Предни таламични ядра: критичен субстрат за непространствена сдвоена асоциирана памет при плъхове, част 2

2|МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1|Животни и условия на настаняване

Мъжки плъхове Long-Evans (на възраст 12 месеца; средно 630 g) бяха настанени в групи от по три или четирима в клетки Makrolon (48 28 22 cm) на обърнат 12-h цикъл светло-тъмно (светлини светват в 8 вечерта) ).

Поведенческите тестове се провеждат в тъмната фаза на светлинния цикъл, пет сесии на седмица; наблюденията потвърждават, че плъховете са относително по-активни по време на тъмната фаза. Плъховете се поддържат при 85% от телесно тегло при свободно хранене с вода ad libitum; храната е ad libitum преди и след операцията за следоперативно възстановяване.

Хирургията е процес на лечение на заболяване и подобряване на физическото здраве. Процесът на възстановяване след операция изисква специално внимание. В допълнение към физическото възстановяване, да се чувствате добре също изисква фокусиране върху възстановяването на паметта. Съществува силна връзка между следоперативното възстановяване и паметта.

По време на операцията фактори като неблагоприятната реакция на тялото и ефектите на анестезиращите лекарства често засягат паметта на мозъка. След като тялото се възстанови, обърнете внимание на поддържането на добра диета, умерени упражнения и достатъчно сън. По време на периода на възстановяване извън болницата трябва да продължите да избягвате прекомерни дейности и да поддържате комфортно състояние на тялото.

В допълнение към жизнените навици, разумните психологически корекции също са полезни за възстановяване на здравето и паметта. Отпуснете се, поддържайте спокоен ум и си помогнете да се адаптирате към възстановяване на паметта. В същото време трябва активно да участвате в развлекателни дейности и да общувате с роднини и приятели, за да поддържате мозъка си активен и да подобрите когнитивните си способности и памет. Тази дейност може постепенно да се увеличава и може да се извършва основно веднъж седмично.

Накратко, процесът на възстановяване след операцията изисква цялостно внимание. Поддържането на добри жизнени навици и психологическите корекции играят много важна роля за насърчаване на физическото възстановяване и възстановяване на паметта. Нека го посрещнем положително, с пълно доверие и надежда. Трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. В допълнение, месото може също да подобри притока на кръв и да насърчи доставката на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

Всички процедури са в съответствие с одобрените насоки от Комитета по етика на животните на Университета в Кентърбъри. Четири групи плъхове бяха установени чрез произволно разпределение след запознаване преди операцията в лабиринта на радиалната ръка (RAM) и пистата. Четирите групи бяха двустранни ATN лезии със или без следа между миризма и предметни стимули, когато бяха обучени в задачата за асоцииране на двойки и съответните две групи с фиктивни лезии.

Окончателните размери на извадката бяха (1) Sham-No Trace=7 (т.е. група Sham-lesion без интервал между стимулите на миризмата и обекта, използвани в задачата за свързване на двойки); (2) Sham-Trace=7 (група Shamlesion, на която е дадена 10-s следа между представянето на миризмата и стимулите на обекта); (3) ATN-No Trace=8; и (4) ATN-Trace=9. Допълнителен плъх с ATN-лезия беше изключен поради неспазване на критериите за лезия (вижте по-долу).

2.2|хирургия

Плъховете бяха анестезирани с изофлуран (индукция 4%; поддържане 2,5%) и поставени в стереотаксичен апарат с атравматични ушни решетки (Kopf, Tujunga, СА). Лентата на резците беше настроена на 7,5 mm под междуушната линия, за да се сведе до минимум увреждането на форникса.

Във всяко полукълбо две инфузии бяха насочени към предно-вентралното ядро ​​(AV; горна и долна) и една инфузия беше насочена към антеромедиалното ядро ​​(AM). Всяка операция използва една пет предно-задни (AP) координати спрямо разстоянието Bregma-Lambda на отделния плъх (всички стойности в mm). За AV лезии AP координатите са: 2,20 за B–L 6,9–7,2; 2,25 за B–L 7,3 до 7,6; 2,30 за B–L По-голямо или равно на 7,7. AV инфузиите бяха направени на 5,68 и 5,73 под дурата и 1,52 латерално спрямо средната линия.

