Калпастатин предотвратява ангиотензин II-медиирано увреждане на подоцитите чрез поддържане на автофагия

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Имане Бенсаада^1,3, Блейз Робин^1,3, Жоел Перес², Ян Салемкур¹, Анна Чипонт¹, Марин Камю¹, Матилд Лемоан¹, Леа Гийоне¹, He´le`ne Lazareth¹, Еманюел Летаверние², Карол Хеник¹, Пиер-Луи Таро¹и Оливия Леноар¹

¹Université de Paris, PARCC, Inserm, Париж, Франция; и²Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Париж, Франция

Силната прогностична стойност на протеинурията при хронични гломерулни заболявания е твърдо установена, както и патогенната роля на ангиотензин II, насърчаващ прогресирането на гломерулна болест с променена гломерулна фи-филтрационна бариера, увреждане на подоцитите и белези на гломерулите. Тук открихме, че хроничната индуцирана от ангиотензин II хипертония се инхибираавтофагияефлукс в миши гломерули. Делецията на Atg5 (ген, кодиращ протеин, включващ аутофагия) конкретно в подоцита води до ускорена индуцирана от дангио тензин II подоцитопатия, подчертана албуминурия и гломерулосклероза. Това показва, че автофагията е ключов защитен механизъм в подоцита в това състояние. Индуцираната от ангиотензин-II активност на калпаин в подоцитите инхибираавтофагияизтичане. Подоцити от мишки с трансгенна експресия на ендогенния инхибитор на калпаинкалпастатинпоказан по-висок подоцитавтофагияна изходно ниво, което е резистентно към ангиотензин II-зависимо инхибиране. Също така, продължителна автофагия скалпастатинограничено увреждане на подоцитите и албуминурия. Тези открития предполагат, че хипертонията има патогенни ефекти върху гломерулната структура и функция, отчасти чрез активиране на калпаини, водещи до блокада на подоцитната аутофагия. Тези открития разкриват оригинален механизъм, чрез който медиираната от ангиотензин II хипертония инхибира автофагията чрез индуцирано от калций набиране на калпаин с патогенни последици в случай на дисбаланс откалпастатиндейност. По този начин, предотвратявайки медиирано от калпаин намаляване наавтофагияможе да бъде обещаваща нова терапевтична стратегия за нефропатии, свързани с висока активност на системата ренин-ангиотензин.

КЛЮЧОВИ ДУМИ: ангиотензин II;автофагия; калпастатин; хипертония; подоцит

Преводна декларация

Като се има предвид решаващата роля на автофагията в развитието набъбрекзаболявания, фармакологична модулация наавтофагияможе да бъде обещаваща стратегия за превенция и лечение на няколкобъбрекзаболявания. Успоредно с това беше установено, че свръхактивирането на активността на калпаин в подоцитите има вредно въздействие върху функцията на подоцитите, докато неговите вредни механизми на действие не са идентифицирани. Тук ние предоставяме доказателства, че калпаинът свързва вредното действие на ангиотензин II с вредното блокиране наавтофагияв подоцитите и предполагат, че инхибирането на калпаин може да бъде обещаваща терапевтична цел за заболявания на подоцитите, частично чрез поддържане на автофагия на подоцитите.

Кликнете, за даCistanche deserticola ma за хронично бъбречно заболяване

Хипертонията е на второ място след диабета като водеща причина за прогресираща хроничнабъбрекзаболяване1–3 и дори умерено повишаване на кръвното налягане е независим рисков фактор за краен стадий на бъбречно заболяване.4 Все по-голям брой експериментални проучвания подчертават важността на подоцитите в развитието набъбрекнараняване. Прогресивната загуба на подоцити и микроваскуларните промени се появяват рано с функционалния бъбречен спад при експериментална хипертонична нефропатия.5 При пациенти е доказано, че отделянето на жизнеспособни подоцити в урината е чувствителен и специфичен маркер за прееклампсия,6,7 и пациентите с нефросклероза са имали значително по-ниска плътност на гломерулните подоцити, отколкото имашебъбрекдонори.8,9 Освен това, патогенната роля на ангиотензин II (AngII) за насърчаване на прогресирането на гломерулна болест е добре установена, не само при хипертонични състояния, но и при няколко гломерулни заболявания.10-21

