи честоти на Т клетки в далака и лимфните възли (LNs) (Разширени данни Фиг. 9b, c). В допълнение, ние открихме значително повишено натрупване на Т клетки в тумори, далак и дрениращи лимфни възли в B16-OVA мишки, носещи тумор, в които ↑[H+]-разширените клетки са адаптивно прехвърлени в сравнение с тези при мишки, които получени контролни клетки, което предполага, че CD8+ Т клетките, поддържани в ↑[H+], имат подобрена устойчивост (фиг. 5c–e и разширени данни, фиг. 9d). В съответствие с тези констатации, процентът на Т клетките на паметта е значително увеличен в далаците и LNs на мишки, които са получили ↑[H+]-кондиционирани Т клетки (Фиг. 5f и Разширени данни Фиг. 9e). По-специално, ↑[H+]-разширените OT-I Т клетки показват значително забавен туморен растеж в сравнение с контролните Т клетки (фиг. 5g). След това изследвахме терапевтичната ефикасност на ↑[H+ ]-разширени CD19 химерни-антиген-рецептор-модифицирани (CAR) Т клетки с in vivo туморен модел, в който CD19-K562 туморни клетки бяха инжектирани подкожно в хълбоците на NCG мишки (фиг. 5h). Установихме, че експозицията на ↑[H+ ] също насърчава стволовостта на CAR-T клетките, но няма ефект върху апоптозата (разширени данни Фиг. 9f), както се вижда от значително увеличените проценти на CCR7+ CD62L+ стволови подобни на CAR-T клетки, както и повишената експресия на TCF1 (разширени данни Фиг. 9g, h). В допълнение, има по-висок процент на натрупване на CAR-T клетки в туморни места и далаци на NCG мишки след инфузия с ↑[H+]-кондиционирани Т клетки (фиг. 5i). Както се очакваше, NCG мишки, които бяха адаптивно прехвърлени с CAR-T клетки, които бяха разширени в ↑[H+], показаха по-голям клирънс на имплантирания CD19+ тумор в сравнение с тези, които получиха CAR-T клетки, които бяха разширени в контролна среда (фиг. 5j). Взети заедно, тези данни показват, че лечението с ↑[H+] насърчава in vivo персистирането и антитуморната активност на Т клетките.

Излагането на ↑[H+] ограничава изчерпването на Т-клетките

За по-нататъшно изследване на ефектите от постоянната експозиция на ↑[H+ ] върху изчерпването на Т клетките in vitro, ние измерихме експресията на LAG-3 и TIM-3 в ↑[H+ ]-праймирани човешки Т клетки, които са претърпели множество кръгове от допълнително стимулиране с анти-CD3 антитела и бяха кондиционирани в контролна среда (Фиг. 6а). Установихме, че както LAG-3, така и TIM-3 експресията са намалени в ↑[H+ ]-експонирани Т клетки (фиг. 6b и разширени данни, фиг. 10a), което показва, че ↑[H+ ] лечението води до намалено Т-клетъчно изтощение. Освен това открихме, че висока концентрация на метионин води до повишаване на експресията на инхибиторни маркери, като PD-1, LAG-3 и TIM-3, докато лечението с ниска концентрацията на метионин леко намалява експресията на тези маркери (допълнителна фигура 6a-c). Трябва да се отбележи, че при дълготрайна in vitro експозиция на ↑[H+] честотата на TIM-3+ LAG-3+, инфилтриращи OT-I Т клетки и CD19-CAR Т клетки в туморите, е до голяма степен намален след приемен трансфер (фиг. 6c–e и разширени данни, фиг. 10b), което е в съответствие с тяхното по-ниско изтощение in vitro и подобрен капацитет за контрол на тумора in vivo. Освен това, ние демонстрирахме, че дългосрочните ↑[H+]-кондиционирани Т клетки показват значително намалена експресия на TOX както in vitro, така и in vivo (фиг. 6f, g и разширени данни, фиг. 10c, d). Както беше описано по-горе, изчерпаните Т клетки могат да бъдат разделени като цяло на подгрупа с изчерпани прогенитори или крайно изтощени, както е определено от експресията на TCF1 и TIM-352,53. Като такъв, ние измерихме модела на експресия на TCF1 и TIM-3 в CD45.1+ TILs и забелязахме, че честотата на TCF1− TIM-3+ крайно изтощени Т клетки е значително намалена, с a значително повишен процент на TCF1+ TIM-3– прогениторни Т клетки при ↑[H+] кондициониране (фиг. 6h). Освен това, ние демонстрирахме увеличена LY108+ TIM-3– прогениторна Т клетъчна популация (Разширени данни Фиг. 10e), както и повишена честота на IFN- + TNF- + T клетки (разширени данни Фиг. 10f), допълнително подкрепящи факта, че дългосрочните in vitro ↑[H+]-разширени адаптивно прехвърлени Т клетки ограничават изтощението и запазват стволовостта.

Дискусия

Тумор-специфичният ACT е обещаващ подход за лечение на индивиди с рефрактерни тумори, но терапевтичните ефекти са до голяма степен ограничени от Т клетъчна дисфункция в TME. Напоследък се отделя значително внимание на предварителното кондициониране на Т клетките с преходно гладуване на глюкоза, ограничение на глутамин или повишен извънклетъчен калий (↑[K+ ]) по време на in vitro култура, за да се запази стволовостта на Т клетките и да се подобрят терапевтичните резултати54–56. В това проучване ние демонстрирахме, че култивирането на CD8+ Т клетки при високи нива на [H+ ] по време на прайминг изненадващо насърчава придобиването на Т клетъчна стволовост и повишена резистентност към Т клетъчно изтощение, значително подобрявайки антитуморните ефекти на адаптивно прехвърлени Т клетки.

