Пациенти със съдова хирургия с повишени съотношения на неутрофили към лимфоцити имат понижена експресия на РНК на неутрофилния комплемент
Nov 24, 2023
Повишеното съотношение неутрофили към лимфоцити (NLR) при пациенти, подложени на планова съдова хирургия (EVS), има повишена смъртност, независимо от периоперативните хирургични резултати. За да разберем защо високият NLR е свързан с по-висока смъртност, ние изследвахме експресията на транскриптоми на неутрофили и лимфоцити при пациенти, подложени на EVS. Бяха събрани кръвни проби от пациенти, подложени на EVS, и здрави донори за изчисляване на NLR. РНК проби бяха изолирани от неутрофилите и лимфоцитите на пациентите и разделени на NLR_Low (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Въведение
Сърдечно-съдовите заболявания (ССЗ) са водеща причина за смърт в световен мащаб. Дължи се до голяма степен на атерогенезата и атеросклерозата, които, в допълнение към индивидуалната генетика и диета, се медиират от възпалителни и имунни механизми.1-3 Напоследък диференциалният брой на левкоцитите (неутрофили и лимфоцити) влезе в центъра на вниманието за прогнозиране на сърдечно-съдови (СС) резултати. Съотношението на абсолютния брой неутрофили към лимфоцити (NLR) е признато за предиктор на общата смъртност в множество малки проучвания на остри коронарни интервенции,4-6 хипертония,7,8 и сърдечна недостатъчност.9
Таблица 1. Клинични характеристики на пациенти с планова съдова хирургия, изследвани чрез RNA-seq
Предишни изследвания също показаха, че NLR е предиктор за дългосрочни резултати при пациенти с периферно съдово заболяване.10-13 Нашите ретроспективни проучвания на популациите от пациенти със съдова хирургия подкрепят това заключение. В 1 проучване на 108 пациенти с елективна ендоваскуларна корекция на аневризма на коремната аорта, няма разлика в 30--дневната следоперативна смъртност между NLR на<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 пациенти, 42,6% риск от инсулт) в сравнение с тези с NLR от<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] NLR групи, съответно).16 Пациентите с по-нисък предоперативен NLR са постигнали значително по-голяма преживяемост без ампутация при 4-годишното проследяване (нисък NLR 65,5%, среден NLR, 37,5% и висок NLR, 17,6 % [P <.0001]).16
В това проучване извършихме РНК секвениране (RNA-seq) на неутрофили и лимфоцити от пациенти, които са се квалифицирали за елективна васкуларна хирургия (EVS), за да определим потенциалните механизми за повишен NLR. Проучванията изследват дали има молекулярна основа за повишен NLR. Нашите изследвания разкриват, че пациентите с повишен NLR, които са имали възстановяване на EVS, се отличават със силно значимо понижено регулиране на имуноглобулин и гени на комплемента в неутрофилите.
Cistanche ползи - укрепва имунната система
Методи
пациенти
Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), статус на тютюнопушене, лечение със статини, анамнеза за хронична обструктивна белодробна болест, рак, хронично бъбречно заболяване, коронарна артериална болест (CAD), периферна артериална болест, мозъчно-съдова болест и хронична сърдечна недостатъчност. На всички пациенти е направена пълна кръвна картина с диференциално броене на белите кръвни клетки. Пациентите бяха разделени на нисък NLR (NLR_Нисък [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery.
Разделяне на кръвта
Цялата кръв (20 mL на пациент) се събира в 10 mL вакуумни епруветки, антикоагулирани с EDTA, и кръвта се отделя в рамките на един час след вземането. Неутрофилни и лимфоцитни клетъчни популации бяха изолирани всяка от 8 mL кръв с помощта на комплекти за директно изолиране на човешки клетки EasySep (STEMCELL Technologies, Ванкувър, Канада) и Big Easy EasySep магнит (STEMCELL Technologies, Ванкувър, Канада) съгласно протоколите на производителя. Магнитът беше охладен върху лед преди това и кръвните клетки и реагентите бяха внимателно смесени чрез обръщане на епруветката вместо пипетиране. Съотношенията на реагентите също бяха коригирани по следния начин, за да се оптимизира възстановяването: 400 mL смес от антитела, 400 mL магнитни перли и 4 mL фосфатно буфериран физиологичен разтвор бяха добавени към кръвта преди първото разделяне, последвано от 200 mL антитяло смес и 400 mL зърна преди второто разделяне и 200 mL зърна преди третото и окончателно разделяне. Малка аликвотна част от 200 mL беше взета от крайните възстановени обеми за преброяване на клетките и подготовка на слайда. Остатъкът от обема за възстановяване се центрофугира при 1000 оборота в минута за 7 минути, за да се утаят клетките.