Гломерулната хипертония води до разтягане на гломерулни капиляри, ендотелно увреждане и повишена гломерулна протеинова филтрация, причинявайки гломерулен колапс и гломерулосклероза. Той също така упражнява пряко действие върху гломерулните структури, предизвиквайки сигнални регулаторни реакции, насочени към компенсиране. Активираната системна и локална ренин-ангиотензин-алдостеронова система (RAAS) насърчава мезангиалната хиперплазия и синтеза на фактори на васкуларния пермеабилитет. Едновременно с това, подоцитите показват калциева сигнализация 22, 23 и променят формата си при AngII тип 1 рецептор (AT1)-зависима стимулация. 24-28 Тези адаптивни механизми стават неадаптивни в дългосрочен план, което накрая води до гломерулосклероза. AT1 медиира значително участие на RAAS за кръвно налягане и хомеостаза на сол и вода. Инхибиторите на ангиотензин-конвертиращия ензим и блокерите на АТ1 се използват клинично за лечение на хипертония и сърдечна недостатъчност при пациенти. Интересното е, че и двата блокера показват защитен ефект върхубъбрекфункция.

Доказано е, че автофагията е от съществено значение за поддържането на клетъчната хомеостаза, особено в постмитотичните клетки 29, 30 и особено в подоцитите. 31–34Автофагияе свързана с лизозома система за разграждане на дълготрайни цитоплазмени протеини и дисфункционални органели 35, 36 и включва секвестрация на протеини и органели в автофагозоми. Образуването на автофагозоми зависи от индукцията на няколко гена, включително Map1lc3a/b, Beclin 1 и Tags. 37 Има все повече доказателства, че дисрегулацията на автофагичния път е замесена в патогенезата на стареенето на бъбреците и няколкобъбрекзаболявания като остро бъбречно увреждане, поликистоза на бъбреците, стареене и диабетна нефропатия.31,32,38–41

Регулиране наавтофагияв подоцитите, физиологичен и преди всичко в патологичен контекст, не е добре известен. Наскоро демонстрирахме, че аутофагията на подоцитите е независима от механистичната цел на регулацията на рапамицин (mTOR) при физиологични условия, което прави този клетъчен тип изключение.42 Активирането на AT1 стимулира протеиновия синтез и протеиновия оборот в клетките. По този начин ние аргументирахме, че активирането на RAAS може също да повлияе на стимулирането на протеиновия обмен и протеостазата.

В настоящото изследване ние се фокусирахме върху ролята на AngII сигнализирането в подоцитаавтофагиярегулиране. Ние идентифицирахме калциево-активираните протеази калпаини, медииращи хроничен блокиращ ефект на AngII върху подоцитаавтофагия. Освен това открихме, че ендогенният инхибитор на калпаинкалпастатине в състояние да предотврати AngII-зависимо инхибиране на аутофагия и увреждане на подоцитите по време на хипертония.

Тези открития разкриват оригинален механизъм, чрез който AngII-медиираната хипертония инхибираавтофагиячрез индуцирано от калций набиране на калпаин с патогенни последици в случай на дисбаланс от активността на калпастатин.