Прекомерното натрупване на млечна киселина в TME отдавна се счита за ключов фактор за имунното избягване на тумора. Например, доказано е, че млечната киселина и киселинният ТМЕ потискат CD{{0}} цитолитичната активност на Т клетките и производството на цитокини31–33,57. В съответствие с тези констатации, ние също открихме, че краткотрайното излагане на ↑[H+ ] in vitro е достатъчно, за да инхибира дълбоко производството на ефекторни цитокини, но няма ефект върху експресията на TCF1 или метаболитните характеристики, свързани със стеблото. И все пак дългосрочното лечение с ↑[H+] неочаквано стимулира експресията на TCF1 и поддържа фенотипа на стволови подобни Т клетки чрез метаболитно препрограмиране и епигенетично ремоделиране. Излагането на Т клетки на ↑[H+] след пълното им активиране може също да индуцира подобен на ствол фенотип, като по този начин се изключва възможността Т клетките, изложени на ниско рН, просто да са станали рефрактерни на стимулация, вместо да са възприели подобно на ствол състояние. Физиологичната концентрация на млечна киселина в кръвта на здрави индивиди е около 1,5–3,0 mM, но може да се повиши до 10 mM до 40 mM в TME35,58. Използвайки персистиращ анти-CD3/CD28 стимулационен модел, Feng et al. наскоро съобщиха, че висока концентрация на натриев лактат повишава нивата на H3K27ac в локуса на супер-енхансера TCF7 чрез инхибиране на активността на хистон деацетилаза, което води до повишена експресия на TCF1 и насърчаване на CD8+ Т стволови клетки59. За разлика от това, ние открихме, че дългосрочното излагане на относително ниска концентрация на млечна киселина (10 mM), но не и натриев лактат, може лесно да задейства стволови подобни на Т клетки чрез ограничаване на метаболизма на метионин и регулиране на H3K27me3 отлагане в генни локуси, свързани със стеблото, което ясно поддържа отчетлива епигенетична регулация от натриев лактат и млечна киселина. Въпреки това, лечението с ниска киселинност (рН 6,9) няма значително въздействие върху експресията на TCF1 при персистираща анти-CD3/CD28 стимулация, което предполага, че подобните на ствол сигнатури на CD8+ Т клетки, индуцирани от ↑[H+] експозицията може да бъде заменена от TCR стимулация. Активирането на TCR може да подобри усвояването на метионин и да препрограмира метаболизма на метионин, за да подпомогне активирането на Т клетките19,60. Спекулирахме, че TCR стимулацията може да засили усвояването на метионин в третирани с ↑[H+] Т-клетки, които имат ограничен метаболизъм на метионин, следователно нарушавайки ↑[H+]-индуцираната епигенетична стволовост. В допълнение, Т-клетките могат да използват лактатни йони като извънклетъчен източник на въглерод, за да улеснят придобиването на стволовост в присъствието или отсъствието на персистираща TCR стимулация. Метаболитната активност е тясно свързана с диференциацията на Т клетките и някои метаболитни интервенции могат значително да насърчат образуването на Т клетки с дълъг живот на паметта 21,37,61,62. Съответно, нашите метаболомични и изотопни анализи подкрепят идеята, че дългосрочната експозиция на ↑[H+] води до поразително метаболитно препрограмиране, като намалено усвояване на глюкоза и намалена гликолиза и метаболизъм на TCA цикъла. Няколко проучвания показват, че CD8+ Т клетките на паметта използват FAO, за да задоволят своите енергийни нужди, въпреки че това вероятно е адаптация за диференциация на линията на паметта, а свръхекспресията на Cpt1 насърчава дълголетието на Т клетките 21,22,63,64. Въпреки това, в техния модел на Т-клетъчно-специфична генетична делеция на Cpt1a, Raud et al. наскоро демонстрира, че LC-FAO е до голяма степен незаменим за активиране на Т клетки и образуване на CD8+ Т клетки на паметта65. Остава предизвикателство да се обясни подобно несъответствие. В контекста на нашето изследване, ние спекулираме, че препрограмирането на метаболизма на мастни киселини, задвижвано от извънклетъчна ацидоза, вероятно е свързано с генерирането на Т-клетки на паметта, въпреки че точният механизъм, който е в основата на тази хипотеза, изисква допълнително изследване. Освен това открихме, че експозицията на ↑[H+] инхибира активността на mTOR, която може да бъде индуцирана от гликолитично инхибиране. По-специално, потискането на mTOR сигнализирането може също да допринесе за метаболитното изместване от гликолиза към митохондриално дишане. Наистина, тези ↑[H+]-разширени Т клетки показват подобрена митохондриална годност, както се вижда от подчертано увеличен SRC и митохондриална маса и намален Δψm. Тези митохондриални подписи, които са обогатени със стволови подобни Т клетки и са свързани с дълголетието и превъзходната антитуморна активност in vivo, са тясно модулирани от митохондриалното сливане и динамиката на делене 22, 48, 50. Митохондриалният слят протеин на вътрешната мембрана OPA1 играе незаменима роля в генерирането на памет-Т клетки50. В съответствие, ние открихме, че извънклетъчната ацидоза също насърчава експресията на OPA1 в Т клетки, което в крайна сметка води до морфологично равновесие към сливане в Т клетки. Доказано е, че много клетъчни метаболити директно допринасят за епигенетичните модификации. Например, метаболизмът с един въглерод може да генерира универсален метил донор SAM за метилиране на хистони66.

Фиг. 4|Митохондриалната годност се поддържа в Т клетки, изложени на ↑[H+]. SCENITH анализ на човешки Т клетки в контролни или кондиционирани с млечна киселина Т клетки. Показано е представително ниво на превод (анти-Puro) (n=3 независими проби). Прекъснатата линия представлява фоновото ниво, получено след лечение с 2-дезокси-d-глюкоза + олигомицин (2-DG+O). b,c, Количествен анализ на гликолитичен капацитет (b) и митохондриална зависимост (c) в рамките на a. n=3 независими проби. d – f, OCR (d) на контролни и кондиционирани с млечна киселина Т клетки се измерва в реално време при базални условия в отговор на посочените инхибитори. FCCP, карбонил цианид-р-трифлуорометокси фенилхидразон; ROT/AA, ротенон и антимицин А. Представителен статистически анализ на базален OCR (e), максимално дишане (e) и SRC (f). n=9 тестове; Бяха анализирани 3 независими проби и всяка проба беше измерена 3 пъти. g,h, ECAR (g) на контролни или кондиционирани с млечна киселина Т клетки, измерени в отговор на посочените инхибитори. Представителен статистически анализ на базалния ECAR и стресирания ECAR (h). n=9 тестове; Открити са 3 независими проби и всяка проба е измерена 3 пъти. i, Имуноблот анализ на COXIV и TIM23 в човешки Т клетки при посочените условия. Актинът се използва като контрола на натоварването. j,k, представителни хистограми или контурни диаграми и статистически анализ на митохондриалната маса (MTG) (j) и потенциала на митохондриалната мембрана (TMRM) (k), съответно, в контролата или млечна киселина- или pH 6.{{30} }кондиционирани човешки Т клетки. n=3 независими проби. l, m, представителна митохондриална морфология на Т клетки, култивирани в контролно състояние, млечна киселина или състояние на рН 6,6 за 12 дни, анализирани чрез EM (мащабна лента, 1 μM) (l). Площта на отделните митохондрии в Т-клетките (m), n=45 клетки. Данните са представени като средно ± sem. Статистическите анализи са извършени с помощта на несдвоен двустранен t-тест на Student.

Фиг. 5|↑ [H+ ]-разширените Т клетки показват повишена антитуморна активност. a, b, Контролни или разширени с млечна киселина CD8+ Т клетки бяха анализирани за персистиране след приемен трансфер (n=6 мишки). Прясно изолирани миши CD45.1+ OT-I Т клетки се активират с миши IL-2 и свързани с плака анти-миши CD3 и анти-миши CD28 антитела в продължение на 2 дни и след това се поддържат в културална среда с мишка IL-2 до осиновяващ трансфер (CD3&CD28+IL-2). Схема на експеримента с животни (a), както и представителни графики на FACS и статистически анализ на CD45.1+ и CD45.2+ Т клетки в кръвта са показани в (b). c–g, CD45.1+ OT-I Т клетки се размножават в контролна среда или среда с млечна киселина в продължение на 7 дни и се прехвърлят в мишки, носещи B16-OVA-тумор, и се оценява съотношението на инфилтрация (n=5 мишки). Схема на експеримента с животни, използващ B16-OVA мишки, носещи тумор (c), както и представителни FACS диаграми (вляво) и статистика за броя (вдясно) на прехвърления CD45.1+ OT- I Т клетки в тумора (d). sc, подкожна инжекция. Статистика за процента на CD45.1+ Т клетки (e) и представителни данни (вляво) и статистика за процента (вдясно) на CD62L+ CD44+ CD45.1+ Т клетки (f ) в далака са показани. Крива на туморен растеж (g) (n=5 мишки, ден 14). h–j, CD19-CAR Т клетки се размножават в контролна среда или среда с млечна киселина в продължение на 12 дни и се прехвърлят в CD19-свръхекспресиращи K562 тумор-носещи NCG мишки и съотношението на инфилтрация в тумор и далак е оценени (n=6 мишки). Показани са схема на експеримента с животни (h), представителен процент на прехвърлените Т клетки в тумора и далака (i) и кривите на туморен растеж (j) (n=6 мишки, ден 10). Данните са представени като средно ± sem. Статистическите анализи са извършени с помощта на несдвоен двустранен t-тест на Student.

