[6]-Gingerol улеснява секрецията на CXCL8 и производството на ROS в първичните човешки неутрофили чрез насочване към канала TRPV1, част 1

1. Въведение

Идентифицирането на хранителни съставки с имуномодулиращи свойства заедно с техните съответни молекулярни цели привлече повишен интерес през последните години. Поради тяхното голямо лигандно разнообразие, преходното рецепторно потенциално суперсемейство от йонни канали (TRP канали) представлява много интересен клас потенциални целеви структури.

Молекулярната мишена е специфична молекула, върху която лекарството действа в тялото. Имунитетът се отнася до силата на способността на организма да устои на болестта.

Съществува тясна връзка между молекулярните цели и имунитета. Ефектите на лекарствата често засягат имунитета на организма. Например, някои лекарства могат да лекуват определени хронични заболявания чрез намеса във функцията на имунната система на организма. В допълнение, лечението на тумори често използва таргетна терапия, тоест насочване към определени молекулярни мишени за атака на раковите клетки, като по този начин се подобрява способността на имунитета да се бори с раковите клетки.

В допълнение, силата на имунитета също ще повлияе на ефекта на лекарствата. Хората с отслабена имунна система могат да получат странични ефекти или по-малко ефективни лекарства, когато се използват, тъй като имунната система не абсорбира добре лекарствата, което води до по-малко ефективно лечение. Следователно поддържането на здрава имунна система е много важно за лекарствената терапия.

В заключение, съществува тясна връзка между молекулярните цели и имунитета и пълното разбиране на тази връзка е от голямо значение за рационалното използване на лекарства. Трябва активно да подобряваме имунитета си, да използваме лекарствата правилно според съветите на лекаря и да подобряваме имунитета чрез таргетна терапия, за да защитим по-добре здравето си. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета си. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като Cistanche има и антивирусни и противоракови ефекти, което може да засили способността на имунната система да се бори и да подобри имунитета на организма.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

Суперсемейството на TRP каналите на бозайниците включва шест свързани протеинови семейства, а именно анкирин (TRPA), каноничен (TRPC), меластатин (TRPM), муколипин (TRPML), полицистин (TRPP) и семейство ванилоид (TRPV), всички от които обикновено споделят шест трансмембранни сегмента, които се събират като тетрамери, за да образуват катион-пропускливи пори с различна катионна селективност.[1] Каналът TRPV1 може да бъде най-интензивно изследваният член на суперсемейството на TRP. TRPV1 първоначално е идентифициран като рецептор за капсаицин, лютият компонент на лютите чушки.[2] По-късно беше доказано, че лютивите съставки на джинджифила, гингеролите, активират TRPV1.[3]

Биологичната роля на TRPV1 в не-невронни клетъчни типове все още е обект на задълбочено изследване, но наличните резултати предполагат функции далеч отвъд сетивното и топлинното възприятие. Например, 12-седмична интервенция с дневна доза от 0.15 mg от агониста на TRPV1 нонивамид, структурен аналог на капсаицин, предотвратява индуцираното от диетата натрупване на телесна мазнина и повишава плазмения серотонин нива при здрави субекти с наднормено тегло.[4]

В 3T3-L1 адипоцитите активирането на TRPV1 от нонивамид намалява натрупването на липиди по време на диференциация и съзряване чрез потискане на експресията на PPAR𝛾 [5]. В макрофагите капсаицинът и нонивамидът намаляват LPS-индуцираното освобождаване на провъзпалителни цитокини като IL6, CXCL8 и TNF-алфа, по TRPV1-зависим начин.[6] Въпреки това, специфичните функции на TRPV1 в левкоцитите на човешката кръв остават неясни. В човешки NK клетки, 10 и 50 μM капсаицин индуцира повишаване на вътреклетъчните Ca2 плюс концентрации, което показва функционален TRPV1 канал [7].

Въпреки това, потиснатите ефекторни функции на NK клетки като цитотоксична дегранулация и секреция на цитокини, предизвикани от предварително третиране на клетките с капсаицин за 1 час в концентрационен диапазон от 1 0–100 μM, са до голяма степен независими от TRPV1 [7]. ] В Т-клетките е документирано, че TRPV1 участва в процесите на сигнализиране на Т-клетъчния рецептор, Т-клетъчна пролиферация и диференциация, както и производството на цитокини [8]. Предишна работа от нашата група също демонстрира функционална експресия на TRPV1 в човешки първични Т клетки.[9] Освен това, анализите доза-отговор в концентрации, вариращи от 0,03 до 300 μmol L-1, разкриват, че [6]-гингеролът инхибира секрецията на цитокини от първичните човешки левкоцити с IC50 стойност от 82,2 μmol L-1.