Инфузията на АМ беше направена {{0}}.1 mm по-предно от AV координатата, на 5,76 под дурата и 1,16 латерално; първата лезия на АМ беше направена след завършване на всички AV инфузии и започна контралатерално на последното място на AV лезия. 0.15 М N-метил-d-аспартат (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) в 0.1 М фосфатен буфер (pH 7,20) се влива във всяко място при 0,04 ul на минута чрез 2.5-ulHamilton спринцовка (Reno, NV, USA) с помощта на микроинфузионна помпа (Stoelting, Wood Dale, IL).

AV sitesper хемисферата получи {{0}}.12 и 0.10 ul съответно за дорзалните и вентралните места; 0.06 ul бяха използвани за всяко АМ място. Иглата на спринцовката остава in situ за 3 минути на страна след инфузията.
Хирургичните операции с фиктивни лезии са използвали същата процедура, но иглата е била спусната до 1 mm над горната част на AV и местата на лезия на АМ без прилагане на инфузия.

2.3|Поведенчески задачи

RAM с осем рамена потвърди увреждането на пространствената памет при плъхове с ATN-лезия след операция. Използван е апарат за писта за обучаване на плъховете на всички непространствени задачи, тоест разграничаване на прости миризми и прости обекти и мирис-обект и мирис-следа-обект задачи, свързани с двойки.

Преди операцията, плъхове с ограничен прием на храна бяха привиквани към RAM с осем рамена, описан по-долу, за да извличат 0.1 g шоколадови парчета (Foodfirst LTD Auckland, NZ) и да се адаптират към отварянето и затварянето на вратите на рамото. В червена писта от плексиглас (Фигура 1) плъховете също бяха оформени така, че да забиват носа на 2- cm кръгла бяла пластмасова капачка, която беше на 10 cm над нивото на пода и в центъра на тънка гъба върху прозрачна вложка от плексиглас, която беше прикрепена към крайната стена.

Те също така бяха оформени да изтласкват (използвайки нос или лапа) предмет, закачен на панти в задната част на основата му, към горната част на кладенец за храна, който беше вдлъбнат в центъра на дървен блок с размери 5 8,5 3 cm. Храната съдържаше парчета шоколад (и държеше недостъпна храна под вдлъбнатината). Предметът, използван за предварително обучение, не е използван отново. След операцията възстановилите се плъхове бяха запознати отново както с RAM, така и с пистата.

2.4|Пространствена работна памет в RAM

След операцията пространствената работна памет беше тествана с помощта на RAM, разположена в центъра на стая без прозорци (3 3 m). Лабиринтът имаше боядисана в сиво дървена централна главина с ширина 35 см и осем алуминиеви рамена (65 см дължина и 8,6 см ширина, с граници с височина 4,5 см), повдигнати на 67,5 см над пода на помещението. Прозрачни стени от плексиглас (19 см дължина и 25 см височина), удължени по едната страна на всяко рамо от главината, за да предотвратят прескачането на плъхове между ръцете.

Черно дървено кладенче за храна (5 8,5 3 cm), с недостъпна храна отдолу, беше поставено в края на всяко рамо. По време на тестването 2 0 парчета шоколад присъстваха във всяко гнездо за храна в началото на всяко пробен период. Прозрачните гилотинни врати от Perspex, които можеха да се повдигнат отдолу на главината чрез система от макари, контролираха достъпа до рамената на главината.

Десет последователни дни формално обучение в RAM бяха използвани за тестване на пространствената работна памет. Плъхът беше поставен в централната главина и 10 секунди по-късно всичките осем ръце бяха отворени и на плъха беше позволено да направи избор, дефиниран като двете задни крака над прага на ръката. След като плъхът влезе в ръкав, всички врати бяха затворени и той беше ограничен до ръката за 15 секунди, независимо дали е направил правилен избор.

След това плъхът беше пуснат обратно в централната главина и задържан там за 10 секунди, преди всички врати да бъдат отворени отново, за да се позволи друг избор на ръка. Опитът приключи, когато ратхадът посети всичките осем ръце, бяха направени 20 избора на ръце или бяха изтекли 10 минути.