Фиг. 6|↑[H+ ] експозицията ограничава изчерпването на Т клетките. Схема на хронично стимулиране на човешки Т клетки in vitro. b, Представителни графики на FACS за LAG-3 и TIM-3 в хронично стимулирани човешки Т клетки, култивирани в контролни условия или условия на млечна киселина. n=3 независими проби. c, Експресията на LAG-3 и TIM-3 в CD45.1+ TILs от B16-OVA тумор-носещи C57BL/6N мишки (n=5 мишки ). d, Количествено определяне на експресията на LAG-3, TIM-3 и PD-1 в CD45.1+ TILs от B16-OVA-тумор-носещ C57BL/ 6N мишки (n=5 мишки). e, Експресията на LAG-3 и TIM-3 в тумор-инфилтриращи CD19-CAR Т клетки от CD19-K562 носещи тумор NCG мишки, както е определено чрез поточна цитометрия (n=6 мишки). f, Експресията на TOX в CD45.1+ TIL от B16-OVA мишки C57BL/6N, носещи тумор (n=5 мишки). g, Хистограми и статистически анализ на TOX в тумор-инфилтриращи CD19-CAR Т клетки от CD19-K562 носещи тумор NCG мишки (n=6 мишки). h, вляво, представителни диаграми на поточна цитометрия за TIM-3 и TCF1 в CD45.1+ TILs от B16-OVA тумор-носещи C57BL/6N мишки (n=5 мишки) . Точно така, процентът на TCF1+ TIM-3– или TCF1– TIM-3+ популации. Данните са представени като средно ± sem. Статистическите анализи са извършени с помощта на несдвоен двустранен t-тест на Student.

Съобщава се, че метаболити, като S-2-хидроксиглутарат и -хидроксибутират, функционират като епигенетични регулатори на диференциацията на паметта-Т клетки67,68. Нашите резултати показват, че постоянното лечение с ↑[H+] ограничава усвояването на метионин и метаболизма на метионин с намален вътреклетъчен метионин, SAM и SAH чрез инхибиране на експресията на транспортери на метионин. Тези резултати могат частично да обяснят защо Т клетките не са способни да изпреварват туморните клетки за усвояване на метионин в TME69. Механично, ние демонстрирахме, че експозицията на ↑[H+] драстично намалява експресията на MYC и нейното свързване към промотора SLC7A5, което впоследствие води до намалена експресия на SLC7A5 и нарушен метаболизъм на метионин в Т клетките. Интересно е, че добавянето на метионин може да възстанови експресията на MYC и SLC7A5, както и потока на метиониновия цикъл в ↑[H+]-експонирани Т клетки, което предполага, че възстановяването на способността за усвояване на метионин вероятно се дължи на регулиране на метиониновия транспортер SLC7A5 по зависим от MYC начин. Съобщава се, че активността на mTOR регулира превода на MYC70. Съответно, ние спекулирахме, че ↑[H+]-индуцираното понижено регулиране на MYC вероятно се дължи на транслационна репресия чрез прогресивното инхибиране на mTOR и нарушеното усвояване на метионин. Такава репресия може да бъде обърната чрез екзогенна добавка на метионин, въпреки че точният механизъм се нуждае от допълнително проучване. Смята се, че SAM, получен от цикъла на метионин, медиира метилирането на хистони и епигенетичното ремоделиране по време на диференциация на ефектор-Т клетки 8,71. В съответствие с намаляването на вътреклетъчния SAM в ↑[H+]-разширените Т клетки, ние открихме, че общото изобилие на H3K27me3 и неговата заетост в промотора на локусите на стволови Т клетки са силно намалени. H3K27me3 и H3K4me3 са селективно модифицирани по начин, който корелира с експресията на гени, централни за ефекторната или стволовата програма на Т клетките14. Наистина, има по-ниско обогатяване на H3K4me3 в промоторите на ефекторния ген в ↑[H+]-разширените Т клетки. По този начин, намалените нива на SAM на метил-донор в резултат на нарушено усвояване и метаболизъм на метионин при условие ↑[H+] водят до епигенетични промени, които в крайна сметка благоприятстват диференциацията на Т клетките в състоянието на паметта. Интересното е, че добавянето на метионин при експозиция на ↑[H+] не само спасява експресията на MYC и SLC7A5 в изложени на ↑[H+] Т клетки, но също така възстановява общото ниво на експресия на H3K27me3, поддържайки важна роля за MYC–SLC7A5 –ос на метаболизма на метионин при регулиране на ↑[H+]-индуцирана епигенетична стволовост. Наистина, ние открихме, че свръхекспресията на SLC7A5 частично уврежда ↑[H+ ]-индуцирания фенотип, подобен на стволови, като допълнително подкрепя критичната роля на транспортера на метионин SLC7A5 в придобиването на фенотип, подобен на Т-клетъчната памет, при експозиция на ↑[H+ ].

Исторически се е смятало, че повечето TIL са изчерпани поради непрекъснатото излагане на TCR в туморите, но парадоксално малка подгрупа от Т клетъчни клонотипове в TIL, експресиращи транскрипционния фактор TCF1, запазват свойства, подобни на стволови клетки. Нашите открития разкриха, че експозицията на ↑[H+] компенсира ефекторната функция на Т клетките и запазва стволовостта на Т клетките чрез оста на метаболизма MYC–SLC7A5–метионин, което дава възможно обяснение за настоящия парадокс защо малка част от TIL все още съдържат стволови като памет или свойства на прекурсора. Всъщност са докладвани подобни констатации, при които калиевите йони в ТМЕ играят двойна роля, влияейки както върху ефекторната функция на Т клетките, така и върху стволовостта56,72, допълнително подкрепяйки комплексните ефекти на имуносупресивните фактори на ТМЕ (например хронична TCR стимулация, хипоксия и ниска глюкоза) върху функцията и диференциацията на Т клетките. В допълнение, киселинните региони в туморите са силно динамични и както пространствено, така и времево регулирани, и годността на Т клетките, адаптирани към извънклетъчната ацидоза, вероятно е засенчена, когато се сблъскат с други сурови ТМЕ фактори, които могат да повлияят на интратуморната Т клетъчна ефекторна функция и диференциация. В допълнение, ние наблюдавахме по-висока експресия на MYC в терминално изтощени Т клетки (LY108− TIM-3+), отколкото в прогениторно изтощени Т клетки (LY108+ TIM-3–), което е в съответствие с предишни доклади, че MYClo Т клетките предпочитано придобиват съдбата на паметта73. В съответствие с намалената експресия на SLC7A5 и поглъщането на метионин в ↑[H+ ]-експонирани Т клетки, експресията на SLC7A5 също беше значително намалена в LY108+ TIM-3–изтощена от прогенитор Т-клетъчна популация в рамките на тумори, което предполага, че регулаторната ос MYC–SLC7A5–метионин може също да работи in vivo. Сега е очевидно, че по-малко диференцираните стволови подобни Т-клетки на паметта имат превъзходни антитуморни терапевтични ефекти поради тяхната дългосрочна устойчивост и устойчивост към развитието на дисфункция 51, 74. Тук сме предоставили убедителни доказателства, че дълготрайните ↑[H+ ]-кондиционирани CD8+ Т клетки показват повишена устойчивост и превъзходна антитуморна способност in vivo, с намалена терминално изтощена Т клетъчна популация (TCF1− TIM{ {39}} ) и увеличена подгрупа на стволови подобни прогенитори (TCF1+ TIM-3– ) в рамките на тумори. В заключение, настоящото ни проучване дава представа за многоизмерните ефекти на експозицията на ↑[H+] върху потискането на ефекторната функция на Т клетките и нейното съвпадащо влияние върху стволовостта на Т клетките.