Фигура 1. Цял транскриптом на РНК от неутрофили и лимфоцити, събрани от пациенти с NLR, висок (NLR_High), нисък (NLR_Low) или контрол (NLR_Control) . Кодът с букви "N" или "L" в името на пробата означава, че или неутрофилите, или лимфоцитите са били източникът на РНК. Във всяка категория имаше 6 пациенти. Син=намалено ниво на изразяване; червено=високо ниво на изразяване.
Преброяване на клетките и подготовка на слайдовете
Клетките, ресуспендирани във фосфатно буфериран физиологичен разтвор, бяха допълнително разделени на аликвоти, смесени с трипаново синьо и ръчно преброени с помощта на хемоцитометър. Обикновено 9 × 106 до 15 × 106 неутрофили и 3 × 106 до 10 × 106 лимфоцити се изолират на проба. Слайдовете на изолираните клетки се приготвят с помощта на цитоцентрофуга, въртят се при 600 оборота в минута за 3 минути и след това се оцветяват с оцветяване на Wright-Giemsa. Чистотата на всяка клетъчна популация се определя чрез ръчно преброяване, при което се разграничават най-малко 1000 клетки на слайд. Средната чистота на отделените неутрофили и лимфоцити чрез преброяване на клетките е съответно 98,3% и 96,2%. Проточната цитометрия се извършва на 1 проба от двойка неутрофили и лимфоцити и показва съответно 90,6% и 92,2% чистота. Другите клетки в неутрофилния препарат се разделят на лимфоцити (4%), моноцити (2%), еозинофили (2,3%) и базофили (0,3%). В лимфоцитния препарат другите клетки са неутрофили (1,2%), моноцити (1,4%), еозинофили (1,2%) и базофили (1,8%). Масовите RNA-seq данни от всички индивидуални проби също бяха използвани за определяне на степента на моноцитно замърсяване в клетъчните препарати чрез определяне дали неутрофилите или лимфоцитите от NLR_High или NLR_Low проби имат значително повишен CD14 , CD68, CD83 или CD163. Независимо от това, данните за RNA-seq бяха въведени в оценката на дела на имунните и раковите клетки (EPIC), програма, предназначена да оцени дела на имунните и раковите клетки в данните за масовата генна експресия.17 Използваният референтен профил беше предоставен от EPIC за циркулиращите в кръвта имунни клетки и съдържа профила за В клетки, CD4 и CD8 Т клетки, моноцити, неутрофили и естествени клетки убийци. Отчетеният резултат е даден като клетъчни фракции на проба.
Фигура 2. Значително диференциално експресирани гени от неутрофили и лимфоцити. (A) Броят на значително диференциално експресираните гени в неутрофилите (сини) и лимфоцитите (оранжеви). (B) Диаграмата на анализа на главния компонент на значително диференциално експресирани гени в неутрофили (зелени и лилави) и лимфоцити (червени и сини) в NLR_High (кръгове) и NLR_Low (квадрати). (C) Топлинна карта на значително диференциално експресирани гени от NLR_High vs NLR_Low неутрофилна РНК. (D) Топлинна карта на значително диференциално експресирани гени от NLR_High vs NLR_Low лимфоцитна РНК.
RNA-seq и статистически анализ
Подробни методи за екстракция и секвениране на РНК са представени в допълнителните методи. Четенията на последователността бяха оценени за качество и адаптерът беше подрязан с помощта на TrimGalore! (Babraham Institute), скрипт за обвивка за FastQC и CutAdapt. Отчитанията, преминаващи контрол на качеството, бяха подравнени към човешкия референтен геном GRCh38 с помощта на софтуера за подравняване STAR. Подравнените четения бяха обработени с помощта на копчета за ръкавели версия 2.2.1 за анализ на диференциална експресия, използвайки анотацията на ген GENCODE за GRCh38 и данните за експресия на ниво ген бяха докладвани във фрагменти на килобаза транскрипт на милион картирани четения.18 Значително диференциално експресирани гени бяха идентифицирани с помощта на фалшива пределна стойност на нивото на откриване P стойност на<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.