2.5|Непространствени задачи: просто разграничаване и асоциирано обучение по двойки

Както простата дискриминация, така и задачите за асоцииране на двойки използваха една и съща червена писта от плексиглас (93 26 26 cm), поставена върху маса с височина 75- cm (Фигура 1). Пистата може да бъде разделена от три вертикално подвижни врати (червен Perspex, 26 26 cm), които са избрани въз основа на конкретната поведенческа задача. Що се отнася до запознаването, 6,5 6 8 mm тънка гъба с капачка в центъра държеше награда шоколадова храна (Фигура 1).

Гъбата беше прикрепена към подвижна врата на пистата (за задачите с двойки сътрудници) или крайната стена на пистата (за задачата за проста дискриминация). За всяка миризма беше използвана различна гъба за врата плюс, която беше вливана в съседство с съда с 5 ml слънчогледово масло, смесено с 20 ul субстанция от етерични масла от Нова Зеландия.

Миризмите бяха на лимон и карамфил за задачите на двойки и на канела и лайм за простите задачи за разграничаване или обратното в групите с противовес. Леки и визуално различими предмети (Фигура 1) бяха прикрепени чрез панта в задната част на основата му към горната част на кладенчето за храна, така че плъхът да може лесно да избута обекта назад (или носа, или лапата), за да търси в кладенеца награда за храна.

Дървена рамка (висока 1,8 m от пода и ширина 1,3 m), покрита с черни завеси, затваряше всички страни на тестовата зона, за да намали пространствените сигнали по време на тестването.

Простите разграничения (само миризма; само предмет) и задачите за асоцииране на двойки използваха процедура „отивай/не върви“.

Първият опит за всяка сесия започва със задържане на плъха в стартовата зона за 120 s, за да се аклиматизира отново към лабиринта; следващите опити са използвали 20 s в тази начална зона. Allrats получиха 12 масирани изпитания на дневна сесия, с шест go (наградени) и шест no-gos (ненаградени) изпитания в псевдорандомизиран ред. В рамките на една сесия не са провеждани последователно повече от три изпитания за излизане или три забрана.

Нито една от четирите различни двойки стимули миризма-обект не беше повторена при последователни опити. Правилните елементи в простите задачи за разграничаване и правилните двойки стимули в задачите за свързване на двойки бяха балансирани при плъхове.

За простото разграничаване на миризми отговорът беше дефиниран като бръкване на носа в капачката в центъра на ароматизираната гъба; само подушването на гъбата се смяташе за забранена реакция. Храната винаги присъстваше в капачката в центъра на гъбата за задачите за свързване на мирис-сдвоен обект; аспектът тръгване/нетръгване тук се отнася до това дали обектът е бил бутнат, за да разкрие дали под него е имало награда за храна в края на пистата.

За обектите отговорът се определя като всяко натискане с нос или лапа, което накланя обекта назад. Закъснението от времето, когато последната врата е била повдигната и когато плъхът е взаимодействал с миризмата (пъхване на носа в капачката; за просто разпознаване на миризми) или с обекта (избутано назад на пантата, за просто разпознаване на обекти и задачи за свързване на двойки) е измерено с помощта на тих хронометър (Дик Смит, Нова Зеландия).

Наблюдателят беше седнал между завесите и в близост до пистата, за да управлява вратите и да записва поведението. Опитът е определен като „правилен“, ако плъхът е реагирал за по-малко от 8 s при опити в движение или не е реагирал преди 8 s при опити без движение.

2.6|Обикновени дискриминации

Половината от плъховете бяха обучени в простата задача за разграничаване на миризми, последвана от простата дискриминация на предмети и обратно за другата половина. Закъснението между врата X (Фигура 1а) и взаимодействието с миризмата или обекта в края на пистата беше записано. Плъховете бяха обучени на проста задача за разграничаване на миризми и прости предмети, докато достигнаха критерия (80% правилни за 2 последователни дни).

За простата задача за разграничаване на миризми, една единствена миризма беше представена при всеки опит. Ратът трябваше да разграничи коя от двете миризми е съчетана с награда за храна, представена в гъбата в края на отделение B (Фигура 1а).