Методи

Мишки и клетъчни линии

Всички експерименти с животни бяха извършени с одобрението на Комитета за институционална грижа и използване на животните (IACUC) на Института по системна медицина в Суджоу (ISM-IACUC-0151-R) и животните бяха настанени в специфични помещения за мишки без патогени. Мишките бяха настанени при стандартни условия, с 12-h/12-h цикли светлина/тъмнина и контролирана температура от 22–24 градуса и влажност от 60%, с неограничена храна и вода наличност и се преглеждаха ежедневно. Всички туморни тежести не надвишават разрешението, одобрено от Комитета за институционална грижа и използване на животните на Института по системна медицина в Суджоу. CD45.1+ женски OT-I TCR трансгенни мишки на C57BL/6N фон бяха настанени заедно. CD45.2+ женски мишки C57BL/6N на възраст 6–8 седмици бяха закупени от Vital River като реципиенти. Женски NCG (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) мишки на възраст 6–8 седмици бяха закупени от GemPharmatech. За един независим експеримент in vivo мишките CD45.1+ и CD45.2+ (6–12 седмици) бяха съпоставени по пол. HEK-293T клетки от American Type Culture Collection (ATCC) се поддържат в среда DMEM, допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS) и 1% пеницилин-стрептомицин. Мишата меланомна клетъчна линия B16 от ATCC се трансдуцира, за да експресира OVA и се поддържа в DMEM среда, допълнена с 10% FBS и 1% пеницилин-стрептомицин. K562 клетки от ATCC бяха трансдуцирани, за да експресират човешки CD19 и култивирани в среда RPMI 1640, допълнена с 10% FBS, 1% пеницилин-стрептомицин, 1% GlutaMAX, 0,1 М HEPES, 1% неесенциални аминокиселини, 1 mM натриев пируват и 50 μM -меркаптоетанол. Всички горепосочени реагенти са закупени от Gibco.

Първично Т-клетъчно изолиране, активиране и ретровирусна трансдукция

Миши CD{{0}} Т-лимфоцити бяха изолирани от далака на 6-12 седмични мъжки или женски OT-I мишки чрез използване на комплект за изолиране на CD8 наивни Т клетки (BioLegend) и култивирани в RPMI{{5} } среда, допълнена с 10% FBS, 1% пеницилин–стрептомицин, 1% неесенциални аминокиселини, 1% GlutaMAX, 1 mM натриев пируват, 0,1 M HEPES и 50 μM -меркаптоетанол в присъствието на миши IL -2 (20U/ml, Peprotech). За един независим експеримент in vitro използваните мъжки и женски мишки (6–12 седмици) са съвпадащи по пол. Пречистените клетки се активират от анти-миши CD3 (2 ug/ml, BioLegend) и анти-миши CD28 (1 ug/ml, BioLegend) антитела за 48 часа. Човешки периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMC) от здрави донори бяха закупени от Sailybio и култивирани в RMPI-1640 среда, допълнена с 5% човешки серум AB (Gemini), 1% пеницилин-стрептомицин, 1% неесенциални аминокиселини, 1% GlutaMAX, 1 mM натриев пируват, 0,1 M HEPES и 50 μM -меркаптоетанол в присъствието на човешки IL-2 (100 U/ml, Peprotech). Анти-човешки CD3 (1 ug/ml, BioLegend) и анти-човешки CD28 (1 ug/ml, BioLegend) моноклонални антитела бяха използвани за активиране на РВМС в продължение на 3 дни. Пречистени миши и човешки Т клетки се активират и разширяват в посочените условия на култура: рН 7.4, рН 6.6, млечна киселина (Sangon) или натриев лактат (Sangon). Следните метаболити бяха използвани за допълване на pH 6,6 или млечна киселина (10 mM) среда: метионин 800 μM (MCE), SAM 100 μM (MCE) или SAH 100 μM (Sigma). За вирусна трансдукция, 1 × 106 PBMCs бяха активирани на ямка в 24-плаки с ямки. След 48 часа активиране, по-голямата част от средата беше заменена с неконцентриран ретровирусен супернатант с 10 ug/ml полибрен (Santa Cruz). След центрофугиране при 600 g за 90 минути при 30 градуса, клетките се култивират в инкубатора за 24 часа със свежа среда. Трансдукцията се повтаря 24 часа по-късно и след това се връща в свежа среда за култура. Рецепторът на нервния растежен фактор с нисък афинитет (LNGFR) се използва за количествено определяне на ефективността на инфекцията.

Поточна цитометрия

Клетките се оцветяват с флуоресцентни антитела и след това се анализират чрез поточна цитометрия. За повърхностно маркерно оцветяване клетките се оцветяват с флуоресцентно конюгирани антитела и комплект за оцветяване на живи/мъртви мъртви клетки (Invitrogen) в буфер FACS (буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) с 2% FBS), след което се фиксират с 2% параформалдехид (Casmart) за 20 минути при стайна температура. За вътреклетъчно оцветяване на фосфо-протеини, предварително оцветените клетки се фиксират с фиксиращ буфер (BioLegend) и след това се оцветяват с фосфо-специфични антитела в пермеабилизиращ буфер (Invitrogen). За откриване на вътреклетъчни цитокини, клетките се стимулират с форбол миристат ацетат (PMA) в присъствието на Brefeldin A (BFA) (BioLegend) в продължение на 4, 5 часа. След това предварително оцветените клетки се фиксират и оцветяват с цитокинови антитела в пермеабилизиращ буфер. За оцветяване с вътреклетъчен транскрипционен фактор, клетките бяха предварително оцветени с Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit и флуоресцентно конюгирани антитела в FACS буфер за откриване на повърхностни маркери. След това клетките се фиксират за 30 минути върху лед, като се използва FOXP3/буфер за фиксиране на транскрипционен фактор (Invitrogen) и се оцветяват с антитела на транскрипционен фактор в пермеабилизиращ буфер. След оцветяване клетките се ресуспендират в FACS буфер за поточна цитометрия. Данните от поточната цитометрия бяха събрани от BD LSR Fortessa и BD FACSDiva (v8.0.2) и анализирани със софтуер FlowJo (v10.4). Представителни стратегии за стробиране са дадени в Разширени данни Фигура 10b.

Секвениране на РНК

Анализът на RNA-seq беше извършен с помощта на 12-разширени през деня Т клетки, култивирани в посочените условия, както е показано на Фиг. 1а. Накратко, 12 дни след експанзия на Т клетки, общата РНК се екстрахира чрез хомогенизиране в TRIzol (Takara) и замразяване в епруветки без РНКаза с течен азот. Целостта на РНК беше оценена с помощта на биоанализатор Agilent 2100 (Agilent). Библиотеките бяха конструирани с помощта на комплекта за подготовка на проби TruSeq RNA (FC-122-1001, Illumina). След това библиотеките бяха секвенирани с помощта на платформа Illumina NovaSeq 6000 (PE150) и бяха генерирани приблизително 40 милиона четения в сдвоен край (Novogene). Необработеният брой четения беше извлечен и след това нормализиран от техните фактори за размер на библиотеката, използвайки DESeq2 (v1.28.1). Трансформацията на регуляризирания логаритъм (r-log) беше използвана за стабилизиране на дисперсията в пробите. Анализът на обогатяване на пътя на GO и KEGG на диференциално експресирани гени беше извършен с клъстерен профил (v3.16.0). Топлинните карти на експресията бяха генерирани с R пакета „pheatmap“ (v1.0.12). GSEA v.4.0 беше използван за GSEA анализ.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq се извършва, както е описано по-горе75, като се използва хиперактивен универсален комплект за анализ на CUT&Tag за Illumina (TD903, Vazyme). Накратко, човешки Т клетки се разширяват в продължение на 12 дни при контролни условия, млечна киселина или млечна киселина с 800 μM метионин. След това 1 × 105 Т клетки се лизират за екстракция на нуклеинови материали и се инкубират с ConA зърна при стайна температура в продължение на 10 минути. Клетките се ресуспендират в 50 µL буфер за антитяло, предварително смесен с първично антитяло (анти-H3K27me3 или анти-H3K4me3) и се инкубират една нощ при 4 градуса. Пробите се инкубират с вторичното антитяло при стайна температура в продължение на 30 минути и след това се инкубират съвместно с протеин A/G-Tn5 транспозаза при стайна температура в продължение на 1 час, за да се наруши фрагментацията на ДНК. Пречистена ДНК беше използвана за подготовка на библиотека и секвенирана с помощта на PE150 от Illumina Nova6000 секвенсер.