Въпреки това, количественото определяне на [6]-гингерол в плазмени проби на здрави индивиди разкрива средна максимална плазмена концентрация от само 42.0 ± 16,3 nmol L−1 след прием на 1 L чай от джинджифил. Тъй като тези концентрации на [6]-гингерол не са имали значително влияние върху секрецията на цитокини в предишни проучвания [9], не е ясно дали диетична релевантна концентрация от 50 nmol L-1, достигната в кръвната плазма след консумация на 1 L джинджифил чай, е достатъчен за модулиране на клетъчните имунни отговори в други човешки първични левкоцити.

За човешките неутрофили познанията за функционалната роля на TRPV1 са ограничени. Докато Köse и Nazıroglu˘ [10] показаха Са2 плюс -потоци в неутрофилите в отговор на 10 μM капсаицин, които трябва да бъдат намалени от TRPV1 антагониста капсазепин, други резултати не показват, че капсаицинът индуцира Са2 плюс приток, когато се тества в диапазон на концентрация от 1 –100 μM, въпреки откриваема експресия на TRPV1 РНК.[11]

Неутрофилите са най-разпространените левкоцити в човешката кръв, представляващи 60-70 процента от всички циркулиращи бели кръвни клетки. Те са първите имунни клетки, които се набират към местата на инфекцията; затова те често се наричат ​​първа линия на защита.[12] Набирането на неутрофили се задейства, наред с други, бактериален или получен от митохондрии пептид N-формилметионин-левцил-фенилаланин (fMLF) или хемокини като CXCL8 (IL-8).[13]

Защитните механизми на неутрофилите включват фагоцитоза [14], освобождаване на антимикробни ензими чрез дегранулация [15] генериране на реактивни кислородни видове (ROS) [16] и образуване на неутрофилни извънклетъчни капани [17]. Освен тези директни защитни механизми, неутрофилите допълнително допринасят за последващите имунни отговори чрез освобождаването на различни цитокини и хемокини.[18] Също така, неутрофилите могат да преминат през процес на подготовка, който им позволява да реагират по-силно на последващо пълно активиране.[16b]

През последните години нараснаха доказателства, че съставките от храна и/или лечебни растения могат да променят един или повече от споменатите защитни реакции на човешките неутрофили. Тези модификации включват повишена фагоцитозна активност [19] и генериране на ROS, [20] увеличен хемотаксис към fMLF [21] и образуване на неутрофилни извънклетъчни капани [20]. Въпреки това, активното(ите) съединение(я) не са идентифицирани. Съставки от Ferula akitschkensis (𝛽-пинен, сабинен, 𝛾-терпинен, геранил ацетон и изоборнил ацетат) десенсибилизират неутрофилите към fMLF- и CXCL8- индуцирани Ca2 плюс приток и инхибират fMLF индуциран хемотаксис, при което геранил ацетон- индуцираните ефекти са медиирани чрез TRPV1.[22]

Въз основа на наличните данни, ние предположихме, че лиганд-индуцираното активиране на TRPV1 от [6]-гингерол може да повлияе на общите функции на неутрофилите, или директно, или чрез засилване на отговорите им към активиращи стимули. В обхвата на тази хипотеза, ние по-специално се стремихме да изясним дали проверена хранително значима концентрация е достатъчна за модулиране на клетъчните имунни отговори в човешките първични неутрофили като част от левкоцитната популация. '

Освен това, ние се опитахме да сравним нивата на експресия на РНК на всички членове на TRP суперсемейството на бозайниците в пет от най-изявените клетъчни типове в човешката кръв, за да получим качествен и количествен изчерпателен преглед на експресията на TRP канала в човешки левкоцити.

2. Резултати

2.1. Изобилие и относителни нива на транскрипция на TRP канали в човешки левкоцити

За да се оцени експресията на РНК на TRP канал в кръвни левкоцити, пет от най-известните типове левкоцитни клетки бяха изолирани от кръвта на здрави донори и експресията на РНК на TRP каналите беше анализирана чрез количествена RT-PCR (Фигура 1).

Специфични транскрипти на TRPV, както и семейството на TRPM, бяха открити с високи честоти от 75–100 процента във всички анализирани типове клетки. Средната обща честота, като се вземат предвид всички типове клетки, е 96 процента за семейството на TRPV и 98 процента за семейството на TRPM. Специфичните за TRPC транскрипти са много по-малко изобилни, вариращи от 0 процента в моноцитите, NK клетките, Т клетките и В клетките до 100 процента в NK клетките и Т клетките с обща средна честота от само 53 процента (Фигура 1А). TRPC5-специфичният транскрипт е открит само в неутрофили с честота от 70 процента.