Резултати
Характеристики на пациента
Бяха избрани шест двойки проби от пациенти от 7 NLR_High и 9 NLR_Low на базата на най-високото качество на РНК в двойката, оценено чрез числото за интегритет на РНК (RIN) (Таблица 1 ). Изследвани са и шест контроли от 8 здрави донора. При пациентите, включени в проучването, средното ± стандартно отклонение NLR за NLR_High е 4,37 ± 0.66 спрямо NLR_Low, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Средното ± стандартно отклонение на възрастта на пациентите е 61,0 ± 17,0 години за NLR_High и 64,5 ± 7,5 години за NLR_Low (P= .68). Всички с изключение на 1 пациент имаха аортна аневризма, 9 бяха торакални/торакоабдоминални и 2 бяха абдоминални. И двамата пациенти с аневризма на коремната аорта бяха в NLR_Ниската група. Единадесет от 12-те пациенти са имали анамнеза за хипертония. Четирима от 6 пациенти и в двете групи с NLR_High или NLR_Low са имали анамнеза за липидни аномалии. Четирима пациенти в групите с NLR_High и 3 пациенти в NLR_Niske групи са бивши пушачи. Един пациент в групата на NLR_Low беше активен пушач. Петима пациенти в групите с NLR_висока и 4 в групите с NLR_ниска са били на статини. Само 3 пациенти в двете групи са били диабетици. Един пациент във всяка група е имал анамнеза за CAD, а 2 пациенти в NLR_Low групата са имали заболяване на периферната артерия.
Фигура 3. Данните за RNA-seq в това изследване бяха използвани като независимо средство за определяне на друго клетъчно замърсяване в препаратите от неутрофили и лимфоцити. Показани са само данни от неутрофилите. Беше извършен EPIC анализ, за да се оцени дела на имунните и раковите клетки в насипните данни за генна експресия. Този анализ дава процента на неутрофили, моноцити, В клетки, CD4 Т клетки, CD8 Т клетки, естествени клетки убийци (NK) и други клетки в неутрофилния препарат.
Цял транскриптом
Наблюдавахме глобални разлики в целия транскриптом при сравняване на профили на генна експресия между неутрофили и лимфоцити (Фигура 1). Това откритие не е изненадващо, тъй като специфичната за клетъчния тип генна експресия преди е била характеризирана като различна.19 В секцията за неутрофили, при пациентите в NLR_Висока, NLR_Ниска и NLR{{ 4}}Контролни групи, имаше много гени с повишена регулация, които очевидно не бяха регулирани нагоре в лимфоцитната секция и обратно. На цялото ниво на транскриптом, клетъчно-специфичните разлики между неутрофилите и лимфоцитите са различни и доминиращи, независимо от NLR или дали пациент или контрола. При по-внимателно разглеждане обаче разликите започнаха да се появяват. Графика за анализ на главните компоненти показа, че контролът на NLR_или за неутрофили, или за лимфоцити се припокрива с NLR_висок и NLR_нисък и в двете клетки (допълнителна фигура 1). След това изследванията се стремят да намерят допълнителни разлики между NLR_High и NLR_Low групите в значително диференциално експресираните гени. Беше наблюдавано, че 900 (74,5%) значително диференциално експресирани гени бяха наблюдавани в неутрофилите в групите NLR_High vs NLR_Low (Фигура 2A). За сравнение, лимфоцитите имат само 190 (15,7%) значително диференциално експресирани гени. Диаграма за анализ на основните компоненти на NLR_High гени срещу NLR_Low гени в неутрофили и лимфоцити разкри, че групата на NLR_High срещу NLR_Low гени в неутрофилите сегрегират в 2 отделни области, докато гените на NLR_High и NLR_Low лимфоцити се припокриват (Фигура 2B). Отново, както при данните за целия транскриптом, NLR_Control се припокрива с NRL_High и NLR_Low значително диференциално експресирани гени както в неутрофилите, така и в лимфоцитите (допълнителна фигура 2). Повечето от значително диференциално експресираните гени в NLR_High на неутрофилите бяха регулирани надолу от NLR_Low (Фигура 2C). Подобен, но много по-малък брой гени беше регулиран надолу при NLR_High на лимфоцитите, отколкото този на неутрофилите (Фигура 2D). Тези данни предполагат, че нивата на NLR са свързани най-вече с променена генна експресия в неутрофилите. Освен това трябваше да се сравни с пациентите от неговата група на заболяването NLR_Нисък, а не NLR-контрол, тъй като първата група ясно се отдели от NLR_Висок, но не и NLR_Контрол ( Фигура 2B; допълнителна фигура 2).