CUT&Tag-seq анализ

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) беше използван за проверка на качеството на четене на последователността. Качеството на показанията беше намалено до минимален резултат на Phred от 20 с помощта на trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . Всички показания, произведени от CUT&Tag-seq на H3K27me3 и H3K4me3, бяха подравнени към човешкия геном hg38 с помощта на Bowtie2 (v2.2.8) (https:// bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) с опции: –local– very-sensitive-local–no-unal–no-mixed–no-discordant–phred33 -I 10 -X 700. Пробите без добавена ДНК бяха нормализирани с помощта на метода ChIPseqSpikeInFree, който е нов метод за нормализиране за ефективно определяне на коефициенти на мащабиране за проби при различни състояния и лечения76. За H3K27me3 пиковете бяха извикани с помощта на MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ peak_calling_macs .html) с опции '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. За H3K4me3 пиковото извикване използва MACS2 с параметри '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. Пиковете бяха анотирани с ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/), а визуализациите бяха създадени с помощта на deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) и pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT–PCR

Общата РНК се изолира с TRIzol (Takara) и се транскрибира обратно в cDNA с HiScript обратна транскриптаза (Vazyme), съгласно инструкциите на производителя. За количествена PCR в реално време бяха използвани ABI prizma 7500 PCR система в реално време (Thermo Fisher) и 2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) съгласно инструкциите на производителя. ACTB беше използван като вътрешен стандарт. Относителната експресия на тРНК се изчислява с помощта на метода 2−ΔΔCT. Праймерните последователности, използвани за qPCR, могат да бъдат намерени в допълнителна таблица 1.

Западно попиване

За анализ на протеиновата експресия, клетките бяха събрани и промити със студен PBS и общият протеин беше екстрахиран чрез използване на 1% SDS (Sangon) върху лед. Концентрацията на протеин се измерва с комплект за анализ на протеин BCA (Merck). Протеиновите проби се разделят чрез SDS-PAGE гелове и след това се прехвърлят в PVDF мембрани (Millipore). Мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено мляко в PBS, съдържащ Tween20. След блокиране, мембраните се инкубират с първични антитела за една нощ при 4 градуса и HRP-свързани вторични антитела за 2 часа при стайна температура. HRP сигналът е разработен чрез електрохемилуминесценция (ChemeMINI610) и събран от Sage Capture (v2.19.12). Анализът на данните беше извършен с помощта на софтуер ImageJ (v1.8.0).

Митохондриален морфологичен анализ

Във всяка ямка на {{0}}плаки с ямки PBMCs се активират от човешки анти-CD3 и анти-CD28 антитела в продължение на 3 дни и се култивират в среда RPMI-1640 при различни условия в продължение на 12 дни. След това, 1 × 106 PBMCs бяха събрани и фиксирани в предварително охладен буфер за фиксиране (2.5% глутаралдехид, 0.1 М фосфатен буфер (PB), рН 7.4) за една нощ при 4 градуса. След промиване с PBS три пъти, клетките се фиксират след това в 1% осмиев тетроксид в PBS за 2 часа, дехидратират се и се вграждат в смолата на Spurr, съгласно стандартната процедура. Ултратънките срезове бяха оцветени с уранил ацетат и оловен цитрат. Митохондриалната морфология беше изобразена с помощта на Hitachi HT-7800 трансмисионна електронна микроскопия (TEM) (v01.20) и камера AMT-XR81DIR.

Антитела и реагенти

Антителата, използвани за поточен цитометричен анализ, са както следва. APC античовешки NGFR (кат. № 345108, 1:1, 000 за FACS), FITC античовешки CD4 (кат. № 357406, 1:200 за FACS), Тихоокеанско синьо античовешки CD8 (кат. № 300928, 1:200 за FACS), APC-Cy7 античовешки/миши CD44 (кат. № 103028, 1:200 за FACS), PE античовешки CCR7 (кат. № 353204, 1 :200 за FACS), PE античовешки TNF- (кат. № 502909, 1:200 за FACS), PE-Cy7 античовешки CD45RO (кат. № 304230, 1:200 за FACS), APC анти- човешки IFN- (кат. № 502512, 1:200 за FACS), PE-Cy7 античовешки LAG-3 (кат. № 369310, 1:200 за FACS), PE античовешки TIM{{ 52}} (кат. № 345006, 1:200 за FACS), BV711 античовешки PD-1 (кат. № 329928, 1:200 за FACS), Percp-Cy5.5 античовешки CD62L (кат. № 304824, 1:200 за FACS), APC анти-човешки CD27 (кат. № 302810, 1:200 за FACS), BV711 анти-миши CD8 (кат. № 100748, 1:200 за FACS ), PE-Cy7 анти-миши CD62L (кат. № 104418, 1:200 за FACS), APC-Cy7 анти-миши CD45.2 (кат. № 830789, 1:200 за FACS), Pacific Blue анти- мишка CD45.1 (кат. № 110722, 1:200 за FACS), APC анти-мишка Ly108 (кат. не. 134610, 1:200 за FACS), PE анти-миши LAG-3 (кат. № 125207, 1:200 за FACS), Alexa Fluor 488 анти-c-MYC антитяло (кат. № 626811, 1 :200 за FACS), PE анти-миши TNF- (кат. № 506306, 1:200 за FACS) и APC анти-миши IFN- (кат. № 505810, 1:200 за FACS) са закупени от BioLegend . Комплект за оцветяване на живи/мъртви мъртви клетки, PerCP-eFluor710 анти-миши PD-1 (кат. № 46-9981-82, 1:200 за FACS), PE фосфор-S6 (Ser235/236) (кат. . № 12-9007-42, 1:200 за FACS), PE анти-човешки/миши TOX (кат. № 12-6502-82, 1:200 за FACS) и PE-Cy7 анти-миши TIM{ {149}} (кат. № 25-5870-82, 1:200 за FACS) са закупени от Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (кат. № 6709, 1:200 за FACS) и фосфор-4E-BP1 (Thr37/46) (кат. № 2846, 1:200 за FACS) са закупени от Технология за клетъчно сигнализиране. Alexa Fluor 647 анти-пуромицин (кат. № MABE343-AF647, 1:800 за FACS) е закупен от Merck. Антителата, използвани за Western blots, са както следва. Заешки анти-фосфо-Akt (Ser473) (кат. № 4060, 1:1, 000 за IB), анти-фосфо-NF-κB p65 (Ser536) (кат. № 3033, 1:1 ,000 за IB), анти-c-MYC (кат. № 18583, 1:1,000 за IB), анти-EZH2 (кат. № 5246, 1:1,{ {200}} за IB), анти-три-метил-хистон H3 (Lys27) (кат. № 9733, 1:1,000 за IB), анти-три-метил-хистон H3 (Lys4) (кат. № 9751, 1:1, 000 за IB), анти-ди-метил-хистон H3 (Lys9) (кат. № 4658, 1:1, 000 за IB) , анти-ди-метил-хистон H3 (Lys79) (кат. № 5427, 1:1, 000 за IB), анти-хистон Н3 (кат. № 9715, 1:1, {{242 }} за IB), анти-COXIV (кат. № 850, 1:1,000 за IB), анти-заешки IgG (HRP-свързан) (кат. № 7074, 1:2,{ {253}} за IB) и анти-миши IgG (HRP-свързан) (кат. № 7076, 1:2, 000 за IB) са закупени от Cell Signaling Technology. Миши анти-Tim23 (кат. № 611223, 1:1, 000 за IB) е от BD Biosciences. Миши анти{266}}актин (кат. № 66009-1-Ig, 1:5,000 за IB), анти-SLC7A5 (кат. № 67951-1-Ig, 1: 1,000 за IB), и заешки анти-SLC38A1 (кат. № 12039-1-AP, 1:1,000 за IB) са от Proteintech. Заешки анти-SLC38A2 (кат. № BMP081, 1:1, 000 за IB) е закупен от Medical & Biological Laboratories.