Освен това TRPA{0}}специфичният транскрипт като цяло разкрива доста ниско изобилие в анализираните типове клетки с честота 100 процента в неутрофилите, 25 процента в моноцитите, 80 процента в NK клетките, 100 процента в Т клетките и 60 процента в В клетките. По същия начин специфичният транскрипт на TRPML3- показва ниска честота в неутрофили (50 процента), моноцити (25 процента), NK клетки (40 процента) и В клетки (20 процента), но честота от 100 процента в Т клетки. Специфичният транскрипт на TRPV1- е открит във всички типове клетки, като показва честота от 100 процента в моноцитите, NK клетките и Т клетките и честота от 90 процента в неутрофилите и 80 процента в В клетките.

По отношение на относителната експресия на РНК, в сравнение със съответните честоти, TRP каналите разкриха по-специфичен за клетъчния тип модел на експресия, както се вижда от сравнението на съответните стойности на Δct в различните анализирани типове клетки (Фигура 1B). Например, TRPP3 беше открит с честота от 100 процента във всички типове клетки, но разкри най-високото ниво на експресия в моноцитите.

За разлика от това, каналът TRPV2 беше открит във всички изследвани типове клетки, със сравнително високо ниво на експресия на РНК, както и висока честота. По същия начин нивата на транскрипт на TRPV1 са сходни във всички изследвани типове клетки (Фигура 1B).

2.2. TRPV1 повърхностна експресия върху неутрофили

Настоящите познания за функцията на TRPV1 в човешките неутрофили все още не са ясни. За по-нататъшно изследване на ролите на TRPV1 в човешките неутрофили, ние след това проучихме дали TRPV1 каналът се експресира на повърхността на първичните човешки неутрофили, използвайки цитометрия на живия клетъчен поток (Фигура 2).

Изолираните неутрофили се оцветяват за CD15 като повърхностен маркер за неутрофили (Фигура 2А, В) и едновременно с това или се оцветяват с антитяло, повдигнато срещу епитоп в първата екстрацелуларна бримка на протеина TRPV1 (Фигура 2В), или съответния изотип контрол, последното служи като сурогат за измерване на неспецифичното свързване (Фигура 2А). В рамките на CD15 плюс популацията беше анализиран интензитетът на флуоресценция за FITC. Оцветяването на неутрофилите с TRPV1 антитялото доведе до различим флуоресцентен сигнал в сравнение с контролата на изотипа, като по този начин потвърди повърхностната експресия на TRPV1 в първичните човешки неутрофили (Фигура 2C). Анализирането на неутрофили от четири отделни донора разкрива сравнима повърхностна експресия на TRPV1 (Фигура 2D).

2.3. [6]-индуцирано от гингерол увеличение на вътреклетъчния Ca2 плюс

Тъй като лиганд-индуцираното активиране на TRPV1 ще доведе до приток на Ca2 plus, [23] вътреклетъчните Ca2 plus концентрации на неутрофили се определят чрез Ca2 plus -чувствителното багрило Fura-2. Въз основа на нашите предишни констатации [9] бяха избрани концентрация от 50 nM от добре познатия TRPV1 лиганд [6]-гингерол и време на инкубация от 2 часа. Анализите показват, че инкубацията на неутрофили с 50 nM [6]-гингерол води до повишени вътреклетъчни Ca2 плюс концентрации, които са средно 18,4 процента ± 1,0 процента от максималната стойност, както е определено чрез прилагане на 1 μM от йонофорния йономицин. Увеличението, предизвикано от DMSO, беше 4,7 процента ± 1,2 процента (Фигура 3).

2.4. Влияние на [6]-гингерол върху експресията на TRPV1

След това имахме за цел да анализираме въздействието на TRPV1 стимулация от [6]-гингерол върху експресията на TRPV1 на ниво транскрипт чрез q-RTPCR, както и на нивото на повърхностния протеин чрез оцветяване на живи клетки. За тази цел човешките неутрофили се инкубират с 50 nM [6]-гингерол за 2 часа и съответните нива на експресия се определят количествено.

Тази 2-часова инкубация не повлия нито на транскрипта на TRPV1, нито на протеиновите нива (Фигура 4) и също така не промени, с изключение на IL6, IL17A, IL24, C5 и GDF5, РНК експресията на изследваните обикновени цитокинови и хемокинови гени (Фигура S1, Таблица S2, Подкрепяща информация).

2.5. Влияние на [6]-гингерол върху експресията на неутрофилни повърхностни маркери

В този набор от експерименти ние попитахме дали [6]-гингеролът оказва влияние върху експресията на общи повърхностни маркери за неутрофили. Установихме, че експресията на маркерите CD11b и CD66b се повишава след 2-часовия инкубационен период с [6]-гингерол в сравнение с контролата на разтворителя, докато CD62L не се повлиява (Фигура 5). Освен това, повърхностната експресия на fMLF рецептора FPR1 беше значително повишена след третиране на клетките с 50 nM [6]-гингерол в сравнение с контролата на разтворителя.

For more information:1950477648nn@gmail.com