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Преди да се изследва диференциалната експресия на гените и обогатяването на генния набор, допълнителни проучвания характеризират степента на замърсяване с моноцити в неутрофилния препарат. Използвайки данните от RNA-seq, наблюдавахме, че експресията на моноцитните маркери CD14, CD68, CD83 и CD163 в NLR_High спрямо NLR_Low неутрофили или лимфоцитни препарати не се различават значително. EPIC анализът на неутрофилните RNA-seq данни показа, че неимунните клетки ("други клетки") и CD4 Т клетките са основните замърсители в неутрофилните препарати (Фигура 3). С изключение на NLR{{10}}Нисък CD4 Т клетки и В клетки, никоя от другите замърсени клетки не се различава значително в NLR_Ниски неутрофили спрямо NLR_Високи неутрофили . В неутрофилния препарат замърсяването с моноцити чрез EPIC анализ беше само 0.17% ± 0.05% за NLR_Ниско срещу 0,1% ± 0,033% за NLR_Високите препарати (P=.12). Тази стойност показва, че замърсяването с моноцити е с порядък по-ниско, когато се определя чрез анализ на данни от RNA-seq спрямо поточна цитометрия.
Фигура 4. Диаграма на разпръснати мехурчета на значително изразени категории набор от гени GO за биологични процеси между NLR_High и NLR_Low. Съотношението на k: K на абсцисата е броят на гените, които са значително различно експресирани (k) в сравнение с общия брой гени в категорията (K). По ординатата е значимостта на обогатяването, изразено като логаритъм (P стойност). (A) Набори GO гени, получени от неутрофилна RNA-seq, сравняваща NLR_High с NLR_Low. (B) GO генни набори, получени от лимфоцитна РНК-последователност. Наборите гени в долния ляв ъгъл на двата графика са най-малко значими. Наборите гени в горния десен ъгъл на двата графика са най-значими.
Фигура 4 (продължение)
За да изследваме естеството на диференциално експресираните гени, извършихме GSEA с категории на генната онтология (GO) за биологични процеси, използвайки значително диференциално експресираните набори гени между NLR_High и NLR_Low. Резултатите са показани в диаграми с разпръснати мехурчета (Фигура 4). Разделянето на генните комплекти в горния десен ъгъл на всеки от графиките показва (1) висок процент на гените в генните набори, които са значително променени и (2) висока степен на значимост за обогатяването на генния набор. В нашата проба диаграмите на разпръснатите мехурчета показват обогатяването както на комплемента, така и на хуморалния отговор GO категории независимо както за неутрофилите, така и за лимфоцитите. В неутрофилите генните комплекти за класическия път на активиране на комплемента, регулиране на каскадата на активиране на протеини и хуморален имунен отговор, медииран от циркулиращия имуноглобулин, са най-значими с най-високия процент членове на генния набор, значително променен (Фигура 4А). Независимо от това, идентичните набори гени в лимфоцитите също се наблюдават, че имат високо съотношение на значително променени гени и степен на значимост, както при изследванията на неутрофилите (Фигура 4B).
Таблица 2. Набори от имунологични гени в неутрофили и лимфоцити
Таблица 2 изброява най-значително променените набори от имунологични гени в неутрофили (Таблица 2, Панел A) и лимфоцити (Таблица 2, Панел B). Това проучване сравнява генната експресия в неутрофили или лимфоцити между NLR_High проби и NLR_Low проби. Здрави NLR_Контролни проби не бяха сравнени, тъй като техните нива на експресия се припокриват с NLR_High и NLR_Low проби от пациенти както в целия транскриптом, така и в значително диференциално експресирани набори гени. В допълнение, здравите NLR_контролни проби не бяха съпоставени по възраст, заболяване и хирургично състояние (допълнителни фигури 1 и 2). Както в неутрофилите (Таблица 2), така и в лимфоцитите (Таблица 2), данните показват, че експресията на набори гени, свързани с имунната система, е значително различна, когато NLR_High се сравнява с NLR_Low . На RNA seq всеки клетъчен тип има същите открития като другия клетъчен тип. И в двата панела нивата на значимост на основните набори гени се максимизират при P <1E-24. Тези данни са много значими, независимо дали са изследвани неутрофилите или лимфоцитите. За да се съсредоточи върху силно значимата област на съдържанието на това изследване на RNA-seq, беше изследвана значително диференциално експресирана експресия на ген на имуноглобулин. Първо, диаграма за анализ на главния компонент на неутрофилните гени показа, че за NLR_High срещу NLR_Low, значително диференциално експресираните имуноглобулинови гени са разделени в 2 групи (допълнителна фигура 3A). Като алтернатива, лимфоцитните гени на NLR_High срещу NLR_Low се припокриват (допълнителна фигура 3A). След това комбинирана топлинна карта на имунно-свързана генна експресия между NLR_High с NLR_Low беше сравнена в неутрофили и лимфоцити (Фигура 5). Като цяло, когато се изследва цялата топлинна карта, има очевидно понижено регулиране на цялото генно семейство от имуноглобулинови гени в групата на неутрофилите NLR_High в сравнение с тази на NLR_Low. Повечето гени (69/156, 44%) са свързани с имуноглобулин. Само 12 от 156 (7,7%) гени са свързани с комплемента: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD и CD59. В групата на лимфоцитите също имаше понижена регулация на предимно имуноглобулинови гени в категорията NLR_High.