В простата задача за разграничаване на обекти, единичен обект беше представен при всеки опит в края на отделение B (не е показано на фигура 1). Therat трябваше да научи кой от двата обекта е съчетан с награда за храна, представена под обекта.

2.7|Задачи за асоцииране на двойки (проследяване и без проследяване) Тези задачи използваха ново оформление на вертикално подвижни врати (Фигура 1). Плъховете научиха коя от двете двойки миризма-обект ще бъде възнаградена (напр. Миризма 1 + Обект A и Миризма 2 + Обект B) и кои двойки не са възнаградени (т.е. Миризма 1 + Обект B и Миризма 2 + Обект А).

Независимо от чифтосването, плъховете винаги са получавали награда за представянето на миризмата, когато са допуснати във второто отделение на пистата. Това е отделение C за състоянието „без следи“, при което отделение A не е използвано, а отделение B е началното отделение. Миризмата беше в края на отделение B за състоянието на „следи“, за което отделение A беше използвано като начална кутия.

Плъховете в състояние на проследяване бяха подложени на 10-s забавяне между представянето на миризмата и стимулите на обекта, като бяха държани в отделение C, докато плъховете в състояние без следи бяха изложени на обекта веднага след взаимодействието им с миризмата (след изяждане на наградата). И в условията на следи, и в условия без следи, записахме забавяне за преминаване на отделение D от момента, в който DoorZ беше вдигната, докато плъхът взаимодейства с обекта или се въздържа от взаимодействие с него за 8 секунди.

Две групи плъхове (Sham-lesion и ATN-lesion) бяха обучени на мирис-следи-асоциирани задачи (групи без следи), а две съответни групи бяха обучени на миризма-следа-обект сдвоени асоциирани задачи (Trace groups), докато не достигнат критерий (80% правилни опити за 3 дни) или максимум 50 дни.

2.8|Тест за задържане след придобиване

Запазване на задачата за свързване на чифтове за всеки плъх беше проведено 5 дни след достигане на критерия или след 50 дни обучение. Тази сесия използва 12 масови възнаградени/ненаградени изпитания за един ден по идентичен начин, използван преди това за този плъх.

2.9|Хистология

2.9.1|Перфузия и събиране на тъкан

През 3-те дни преди теста за задържане, единични плъхове бяха запознати с празна чиста клетка за 90 минути в тъмна тиха стая. Непосредствено след последния опит в теста за задържане, плъхът беше поставен в клетката си в познатата тъмна тиха стая 90 минути преди перфузия.

Плъховете бяха дълбоко анестезирани с натриев пентобарбитал (125 mg/kg) и перфузирани транскардиално с физиологичен разтвор, последван от параформалдехид [4% PFA в 0.1 М фосфатен буфер (PB)] за фиксиране на мозъка. Мозъците се фиксират след това в 4% PFA, последвано от минимум 48 часа в дълготраен разтвор (20% глицерол в 0.1 М PB). Короналните 40-μm срезове бяха събрани с помощта на микротом за замразяване (Thermo Fisher, UK) и съхранени в разтвор на криопротектор (30% глицерол, 30% етилен гликол в 0,1 М PB) при 20 °C, докато се обработят за имунохистохимия.

Короналните срезове бяха събрани в две отделни серии. Първата серия заснема последователни срезове в пет криовиала за имунохистохимия (т.е. един на всеки пет). Тази серия включва преден блок от секции от префронталния кортекс до септалната област (приблизително {{0}}.7 до 0,6 mm от Bregma) и заден блок от медиодорзалния таламус (приблизително 3,5 mm от Bregma) до каудалния ретроспленална кора.

Втората серия заснема последователни секции за проверка на лезията. Тези срезове бяха събрани в четири криовиала от непосредствено предната част на ATN до задния медиодорзален таламус (приблизително 0.6 до 3,5 mm от Bregma).

2.9.2|Neu-N оцветяване и ATN-верификация на лезии

Свободно плаващи срезове в цялата ATN област бяха промити (3 10 минути) в 0.1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор с Triton-X (0,2%; PBSTx) преди инкубиране в ендогенен пероксидазен блокиращ буфер за 30 min [1% водороден пероксид (H2O2), 50% метанол (CH3OH) в 2%PBSTx].