Т-клетъчен метаболитен анализ

За да се провери поглъщането на BODIPY FL C16 в контролни или третирани с ↑[H+] Т клетки, Т клетките се култивират с прясно разтворен 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen) в продължение на 1 час, след което се промиват два пъти с PBS преди повърхностното оцветяване. За по-нататъшно изследване на метаболитната зависимост в различни групи на лечение бяха проведени експерименти с помощта на метода SCENITH (енергиен метаболизъм на една клетка чрез профилиране на инхибиране на транслацията)42. Накратко, Т клетките се посяват в 96-плаки с ямки при 1 × 106 клетки/ml. След това клетките бяха третирани с контрола (Ctrl), 2-дезокси-d-глюкоза (крайна концентрация 100 mM), олигомицин (крайна концентрация 5 μM) или смес от инхибиторите при крайните концентрации в продължение на 40 минути при 37 степен . През последните 30 минути се добавя пуромицин (крайна концентрация 10 ug/ml). След третиране с пуромицин, клетките бяха промити със студен PBS и предварително оцветени с Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit и антитела срещу повърхностни маркери. Оцветяването на вътреклетъчния пуромицин беше последвано от процеса на оцветяване за вътреклетъчни транскрипционни фактори.

Метаболомен анализ с LC-MS/MS

Метаболомният анализ и събирането на проби бяха извършени както в предишни доклади77. Накратко, РВМС се активират поотделно в 24-плаки с ямки от човешки анти-CD3/CD28 в продължение на 3 дни и се култивират в среда RPMI 1640 с контрола или млечна киселина до ден 12. След това, 8 × 106 клетки на проба (n=4 независими проби на група) бяха събрани и прехвърлени в епруветка от 1.5-ml за центрофугиране при 300 g за 5 минути при 4 градуса и след това промити със студен PBS. След отново центрофугиране при 300 g за 5 минути се добавя 80% студен метанол и се разбърква енергично, за да се разруши напълно клетъчната пелета, и след това клетките се прехвърлят във фризер при -80 градуса. Пробите се центрофугират при 12,000 g за 10 минути при 4 градуса. Супернатантът се събира. Накрая, екстрактите бяха лиофилизирани и анализирани чрез UHPLC–MS/MS в Novogene. Файловете с необработени данни, генерирани от UHPLC–MS/MS, бяха обработени с помощта на Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher), за да се извърши подравняване на пикове, избор на пикове и количествено определяне за всеки метаболит. Софтуерът Metaboanalyst (v5.0) беше използван за по-нататъшен анализ на данни и след това бяха избрани значително обогатени пътища, използвайки P <0.05.

Експерименти за маркиране на стабилен изотоп

Метаболитният поток 13C се извършва върху Т клетки, като се използват описаните по-рано методи60,78,79. Накратко, РВМС се активират на ямка в 24-плаки с ямки с човешки анти-CD3/CD28 за 3 дни, както е описано по-горе. За проследяване на [13C6] глюкоза, средата беше превключена след 11 дни на RPMI без глюкоза (Gibco), допълнена с 10% диализиран FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% пеницилин-стрептомицин, 1% неесенциални аминокиселини, 50 μM -меркаптоетанол и 0.1 М HEPES, съдържащ 11 mM [13C6]глюкоза (Cambridge Isotope Laboratories) с контрола или 10 mM млечна киселина, за 24 часа. За проследяване на [13C16] палмитат, 2 × 107 Т клетки се активират и се поставят в завършена среда с контролни или 10 mM условия на млечна киселина, както е описано по-горе на ден 12, съдържаща 200 μM [13C16] палмитат (Cambridge Isotope Laboratories), за 8 ч. За проследяване на [13C5] метионин, Т клетките се разширяват под контрол, млечна киселина или млечна киселина с условия на 800 μM метионин за 12 дни. След това 4 × 107 Т клетки бяха превключени към пълна RPMI среда без метионин (Gibco) и култивирани при контролни условия, млечна киселина или млечна киселина, допълнена с метионин (съдържащ 100 μM, 100 μM или 800 μM [13C5]метионин) (Cambridge Isotope Laboratories), за 8 часа. Съответните супернатанти се събират и след това се съхраняват при -80 градуса. Клетките се пелетират чрез центрофугиране (300 g, 4 градуса, 5 минути), промиват се два пъти с физиологичен разтвор и веднага се замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при -80 градуса. Метаболитите се екстрахират чрез използване на ледено студен HPLC клас 80% метанол и се разбъркват за кратко, последвано от добавяне на 200 ml вода HPLC клас, след това 500 ml HPLC клас хлороформ (съотношение метанол:вода:хлороформ, 5:2:5 ). Сместа се разбърква на вортекс и се центрофугира, за да се постигне разделяне на фазите. Супернатантите се изсушават чрез центрофугиране под вакуум за последваща дериватизация и след това се инкубират с 2% (тегло/обем) метоксиамин хидрохлорид (226904, Sigma-Aldrich) в пиридин в продължение на 60 минути при 37 градуса и се силилират с N-метил-N-( tert-бутилдиметилсилил) трифлуороацетамид с 1% tert-бутилдиметилхлоросилан (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) за 30 минути при 45 градуса. Производните на [13C6]глюкоза бяха анализирани чрез GC-HRMS, газов хроматограф Trace 1310 (Thermo Fisher) с колона DB–35MS (Agilent Technologies) и Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS система (Thermo Fisher). GC-MS/MS метаболомични анализи бяха проведени от Metabo-Profile. Метаболитите бяха идентифицирани и количествено определени от Xcalibur (v4.1) и TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher), включително време на задържане, съотношение заряд/маса на йонни фрагменти и пикова интензивност. Производните на [13C16] палмитат и [13C5] метионин бяха анализирани чрез течна хроматография с ултрависоко налягане - троен квадруполен масспектрометър (UPLC-TQMS). Суровите данни от UPLC–TQMS бяха анализирани с помощта на софтуера MassLynx на Waters (v4.1, Waters) за пикова екстракция, интегриране, идентифициране и количествено определяне на метаболитите. За последващ статистически анализ беше използван език R (v4.1.1).

B16 туморен модел и адаптивна имунотерапия с клетъчен трансфер

За да се изследва антитуморната активност на Т клетки in vivo, 0.2 × 106 B16-OVA меланомни клетки бяха инжектирани подкожно в женски C57BL/6N мишки. Девет дни след имплантирането на тумор, мишките бяха инжектирани интравенозно с 5 × 106 Т клетки от женски OT-I мишки, разширени за 7 дни при различни условия. Мишките, носещи тумор, са получили 5 Gy сублетално облъчване преди ACT. Площта на тумора се измерва на всеки 2 дни и се изчислява като дължина (mm) × ширина (mm). Мишки с туморна площ, близка до 300 mm2, бяха евтаназирани. За да се изследва устойчивостта на разширените Т клетки при различни условия, 4 × 106 CD45.1+ Т клетки от женски OT-I мишки бяха адаптивно прехвърлени в женски C57BL/6N мишки. Една седмица по-късно мишките бяха евтаназирани и клетките от изолирана кръв, далаци и лимфни възли бяха преброени. Делът на прехвърлените Т клетки се определя чрез стробиране на Т клетки, експресиращи CD45.1+ и CD45.2+ чрез поточна цитометрия.