Комплектите гени на комплемента в неутрофилите и лимфоцитите са подробно описани в таблица 3. Както в неутрофилите (таблица 3), така и в лимфоцитите (таблица 3), експресията на гени в 3 комплекта гени, свързани със системата на комплемента, е значително различна (P < 1E{{ 5}}), когато NLR_High проби бяха сравнени с NLR_Low проби. Това наблюдение е същото, независимо дали сравнението е между РНК от неутрофили или лимфоцити. 3-те набора гени включват активиране на комплемента, класически път на активиране на комплемента и регулиране на активирането на комплемента. Графика на анализ на главния компонент на неутрофилните гени отново показа, че за NLR_High срещу NLR_Low, значително диференциално експресираните гени на комплемента са разделени в 2 групи (допълнителна фигура 3B). Като алтернатива, лимфоцитните гени на NLR_High срещу NLR_Low се припокриват (допълнителна фигура 3B).
Фигура 5. Топлинна карта на значително диференциално експресирани гени в набора от имуноглобулинови гени в неутрофили (вляво) и лимфоцити (вдясно). Гените, изброени вдясно на всяка топлинна карта, са членовете на имуноглобулина
Топлинна карта на неутрофили и експресия на лимфоцити на свързан с комплемента генен набор, сравняващ NLR_High с NLR_Low, е показана на Фигура 6. В неутрофилите огромен брой гени са били регулирани надолу в NLR_Голямо население. В този генен набор, подобно на имуноглобулиновите генни комплекти, повечето гени (69/ 86, 80%) са свързани с имуноглобулин. Само 12 от 86 (14%) са компоненти на комплемента и регулаторни гени (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH и CFD). Като цяло в групата на лимфоцитите имаше по-малко експресии на комплементни гени, а имуноглобулиновите гени бяха малко по-ниско регулирани в групата с NLR_High. Тъй като има по-добро разбиране на гените на системата на комплемента в сравнение с гените на имуноглобулиновите системи, вниманието беше фокусирано върху системата на комплемента като потенциален кандидат за целеви гени, свързани с висок и нисък NLR. Композитна топлинна карта, сравняваща NLR_High с NLR_Low, беше изготвена, показваща експресията на системата на комплемента и свързаните гени както в неутрофилни, така и в лимфоцитни проби (Фигура 7). В по-голямата си част лимфоцитът не е резервоарна клетъчна система за системата на комплемента. Повечето гени на комплемента не се регулират нагоре в лимфоцитите. Присъстваха само C1S, CR2, C5, C8G, C5 и CFB с разлика в експресията между NLR_High и NLR_Low лимфоцити (Фигура 7). CD81 в лимфоцитите е В-клетъчен тетраспанин. Експресиите на C1S и C8G изглежда са значително по-високи в NLR на лимфоцити_Високи от тези на NLR на лимфоцити_Ниски, подобно на KLKB1, гена за плазмен прекаликреин.