МЕТОДИ

Животни

Калпастатинтрансгенни (CSTTg) мишки бяха любезно предоставени от д-р Е. Letavernier.43 Мишки с подоцит-специфично разрушаване на гена Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) бяха генерирани, както беше описано по-горе31 чрез кръстосване на Nphs2.cre мишки44 с Atg5lox/lox мишки45 на фона на C57BL6/J. В това проучване са използвани мишки Nphs2.cre Atg5lox/lox и контролни мъжки от едно котило на възраст от 10 до 12 седмици. Хипертоничният модел беше индуциран чрез подкожно вливане на AngII (Sigma-Aldrich, A9525) в доза от 1 mg/kg/min за 4 до 6 седмици чрез осмотични минипомпи (Alzet Corp, модел 2006). Помпи бяха имплантирани подкожно на гърба между лопатките и бедрата. Мишките получават солна добавка (3 процента NaCl) в храната. Atg5lox/lox (див тип [WT]) мишки бяха използвани като контроли във всички проучвания. За солта на дезоксикортикостерон ацетат (DOCA) с модела на редукция на нефрона, възрастни мъжки мишки са подложени на едностранна лява нефректомия. Две седмици след нефректомията те получиха пелети DOC с 21--дневно освобождаване (Innovative Research of America), имплантирани подкожно. Втора пелета беше имплантирана 3 седмици след първия имплант. Всички мишки получиха 0,9 процента NaCl в питейна вода ad libitum и бяха убити след 6 седмици на прилагане на DOC.46 Експериментите бяха проведени съгласно френските ветеринарни указания и тези, формулирани от Европейската общност за експериментална употреба върху животни (L358-86/ 609EEC) и са одобрени от френското Министерство на научните изследвания и комитета по етика на местните университетски изследвания (APAFIS-7646 и -22373).

Експеримент с първична подоцитна култура

Диференцирани първични подоцити се култивират, както е описано по-горе.47,48 Накратко, прясно изолираният бъбречен кортекс се смесва и усвоява от колагеназа I (Gibco, 17100-017) в Мемориалния институт на Розуел Парк 1640 (Life Technologies, 61870-044). След това тъканите се прекарват през 70 mm и 40 mm клетъчни цедки (BD Falcon, 352340 и 352350). Гломерулите, които прилепват към 40 mm клетъчна цедка, се отстраняват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0,5 процента говежди серумен албумин (Eurobio, HALALB07-65), инжектирани под налягане и след това се промиват два пъти в PBS. Прясно изолирани гломерули се поставят в 6-ямкови панички в Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036), допълнени с 10 процента фетален телешки серум и 1 процент пеницилин/стрептомицин (Life Technologies, 15140122), за да се позволи на подоцитите да излязат от гломерулите и растат. Обогатяването на подоцитите беше потвърдено чрез Western blot анализ, както е описано по-рано 31, 48, 49 (допълнителна фигура S1). Подоцитите се култивират в отсъствие или присъствие на бафиломицин А1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) в продължение на 4 часа. За експерименти с имунофлуоресценция, първичните подоцити се поставят върху етикети на 4 блюда (Dutcher, 055071). След това подоцитите се фиксират в параформалдехид 4% за 10 минути и се обработват за имунофлуоресценция.

Тест за активност на калпаин

Вътреклетъчната активност на калпаин се определя в първични подоцити, както беше описано по-горе.50-52 Общо 100000 клетки бяха култивирани в 24-ямки за тъканни култури в Roswell Park Memorial Institute 1640, допълнени с 10 процента фетален телешки серум и 1% пеницилин/стрептомицин. След посочения период на култивиране средата се заменя с разтвор на Krebs-Ringer HEPES бикарбонат (KRH) (рН 7,4), съдържащ 4 mM CaCl2, със или без 10 mM инхибитор на калпаин -1, и се инкубира за 10 минути преди добавянето от 50 mM калпаинов субстрат N-сукцинил-Leu-Leu-Val-Tyr-7-амино-4-метил кумарин (Sigma-Aldrich, S6510). След 90-минутен инкубационен период активността на калпаин се определя като разликата между FL флуоресценцията (измерена при 360 nm възбуждане и 430 nm емисия) със и без инхибитор на калпаин-1.