Срезовете се инкубират за една нощ при 4°C inanti-NeuN първично антитяло (1:5000; моноклонално-MouseCat# MAB377; Millipore, California USA) в PBSTx с 1% нормален кози серум (NGS; Life Technologies, NZ).

Излишният буфер на антитялото беше отстранен с PBSTx и последван от инкубиране в биотинилирано козе анти-мише вторично антитяло (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories, California USA) за една нощ при 4°C в PBSTx и 1% NGS. Срезовете се поставят в ExtrAvidin (конюгиран с пероксидаза; 1: 1000; Sigma, NSW Australia), PBSTx и 1% NGS за 2 часа при стайна температура.

За да се отстранят излишните ExtrAvidin и Triton X{{0}}, срезовете се промиват в PBS, PB и след това Tris буфер (pH 7,4 в дестилиран H20), за да се подготвят срезовете за визуализация с прясно приготвен диаминобензидин ( DAB 0,05%; Sigma, в 0,01% H2O2 в Tris буфер).

DAB реакцията (приблизително 5 минути) се спира с помощта на Tris буфер (1 10 минути промиване) и срезовете се поставят в PB при 4°С за една нощ преди да се монтират върху желатинизирани слайдове и се оставят да изсъхнат. Слайдовете бяха дехидратирани чрез алкохол (70%–100%), преди да бъдат изчистени в ксилен и монтирани с DPX (06522; Sigma-Aldrich) и покривно стъкло.

Броят на Neu-N-позитивните клетки в ATN беше използван за определяне на степента на лезията. Това използва секции както от лявото, така и от дясното полукълбо за всеки един от четири40- μm секции в цялата ATN и площта, количествено определена с помощта на ImageJ (NIH, САЩ). Оцветяването на NeuN-позитивни клетки беше фотографирано при 5 обектива на LeicaDM6 B изправен микроскоп и DFC7000T камера (Leica Microsystems, Германия).

Автоматичното преброяване на клетките беше получено чрез ImageJ (софтуер за анализ на изображения, Национален здравен институт, NIH, САЩ). Областта около невроните в областта ATN беше избрана ръчно и изображенията бяха преобразувани в {{0}}битова скала на сивото, фонът беше изваден (въртящ се=40), преобразуван в маска и беше приложена функцията за водораздел, и всички невронални клетки над прага (праг на „максимална ентропия“, кръгова стойност 0.5–1.0) бяха преброени.

Прагът на откриване беше един и същ за всички секции. Автоматизирани NeuN-оцветени ядра от клетки бяха преброени в девет от фалшивите плъхове (пет в групата с фалшиво проследяване и четири в групата с фалшиво проследяване), за да се изразят броя на клетките в ATN.

Автоматичното преброяване на NeuN-оцветени ядра на пощадени клетки във всички плъхове с ATN-лезия се сравнява спрямо средния брой на NeuN клетки, наблюдавани при фалшивите плъхове. Приемливите лезии се определят като достигане на критерия за 50% загуба на клетки в ATN, с минимум 25% на хемисфера. Това е в съответствие с критериите за ATN-лезия в предишни проучвания (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perryet al., 2018).

2.9.3|Zif268 имунохистохимия

Свободно плаващи срезове се обработват по подобен начин както за NeuN, но се инкубират в заешко поликлонално първично антитяло Zif268 (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, САЩ) за 72 часа при 4°C в PBSTx с 1%NGS, последвано от инкубиране в биотинилирано козе антизаешко вторично антитяло (1:1000: Vector LaboratoriesBA-1000) за една нощ в PBSTx и 1% NGS.

След DAB визуализация (18 минути), Zif268-положително клетъчно оцветяване във всяка област от интерес беше фотографирано с 10 обектив със светлинен микроскоп (Leica, Германия). Автоматичното преброяване на клетките беше получено чрез ImageJ ( NIH, САЩ) по същия начин като NeuNпозитивните клетки, с изключение на това, че кръговостта е зададена на 0.65–1.0.