Обратно, при неутрофилите, NLR_High показва понижена регулация на комплементните компонентни гени C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 и C3AR1 и техните регулаторни на комплемента (инхибиторни) гени CD59, CFB и CFI . Само C2 и CFD гените са регулирани нагоре при пациенти с NLR_High_N. CD59 и C9 са относително повишени в неутрофилния NLR_Low_N в сравнение с тези на NLR_High_N. FGFR4 е рецептор на растежен фактор. CFH присъства, но изглежда не се влияе от неутрофилния NLR_висок или NLR_нисък. Той е по-силно експресиран в лимфоцитите.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Дискусия
NLR за диференциалното броене на левкоцитите се превърна в широко използван прост маркер за разпознаване на потенциални вредни резултати при широк спектър от заболявания, включително ССЗ, солидни тумори и възпалителни заболявания като системен лупус еритематозус и системна склероза. В нашите собствени ретроспективни изследвания на пациенти с атеросклеротична ССЗ наблюдавахме, че пациентите с висок NLR имат по-висок процент на късна смъртност след елективна корекция на аортна аневризма, по-висок процент на късен инсулт/смърт след профилактична каротидна ендартеректомия и намалена преживяемост без ампутация след елективна феморално-поплитеална реваскуларизация, ако техният NLR е повишен.14-16 Настоящите изследвания са започнати, за да се намери механистична основа за висок NLR. лимфом, множество солидни тумори и възпалителни заболявания като системен лупус еритематозус и системна склероза. В нашите собствени ретроспективни изследвания на пациенти с атеросклеротична ССЗ наблюдавахме, че пациентите с висок NLR имат по-висок процент на късна смъртност след елективна корекция на аортна аневризма, по-висок процент на късен инсулт/смърт след профилактична каротидна ендартеректомия и намалена преживяемост без ампутация след елективна феморално-поплитеална реваскуларизация, ако техният NLR е повишен.14-16 Настоящите изследвания са започнати, за да се намери механистична основа за високо NLR.
Таблица 3. Комплекти гени на комплемента в неутрофили и лимфоцити
За да разработим безпристрастен подход по отношение на механизма(ите) на диференциалните ефекти на NLR върху CV резултатите, ние извършихме RNA-seq върху неутрофили и лимфоцити от едни и същи пациенти. За това проучване всички пациенти с аортно заболяване бяха проспективно събрани и групирани в категории NLR според техните резултати. Последните 6 проби във всеки от 2-та клетъчни типа бяха избрани по най-високото ниво на техния RIN в подготвената РНК на сдвоените проби от неутрофили и лимфоцити, без оглед на пол, възраст или предишни медицински състояния. Както може да се види в Таблица 1, пациентите в групите с NLR_High и NLR_Low бяха доста сходни и се различаваха само по своя NLR.
Качеството на РНК, използвана в това изследване, се показва от RIN и пълната сегрегация на модела на генна експресия между неутрофили и лимфоцити във всички събрани групи пациенти (висок NLR, нисък NLR и контроли) (Фигура 1). Графика на анализ на главния компонент показва, че NLR_контролните данни са неуместни в това изследване, тъй като NLR на пациентите се припокрива с NLR_High и NLR_Low в популациите на неутрофили и лимфоцити на пациентите . Анализът на GSEA даде голяма представа за това кои генни набори са обогатени в GO генните набори от биологични процеси, а диаграмата с разпръснати мехурчета ясно демонстрира това чрез начертаване на логаритмичната значимост спрямо съотношението на броя на променените гени спрямо общия брой гени в наборите от гени. При прегледа наборите от гени, които се отделят от целия списък, са тези в хуморалния (имуноглобулин) имунитет и системата на комплемента (Таблици 2 и 3) въз основа на съотношението и статистическата значимост при безпристрастен подход за откриване.
Трудно е да се работи с големия брой имуноглобулинови гени на хуморалния имунитет, тъй като важните разлики между тези гени не са добре известни. Като алтернатива, много повече се знае за системата на комплемента и фокусът върху класическата система на комплемента, която се активира от имуноглобулин, е разпознаваема цел за възпаление и заболяване, свързано с имуноглобулините. Нашите данни предполагат, че гените на класическия компонент на комплемента C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 и няколко регулаторни гена (CD59, CFB CFI и CFH) са понижени в неутрофилите на пациентите с висок NLR (Фигура 7). Тези открития са поразителни по 3 причини. Първо, участващите гени са предимно тези от класическия път на комплемента. Второ, при пациенти с висок NLR, тези комплементни гени в по-голямата си част са регулирани надолу в сравнение с тези на пациенти с нисък NLR. И накрая, повече F12 се експресира в неутрофили от NLR_High отколкото тези от NLR_Low проби. Ензимните форми на протеиновия продукт на F12 (фактор XII [FXII]) активират класическия път на комплемента и неутрофилите.20 Обратно, PLG, генът за плазминоген и активатор на FXII, се регулира надолу в лимфоцитите и неутрофилите от пациенти с NLR{ {21}}Високо, което предполага, че самото активиране на FXII може да бъде регулатор на активирането на комплемента.