Western blot

Първичните подоцити бяха надраскани с 80 ml буфер за радиоимунопреципитационен анализ, съдържащ фосфатаза и протеазен инхибитор. Концентрацията на протеин се измерва с BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Двадесет микрограма протеини се подлагат на електрофореза върху готов гел Criterion XT (12 процента Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Протеините бяха прехвърлени към мембрана от поливинилиден дифлуорид (Thermo Fischer Scientific, 88518). След блокиране в 5 процента мляко в трис буферен физиологичен разтвор 0,1 процента Tween (TBS-T), мембраните се инкубират със заешки поликлонални анти-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), заешки поликлонални анти-ATG5 (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), морско свинче поликлонален анти-секвестозома 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), заешки поликлонален анти-калпаинов 1 домен IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), заешки поликлонален анти-калпаин 2 амино-терминален край на домен I (1:1000, Abcam, ab39165), миши моноклонален IgG1 анти-калпаин 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), заек анти подоцин (1:1000, Abcam, ab50339), анти-нефрин от морско свинче (1:500, PROGEN, GP-N2) и моноклонално анти-тубулиново антитяло на плъх (1:5000, Abcam,ab6160). След промиване мембраните се инкубират с антитяло, свързано с пероксидаза от хрян (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Откриването на специфични сигнали се извършва с помощта на ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) на устройство LAS 4000 (Fuji). За количествено определяне беше използван денситометричен анализ със софтуер ImageJ (Национални здравни институти).

Измервания на кръвно налягане и физиологични оценки

Систоличното кръвно налягане на мишки се записва с помощта на метода на маншета на опашката (Visitech Systems Inc., BP-2000). Направени са десет измервания от всяка мишка и след това е определена средна стойност. Систоличното кръвно налягане се измерва в началото (12-седмична възраст) и след това всяка седмица до края на периода на лечение. Всички мишки бяха поставени в метаболитни клетки със свободен достъп до вода за 6--часово събиране на урина. Концентрациите на креатинин в урината и плазмената урея се анализират спектрофотометрично с помощта на колориметричен метод (Olympus, AU400). Екскрецията на албумин в урината се измерва с помощта на специфичен ензимно-свързан имуносорбентен анализ за количествено определяне на албумин в миша урина (Crystal Chem, 80630).

Хистология

Бъбрецибяха събрани и фиксирани в 4 процента PBS-буфериран формалин. Покрити с парафин срезове (3- mm дебелина) бяха оцветени от Masson'strichrome за оценка на морфологията на бъбреците. Аномалиите в бъбреците се класифицират въз основа на наличието и тежестта на компонентните аномалии, включително гломерулосклероза, мезангиална експанзия, тубулна атрофия или отливки и фиброза. Делът на склеротичните гломерули се оценява чрез сляпо изследване на най-малко 50 гломерули набъбрекраздел.

Имунофлуоресцентно оцветяване на бъбречни участъци и първични подоцити

Фиксирани първични подоцити бяха блокирани в TBS-T 3 процента говежди серумен албумин и инкубирани за една нощ при 4 градуса с първични антитела на морско свинче анти-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) и заешки антитела -зелен FL флуоресцентен протеин (GFP; 1:500, Abcam, ab290). След изплаквания с TBS-T, FL флуорофор-конюгирани вторични антитела магарешко анти-заешко IgG AF594-конюгирано антитяло (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) и магарешко анти-заешко IgG AF488-конюгирано антитяло ( Invitrogen, A21206). Изображенията са направени с помощта на флуоресцентен микроскоп Zeiss 2 ft, камера AxioCam HRccamera и софтуер Axiovision 4.3.