NCG мишки модел и CD19-CAR-T терапия

Женски NCG мишки бяха имплантирани подкожно с 1 × 106 CD19-K562 клетки. Когато туморните обеми достигнат 75 mm3, мишките получават 5 × 106 нетрансдуцирани Т клетки и CD19-CAR Т клетки, култивирани в контрола или 10 mM среда, съдържаща млечна киселина. Растежът на тумора се измерва на всеки 2 дни с електронни шублери и се изчислява по дължина (mm) × ширина (mm). Мишки с туморна площ по-голяма от 300 mm2 бяха евтаназирани. Туморите бяха събрани, усвоени и обработени с Percoll (Sigma), след което Т клетъчната функция и фенотипът бяха определени чрез поточна цитометрия.

Анализ на скоростта на базална консумация на кислород и скорост на извънклетъчно подкиселяване

За анализ на метаболитните характеристики, OCR и ECAR бяха оценени с анализатор XF24 на морско конче (Agilent). Накратко, човешки Т клетки, култивирани при различни условия в продължение на 12 дни, бяха предварително третирани с небуферирана XF среда (небуферирана RPMI 1640, съдържаща 10 mM глюкоза, 1 mM натриев пируват и 2 mM глутамин) . След това човешки Т клетки се посяват при 0.5 × 106 клетки на ямка в XF24 микроплака за клетъчна култура и се инкубират в инкубатор без CO2 за 1 час при 37 градуса. За да се подобри прилепването на клетките, плочите се въртят при стайна температура в продължение на 5 минути при 100 g с нулева спирачка. Консумацията на кислород и извънклетъчното подкисляване бяха анализирани при базални условия и в отговор на 1,25 μM олигомицин, 50 mM 2-деокси-d-глюкоза, 1,5 μM FCCP, 0,5 μM ротенон и 0,5 μM антимицин А. SRC беше изчислен чрез изваждане базалното OCR от максималното OCR.

Чип–qPCR

Имунопреципитацията на хроматин (ChIP) се извършва, следвайки инструкциите на производителя, предоставени с ChIP-IT експресен комплект за ензимно срязване (Active Motif). Накратко, 15 милиона човешки Т клетки, култивирани в условия на контрола или 10 mM млечна киселина, бяха фиксирани с формалдехид за 10 минути при стайна температура и реакцията на фиксиране беше спряна чрез добавяне на 1 × глицин. Фиксираните клетки се пелетират с PMSF и протеинов инхибиращ коктейл и се съхраняват при -80 градуса преди клетъчния лизис. След това размразената утайка се ресуспендира в 1 ml ледено студен лизисен буфер с PMSF и протеинов инхибиращ коктейл върху лед за 30 минути, за да се получи ядрен материал. След това ядрената пелета се суспендира отново и се усвоява с ензимен коктейл за разрязване на хроматина за 15 минути при 37 градуса. Нарязаният хроматин се инкубира с протеин G магнитни перли с анти-c-MYC (CST, кат. № 18583, 1:100 за ChIP) и анти-IgG (CST, кат. № 2729, 1:100 за ChIP) при 4 градуса през нощта. След това магнитните перли се промиват с ChIP буфери четири пъти и се елуират с 50 ul елуиращ буфер. Елуираната ДНК беше обратно омрежена за 2, 5 часа при 65 градуса и след това пречистена чрез екстракция с фенол-хлороформ. Пречистената ДНК се използва за извършване на ChIP-qPCR за откриване на обогатяването на MYC в промоторите на целевите гени. Праймерите, използвани за ChIP–qPCR, могат да бъдат намерени в допълнителна таблица 2.

Анализ на митохондриална маса и мембранен потенциал

Митохондриалната маса и мембранният потенциал бяха анализирани с помощта на MitoTracker Green и тетраметиродамин метилов естер (TMRM). Клетките се оцветяват с 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) или 50 nM TMRM (Thermo Fisher) в инкубатор при 37 градуса (5% CO2) за 1 час преди оцветяване на клетъчната повърхност. Клетките се промиват с FACS буфер три пъти, последвано от оцветяване с повърхностни маркери за по-нататъшен FACS анализ.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на GraphPad Prism версия 8.0. Резултатите са показани като средна стойност ± sem. Използван е двустранен t-тест на Student за сравняване на леченията с контролните групи. За множество сравнения беше приложен двупосочен ANOVA с теста на Sidak на Tukey или Dunnett за множество сравнения. P < 0.05 се счита за статистически значимо.

Препратки

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. Т стволови клетки на паметта при здраве и болест. Нац. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. et al. Т-клетки на паметта, подобни на стволови клетки: гледна точка от тъмната страна. Клетъчен имунол. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Адоптивен клетъчен трансфер като персонализирана имунотерапия за човешки рак. Наука 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Ракова имунотерапия с използване на блокада на контролни точки. Наука 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Стволови, ефекторни и хибридни състояния на CD8+ Т клетки на паметта. Тенденции Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. et al. Две подгрупи подобни на ствол CD8+ Т-клетъчни прогенитори с памет с различни ангажименти към съдбата при хората. Нац. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. et al. Подмножество от Т клетки на човешката памет със свойства, подобни на стволови клетки. Нац. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC Метаболитна и епигенетична регулация на изчерпването на Т-клетките. Нац. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Транскрипционен контрол на диференциацията на CD8+ Т клетките на ефектора и паметта. Нац. Rev. Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. et al. Първичната диференциация на тумор-специфични памет CD8+ Т клетки като добросъвестни отговорили на PD-1/PD-L1 блокада в дрениращи лимфни възли. Клетка 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqui, I. et al. Интратуморни Tcf1+ PD-1+ CD8+ Т клетки със свойства, подобни на стволови, подпомагат контрола на тумора в отговор на ваксинация и имунотерапия с блокада на контролни точки. Имунитет 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. et al. Съществена роля на ефектора на Wnt пътя Tcf-1 за установяването на функционална CD8 Т клетъчна памет. Proc. Natl Acad. Sci. САЩ 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP Епигенетичен контрол на CD8+ Т клетъчна диференциация. Нац. Rev. Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG et al. Родословната връзка на CD8+ Т клетъчни подмножества се разкрива чрез прогресивни промени в епигенетичния пейзаж. Cell Mol. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. et al. Епигенетичните пейзажи разкриват транскрипционни фактори, които регулират CD8+ Т клетъчната диференциация. Нац. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. et al. Геномният анализ на метилирането на хистони разкрива базирана на състоянието на хроматин регулация на генната транскрипция и функцията на паметта CD8+ Т клетки. Имунитет 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Метаболитните програми приспособяват Т-клетъчния имунитет при вирусна инфекция, рак и стареене. Cell Metab. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT и др. Конститутивният гликолитичен метаболизъм поддържа CD8+ Т клетъчна ефекторна диференциация на паметта по време на вирусна инфекция. Имунитет 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV et al. Антигенен рецепторен контрол на метаболизма на метионин в Т клетки. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan, D. et al. Т-клетките на паметта CD8+ използват присъща на клетката липолиза, за да поддържат метаболитното програмиране, необходимо за развитието. Имунитет 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL и др. Подобряване на CD8 Т-клетъчната памет чрез модулиране на метаболизма на мастни киселини. Nature 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ et al. Дихателният капацитет на митохондриите е критичен регулатор на развитието на паметта на CD8+ Т клетките. Имунитет 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Киселинната туморна микросреда като двигател на рака. Annu. Rev. Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN T клетъчна дисфункция при рак. Ракова клетка 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE et al. Туморната микросреда потиска Т-клетъчната митохондриална биогенеза, за да предизвика интратуморна Т-клетъчна метаболитна недостатъчност и дисфункция. Имунитет 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR et al. Нарушената митохондриална динамика в CD8+ TIL засилва изтощението на Т-клетките. Нац. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH et al. Метаболитната конкуренция в туморната микросреда е двигател на прогресията на рака. Клетка 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE et al. Митохондриалният стрес, предизвикан от непрекъсната стимулация при хипоксия, бързо води до изтощение на Т-клетките. Нац. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS et al. Интратуморна ниша поддържа и диференцира стволови подобни CD8 Т клетки. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ et al. Определяне на CD8+ Т клетки, които осигуряват пролиферативен взрив след PD-1 терапия. Nature 537, 417–421 (2016).