В допълнение, доказано е, че класическата система на комплемента участва в ускореното ССЗ. Компонентът на комплемента 1q (C1q) е началният фактор на пътя на комплемента, който има важна роля както във вродената, така и в придобитата имунна система.21 Доказано е, че C1q има двойна роля, положителен и отрицателен ефект върху атеросклерозата.22 В класическата път на комплемента, C1q има защитна роля в ранен стадий на атеросклероза чрез регулиране на молекулярния сигнал на макрофагите чрез независим от комплемента път, модулиране на усвояването на атерогенен липопротеин, медииране на апоптотични клетки и елиминиране на клетъчни остатъци.23,24 Скорошно проучване на Jia et al23 показва, че намаленият серумен C1q е свързан с CAD. Друго проучване от Guo et al24 показва, че повишената активност на C1q е свързана с CAD. И накрая, последните проучвания показват, че пациентите с диабет с намален C1q имат съкратена преживяемост.25 Тези данни показват, че изследването на системата на комплемента може да бъде важно за разбирането на възпалително-медиираната патогенеза на CVD.
Фигура 6. Топлинна карта на значително диференциално експресирани гени в генния набор на комплемента в неутрофилите (вляво) и лимфоцитите (вдясно). Гените, изброени вдясно на всяка топлинна карта, са членовете на комплекта гени на комплемента. РНК е от неутрофили или лимфоцити, събрани от пациенти с висок (NLR_High) или нисък (NLR_Low) NLR. Шест отделни проби от NLR_High се сравняват с 6 отделни проби от NLR_Low както от неутрофили, така и от лимфоцити.
Фигура 7. Композитна топлинна карта на комплемент и свързани гени от неутрофили или лимфоцити NLR_High или NLR_Low. Във всяка категория съставната топлинна карта беше изготвена от 6 отделни RNA-seq проби от всеки клетъчен тип.
Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Въпреки че понижаването на липидите не оказва влияние върху NLR, противовъзпалителната терапия с канакинумаб, инхибитор на интерлевкин 1, понижава NLR (P <.0001).26 Тези данни предполагат, че NLR може да бъде маркер за CVD, независимо от липидите и влияние на статините. Този ad hoc анализ на множество проспективни рандомизирани проучвания предполага, че NLR може да бъде независим рисков фактор за смъртност при ССЗ.
Има някои ограничения в това проучване. Нашите неутрофилни препарати имат 4% лимфоцитно и 2% моноцитно замърсяване чрез поточна цитометрия. Тъй като не е известно, че неутрофилите синтезират имуноглобулин, промените в гена на неутрофилния имуноглобин могат да бъдат от замърсяване на В клетки. При EPIC анализа имаше значително увеличение на замърсяването на В-клетките на пробите с NLR-Low. Това наблюдение предполага, че повишаването на нивото на имуноглобулиновите гени в пробите с ниски неутрофили на NLR_ може да възникне от замърсяване с B-клетки. По този начин намалените имуноглобулинови гени в NLR_High проби може да се дължат на повишени В клетки в NLR_Low проби и не непременно намалени нива на имуноглобулинови гени в NLR_High проби. По същия начин не е известно, че неутрофилите са клетки, произвеждащи комплемент. Два процента замърсяване с моноцити може да бъде източникът на гените на комплемента. Въпреки това, използвайки данните за RNA seq, ние наблюдавахме, че няма значителна разлика в моноцитното замърсяване на неутрофилните препарати между NLR_Low и NLR_High. Освен това извършването на EPIC анализ на данните от RNA-seq показва, че замърсяването с моноцити е било<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
В обобщение, кардиналното откритие в това изследване е, че при високи NLR състояния много гени на комплемента и някои от техните регулатори се регулират надолу в неутрофилите. Не е ясно общото значение и състоянието на активиране на идентифицираните комплементни гени с понижена регулация. Тъй като комплектите гени на комплемента са забележително намалени, ние спекулираме, че индивиди с NLR_Висока и съкратена следоперативна преживяемост имат загуба на основни CV защитни механизми, осигурени от системите на комплемента. Тази оценка трябва да се проучи проспективно в клинични изследвания за основния механизъм(и) за този резултат.