Броят на Zif268-позитивните клетки за всички региони използва един и същ прагов алгоритъм, с между две и шест секции на интересен регион във всеки количествено определен плъх. Беше използван среден брой Zif268-положителни клетки на mm2 в секции (от двете полукълба) в рамките на региона, който представлява интерес.

2.10|Анализ на данни

Беше проведен ANOVA с помощта на Statistica (v13; Dell Inc.), за да се тестват средните разлики между четирите групи плъхове (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace и ATNTrace). Факторите за повтарящи се измервания бяха добавени за дни (RAM и проста дискриминация), блокове от изпитания (сдвоени задачи) и преброяване на Zif268 в свързани региони или подрегиони, представляващи интерес.

ANOVA както за задачите за RAM, така и за задачите за проста дискриминация сравнява четири групи, за да потвърди, че двете групи с фиктивни лезии и двете групи с лезии ATN са съвместими една с друга, но имайте предвид, че няма компонент за проследяване в задачите за RAM или проста дискриминация. Както за обикновена дискриминация, така и за задачи на сдвоени сътрудници на пистата, беше използвана реципрочна трансформация на данните за латентност в отделни опити, за да се осигури хомогенност на дисперсията.

Във всеки даден тестов ден трансформираните закъснения генерират средно закъснение за всяко от шестте ненаградени изпитвания и шестте наградени изпитвания. За простите задачи за разграничаване анализирахме средния резултат за разликата в латентността (средната стойност на възнаградените изпитания минус средната стойност на ненаградените изпитания), но не и наградените и ненаградените изпитания поотделно поради повреда в съхранението на данни.

И трите мерки за латентност бяха налични за задачите на паметта с двойка асоциирани (ненаградени опити, наградени опити и разлика в латентността). За да отчетем множество сравнения и да балансираме грешките от тип I и тип II, ние използвахме нивото на значимост p < 0.02 за поведенчески анализи, тъй като имаше три свързани мерки в задачата за асоциирани двойки (ненаградени опити, наградени опити и средна разлика в латентността).

Имаше шест първични анализа за области от интерес за Zif268 експресия, така че значимостта в тези анализи беше определена на p < 0.01. Posthoc Newman-Keuls (NK) тестове оценяват груповите различия по двойки. Използван е прост анализ на основните ефекти, когато е имало значителни взаимодействия, включващи фактори на повтарящи се измервания.

3|РЕЗУЛТАТИ

3.1|Проверка на лезията

Всички с изключение на един от 18-те плъха с ATN лезии отговарят на априорния критерий от 50% двустранно увреждане на ATN и минимум 25% на хемисфера. Средното двустранно увреждане е 76% в двете групи ATN-лезии (диапазон: ATN-No Trace, 61%–93%; ATN-Trace, 63%–93%; Фигура 2). Изключеният плъх има задоволителна лезия само в едно полукълбо (общо 48%, 75% ляво и 20% дясно).

Фигура 2d показва, че броят на NeuN за ATN неврони при плъхове с ATN-лезия (M=3388, SD=2024) е доста под стойностите, открити при плъхове с фалшива лезия (M=15, 339, SD=1065; този брой беше подобен на този, докладван от Frost et al., 2020). Осем от 17-те плъхове с лезия (четири в групата с проследяване и четири в групата без проследяване) нямат увреждане нито на медиодорзалния таламус (MD), нито на реюнионните/ромбовидните (Re/Rh) ядра и има сравнително малко увреждане на тези структури в останалите девет плъха с лезии.

Когато е настъпило увреждане на MD, то е било в предните аспекти, които лежат в съседство с ATN. И така, увреждането на MD беше оценено от приблизително {{0}}.72 до +2.10 mm от Bregma, където варираше от 0% до 41% загуба на клетки в цялото група (медиана=21%). Когато възникне увреждане на Re/Rh, то също е в съседство с ATN региона, така че е оценено приблизително на 1,08 до 2,04 mm от Bregma, където варира от 0% до 33% (медиана=6%). Обърнете внимание, че тези стойности на процент нараняване не представляват пълните MD и Re/Rh региони, тъй като задните области на двете ядра са непокътнати при всички плъхове с ATN-лезия.

For more information:1950477648nn@gmail.com