31. Haas, R. et al. Лактатът регулира метаболитни и провъзпалителни вериги в контрола на Т клетъчната миграция и ефекторните функции. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. et al. Т-клетките произвеждат киселинни ниши в лимфните възли, за да потиснат собствените си ефекторни функции. Нац. Общ. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. et al. Модулирането на киселинността на микросредата обръща анергията в човешки и миши тумор-инфилтриращи Т лимфоцити. Cancer Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gottfried, E. et al. Произведената от тумор млечна киселина модулира активирането на дендритните клетки и експресията на антиген. Кръв 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR et al. Функционална поляризация на свързани с тумор макрофаги от получена от тумор млечна киселина. Nature 513, 559–563 (2014).

36. Erra Diaz, F. et al. Екстрацелуларната ацидоза и инхибирането на mTOR стимулират диференциацията на дендритни клетки, получени от човешки моноцити. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. et al. Инхибирането на гликолитичния метаболизъм подобрява паметта на CD8+ Т клетките и антитуморната функция. J. Clin. Инвестирам. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. et al. Модулирането на mTOR сигнализирането задейства образуването на Т-клетки на паметта, подобни на стволови клетки. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN et al. mTORC1 и mTORC2 селективно регулират CD8+ Т клетъчната диференциация. J. Clin. Инвестирам. 125, 2090–2108 (2015).

40. Zhang, L. et al. Мишената на рапамицин комплекс 2 при бозайници контролира диференциацията на паметта на CD8 Т клетките по Foxo1-зависим начин. Cell Rep. 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. Роля на mTOR сигнализирането в подвижността на туморните клетки, инвазията и метастазите. Curr. Протеин Pept. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ et al. SCENITH: базиран на поточна цитометрия метод за функционално профилиране на енергийния метаболизъм с резолюция на една клетка. Cell Metab. 32, 1063–1075 (2020).

43. Рон-Харел, Н. и др. Митохондриалната биогенеза и ремоделирането на протеома насърчават метаболизма с един въглерод за активиране на Т-клетките. Cell Metab. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Подхранване на Т-клетъчен антитуморен имунитет: преразглеждане на метаболизма на аминокиселините. Рак Имунол. Рез. 9, 1373–1382 (2021).

45. Какарадов, Б. и др. Ранна транскрипционна и епигенетична регулация на CD8+ Т клетъчна диференциация, разкрита чрез едноклетъчно РНК секвениране. Нац. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Аминокиселини и техните транспортери в Т-клетъчния имунитет и терапията на рак. Mol. Клетка 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Количествен анализ на това как Myc контролира Т клетъчните протеоми и метаболитните пътища по време на Т клетъчното активиране. eLife 9, e53725 (2020).

48. Сукумар, М. и др. Потенциалът на митохондриалната мембрана идентифицира клетки с повишена стволовост за клетъчна терапия. Cell Metab. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. et al. IL15 повишава антитуморната активност на CAR-T клетките чрез намаляване на активността на mTORC1 и запазване на техния фенотип на паметта на стволовите клетки. Рак Имунол. Рез. 7, 759–772 (2019).

50. Buck, MD и др. Митохондриалната динамика контролира съдбата на Т клетките чрез метаболитно програмиране. Клетка 166, 63–76 (2016).

51. Кришна, С. и др. Стволови CD8 Т клетки медиират отговора на адоптивната клетъчна имунотерапия срещу човешки рак. Наука 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML и др. Йерархиите на доминиране на антиген оформят TCF1+ прогениторни CD8 Т клетъчни фенотипове в тумори. Клетка 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. et al. Метаболитното препрограмиране на крайно изтощени CD8+ Т клетки от IL-10 повишава антитуморния имунитет. Нац. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI et al. Метаболитно кондициониране на CD8+ ефекторни Т клетки за адоптивна клетъчна терапия. Нац. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Глутаминът регулира антитуморната активност на CD8 Т клетки. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK et al. Стволовите Т клетки и дисфункцията в туморите се задействат от общ механизъм. Наука 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. et al. Предубеденото активиране на човешки Т-лимфоцити, дължащо се на ниско извънклетъчно рН, се антагонизира от B7/CD28 костимулация. Евро. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. Натрупването на лактат на мястото на хронично възпаление насърчава заболяването чрез индуциране на метаболитно пренавиване на CD4+ Т клетките. Cell Metab. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. Лактатът повишава стволовостта на CD8+ Т клетките, за да подсили антитуморния имунитет. Нац. Общ. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG et al. Метаболизмът на метионина оформя реакциите на Т хелперните клетки чрез регулиране на епигенетичното препрограмиране. Cell Metab. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. Метаболитен контрол на решенията за съдбата на CD8+ Т клетки и антитуморен имунитет. Тенденции Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Лишаването от глюкоза инхибира множество ключови генни експресионни събития и ефекторни функции в CD8+ Т клетки. Евро. J. Immunol.38, 2438–2450 (2008).

63. O'Sullivan, D. et al. Т-клетките на паметта CD8+ използват присъща на клетката липолиза, за да поддържат метаболитното програмиране, необходимо за развитието. Имунитет 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. et al. Окисляването на мастни киселини контролира преживяемостта на Т-клетките на паметта на CD8+ в стомашния аденокарцином. Рак Имунол. Res 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. et al. Действията на Etomoxir върху регулаторните и Т-клетките на паметта са независими от Cpt1a-медиираното окисляване на мастни киселини. Cell Metab. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Метаболитни входове в епигенома. Cell Metab. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA et al. S-2-хидроксиглутаратът регулира съдбата на CD8+ Т-лимфоцитите. Nature 540, 236–241 (2016).

68. Zhang, H. et al. Генерираният от кетогенезата бета-хидроксибутират е епигенетичен регулатор на развитието на паметта на CD8+ Т-клетките. Нац. Cell Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. et al. Ракът SLC43A2 променя метаболизма на Т-клетъчния метионин и метилирането на хистони. Nature 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. et al. Транслационният контрол на c-MYC от рапамицин насърчава терминална миелоидна диференциация. Кръв 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Метаболитен контрол на епигенетиката и неговата роля в CD8+ Т клетъчната диференциация и функция. Преден. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. et al. Йонната имунна супресия в туморната микросреда ограничава ефекторната функция на Т клетките. Nature 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. et al. Компонентите на cBAF комплекс и MYC си сътрудничат рано в съдбата на CD8+ Т клетките. Nature 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Метаболитен контрол на генерирането и стволови клетки на паметта. Cold Spring Harb. Перспектива. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS и др. CUT&Tag за ефективно епигеномно профилиране на малки проби и единични клетки. Нац. Общ. 10, 1930 (2019).

76. Jin, H. et al. ChIPseqSpikeInFree: подход за нормализиране на ChIP–seq за разкриване на глобални промени в модификациите на хистони без навлизане. Биоинформатика 36, 1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Екстракция на метаболит от клетки на бозайник, култивирани в суспензия за глобално профилиране на метаболит. Нац. Protoc. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. et al. Катаболизмът на аминокиселините регулира протеостазата на хематопоетичните стволови клетки чрез GCN2-eIF2 ос. Клетъчни стволови клетки 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. et al. Митохондриалният пируватен носител регулира диференциацията на Т-клетките на паметта и антитуморната функция. Cell Metab. 34, 731–746 (2022).