Препратки
1. Рос Р. Атеросклероза – възпалително заболяване. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.
2. Getz GS. Тематична серия прегледи: имунната система и атерогенезата. Имунна функция при атерогенеза. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.
3. Hansson GK, Hermansson A. Имунната система при атеросклероза. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.
4. Дъфи Б.К., Гурм Х.С., Раджагопал В., Гупта Р., Елис С.Г., Бхат Д.Л. Полезността на повишеното съотношение на неутрофили към лимфоцити при прогнозиране на дългосрочна смъртност след перкутанна коронарна интервенция. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.
5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Връзка между съотношението неутрофили към лимфоцити при приемане и резултатите при пациенти с остър коронарен синдром. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.
6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH, et al. Предоперативно съотношение неутрофили-лимфоцити и резултат от присаждане на коронарен артериален байпас. Am Heart J. 2007; 154 (5): 995-1002.
7. Fici F, Celik T, Balta S, et al. Сравнителни ефекти на небиволол и метопролол върху ширината на разпределение на червените кръвни клетки и съотношението неутрофили/лимфоцити при пациенти с новодиагностицирана есенциална хипертония. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.
8. Karaman M, Balta S, Ay SA, et al. Сравнителните ефекти на валсартан и амлодипин върху нивата на vWf и съотношението N/L при пациенти с новодиагностицирана хипертония. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.
9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Полезност на съотношението неутрофили към лимфоцити при прогнозиране на дългосрочни резултати при остра декомпенсирана сърдечна недостатъчност. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.
10. Bhat TM, Afari ME, Гарсия LA. Съотношение на неутрофилни лимфоцити при периферно съдово заболяване: преглед. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.
11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Съотношението неутрофили-лимфоцити прогнозира средносрочна преживяемост след елективна голяма съдова хирургия: напречно проучване. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.
12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Съотношението неутрофили към лимфоцити прогнозира периоперативна смъртност след отворено елективно възстановяване на аневризми на коремната аорта. Vasc Endovasc Surg. 2014; 48 (4): 311-316.
13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Съотношението неутрофили-лимфоцити прогнозира тежестта на заболяването и резултата след процедури на долните крайници. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.
14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Повишеното съотношение неутрофили-лимфоцити предсказва смъртност след планова ендоваскуларна корекция на аневризма. J Vasc Surg. 2020; 72 (1): 129-137.
15. King AH, Kim AH, Kwan S, et al. Повишеното съотношение неутрофили към лимфоцити е свързано с по-лоши резултати след каротидна ендартеректомия при асимптоматични пациенти. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.
16. King AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Повишеното съотношение неутрофили към лимфоцити е свързано с намалена преживяемост без ампутация след феморопоплитеална перкутанна реваскуларизация. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.
17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Едновременно изброяване на ракови и имунни клетъчни типове от масивни данни за експресия на туморен ген. Елайф. 2017; 6: e26476.
18. Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Диференциален анализ на експресия на ген и транскрипт на RNA-seq експерименти с TopHat и копчета за ръкавели. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.
19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Специфични за клетъчен тип профили на генна експресия на левкоцити в човешка периферна кръв. BMC Genomics. 2006;7:115.
20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL, et al. Фактор XII и uPAR повишават функциите на неутрофилите, за да повлияят на заздравяването на рани. J Clin Invest. 2018; 128 (3): 944-959.
21. Dunkelberger JR, Song WC. Комплементът и неговата роля във вродените и адаптивни имунни отговори. Cell Res. 2010;20(1):34-50.
22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Комплемент при атеросклероза: приятел или враг? J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.
23. Jia Y, Wen W, Yang Y и др. Клиничната роля на комбинирания серумен C1q и hsCRP при прогнозиране на коронарна артериална болест. Clin Biochem. 2021;93:50-58.
24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Активността на серумния комплемент C1q е свързана с обструктивна коронарна артериална болест. Front Cardiovasc Med. 2021; 8: 618173.
25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. Полезността на комплемента C1q за прогнозиране на 10-годишна смъртност при мъже със захарен диабет, насочени за коронарна ангиография. Am J Cardiol. 2018; 122 (1): 33-38.
26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM, et al. Съотношението неутрофили-лимфоцити и инцидентни атеросклеротични събития: анализи от пет съвременни рандомизирани проучвания. Eur Heart J. 2021; 42 (9): 896-903.