За фиксирани във формалин парафинови вградени (FFPE)бъбреци, срезове (3 mm) се депарафинизират и хидратират и се извършва извличане на антиген в загрят цитратен буфер (рН 6). След това срезовете се пермеабилизират с Triton 0.1% (Euromedex) и се блокират в TBS-T 3% говежди серумен албумин преди инкубиране на антитела за една нощ при 4°C. Използвахме кози анти-нефрин (1:100, PROGEN, GP -N2), анти-SQSTM1/P62 на морско свинче (1:1000, PROGEN, GP-62C), заешки анти-GFP (1:1000, Abcam, ab290), кози анти-подокаликсин (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) и заешко анти-тумор на Wilm 1 (WT1; 1:100, Abcam, ab192) антитяло. Вторичните антитела бяха Alexa488– и Alexa 568–конюгирани антитела от Invitrogen. Ядрата се оцветяват в синьо с помощта на Hoechst. Слайдовете бяха монтирани с помощта на флуоресцентна среда за монтаж (Dako, S3023). Микроснимките са направени с фотомикроскоп Zeiss Axiophot и софтуер Axiovision. Полуавтоматичното количествено определяне на Фиджи беше използвано за количествено определяне на нефрин-положителни и PODXLþ области на гломерулен участък върху най-малко 30 гломерула на мишка. Броят на подоцитите се преброява като броя на WT1þ ядрата на гломерулна секция на най-малко 30 гломерула на мишка.

Процедура на трансмисионна електронна микроскопия

Малки парчета от бъбречната кора (1 mm3) се фиксират в 3 процента глутаралдехид (Electron Microscopy Sciences) за 1 до 3 0 дни и се промиват три пъти в PBS. Пробите бяха постфиксирани в 1 процент осмиев тетроксид 0.1 М (Electron Microscopy Science) в 0.1 М PBS (рН 7.4) и промити с вода. Пробите бяха дехидратирани в алкохолни степени и 100 процента пропилей оксид (Electron Microscopy Science). Инфилтрацията на смола се извършва, както следва: смесете Epikote 812 и пропиленов оксид в съотношение 1:1 за 30 минути, последвано от смесване на Epikote 812 и пропилейов оксид в съотношение 1:2 за една нощ при стайна температура. Пробите се поставят в 4 mm желатинови капсули в 100 процента Epikote 812 и се полимеризират в пещ, загрята до 60 °C. Ултратънки срезове се изрязват с UFC7 ултрамикротом (Leica MicrosystemsGmbH) и се отлагат върху Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Те бяха насрещно оцветени с уранил ацетат 7 процента (LFG Distribution) и оловен цитрат на Reynold (LFG). Пробите бяха изследвани в трансмисионния електронен микроскоп JEM1011 (JEOL) с камерата Orius SC1000 CCD (Gatan), работеща със софтуера Digital Micrograph (Gatan) за придобиване.

Cistanche-бъбречно заболяване

Решетка за количествена полимеразна верижна реакция

Прясно изолирани гломерули бяха замразени в реактив QIAzol Lysis (Qiagen) при -80 градуса. Общата екстракция на РНК с помощта на метода на основата на фенол се обработва съгласно препоръките на производителя. cDNA бяха синтезирани с помощта на RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) и полимеразна верижна реакция (PCR) в реално време беше извършена с помощта на Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) с RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Количествените PCR плаки бяха пуснати на Applied Biosystems StepOnePlus cycler. Всеки масив съдържа качествен контрол за ефективност на обратната транскрипция и замърсяване на геномна ДНК. Количественият PCR анализ беше извършен с помощта на 2-DDCT метода с помощта на GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) и изразен като промяна на Log2 пъти в генната експресия.

In silico протеомен анализ

In silico прогнозирането на мястото на разцепване на калпаин беше направено с DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) и CaMPDB (http:// calpain.org/) онлайн инструменти. Аминокиселинната последователност на миши протеин е получена от Uniprot (https://www.uniprot.org). Резултатите са възобновени в допълнителни таблици S1 и S2.

статистически анализи

Всички графики представляват индивидуални стойности и средна стойност±SEM. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуера GraphPad Prism, версия 9. Сравнението между двете групи беше извършено с помощта на параметричен t-тест на Стюдент, когато пробите преминаха тестовете за нормалност на Anderson-Darling и D'Agostino и F теста за равенство на дисперсията. В противен случай е използван непараметричен тест на Ман-Уитни. Сравнението между множество групи беше извършено с помощта на 1-way или 2-way анализ на дисперсията, последван от тест за множествено сравнение с корекцията на Simak. Стойностите на P < 0.05="" се="" считат="" за="" значими.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

Фигура 1|Индуцираната от ангиотензин II (AngII) D диета с високо съдържание на сол (HSD) хипертония инхибира гломерулнатаавтофагия. (a-c) Имунофлуоресценция на Podocalyxin (PODXL; червено) и P62 (зелено) в гломерули (a,a0) от див тип (WT) мишки, (b,b0) от WT мишки след 6 седмици AngII þ HSD и (c,c0) от Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки, показващи натрупването на P62 в подоцити по време на хипертония и в подоцит-специфичен ATG{{1{{12 }}}}мишки с дефицит. Върховете на стрелките показват P62þ точки в WT в (a0). Ядрата бяха насрещно оцветени с Hoechst (синьо). Подчастите на фигурата със заглавие показват по-голямо увеличение. Барове=50 mm. (d) Свързано количествено определяне на площта на P62þ, изразено като процент от гломерулната област. n=4 WT мишки и n=5 WT с AngII þ HSD, и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Тест на Ман-Уитни: *P=0.0159. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.бъбрек-international.org.

РЕЗУЛТАТИ

Индуцираната от диета с високо съдържание на сол AngII D хипертония инхибира автофагията на подоцитите

Подоцитите представят високо ниво наавтофагияin vivo , както е показано от силна GFP експресия в трансгенни мишки с GFP сливане с LC3 (GFP-LC3 мишки), ключов маркер на автофагия (допълнителна фигура S2A). Автофагията е динамичен процес с постоянно образуване на автофагозоми и разграждане на автофаголизозоми. Блокирането на автофагозомното разграждане с хлорохин доведе до натрупване на GFPþ точки, което показва висок автофагичен ефлукс в подоцитите (допълнителни фигури S2A и B). Потвърждението, че GFPþ точките са автофагозоми, беше показано чрез двойна имуно-FL флуоресценция за GFP и SQSTM1/P62, протеин на шаперон, разграден отавтофагия(Допълнителна фигура S2C и D). Отново, лечението с хлорохин индуцира натрупването на GFPþ P62þ точки, демонстрирайки важен автофагичен ефлукс в подоцитите. И накрая, висок автофагичен ефлукс се запазва in vitro, както е показано от експресията на GFP и P62 в първични подоцити, изолирани от GFP-LC3 мишки и силно натрупване на GFPþ и P62þ точки при лечение с бафиломицин А1, друг блокер на автофагозомно разграждане (допълнителна фигура S2E-H) .

Капацитетът на хипертонията да модулира автофагичните отговори на подоцитите след това беше оценен при мишки, вливани с AngII с диета с високо съдържание на сол (HSD) в продължение на 6 седмици и при нехипертензивни контроли. Както е показано на фигура 1, AngII þ HSD индуцира натрупване на P62 в гломерулите със силно натрупване в подоцитите, което предполага, че AngII þ HSD е отговорен за подоцититеавтофагияблокада (Фигура 1a–d). Интересно е, че натрупването на P62 в подоцитите е подобно на наблюдаваното при мишки с дефицит на подоцитна аутофагия (Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки). В друг модел на хипертония, моделът DOC-сол, ние също наблюдавахме прогресивно натрупване на P62 в подоцитите по време на протичане на заболяването (допълнителна фигура S3).

Делецията на Atg5 специално в подоцитите води до повишена албуминурия, загуба на подоцити и гломерулно увреждане в AngII D HSD модела

След това проверихме далиавтофагияблокадата само в подоцитите (Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки) засяга гломерулното увреждане в AngII þ HSD модела. Първо потвърдихме, че Nphs2. cre Atg5lox/lox мишки имаха нормално кръвно налягане, нормалнобъбрекфункция и никакви гломерулни хистологични лезии до 10-месечна възраст, както беше съобщено по-рано (допълнителна фигура S4).32 След това Atg5lox/lox (WT) и Nphs2. cre Atg5lox/lox мишки се вливат с AngII с HSD в продължение на 6 седмици. Важно е, че систоличното кръвно налягане е сходно в 2-те групи след инфузия на AngII по време на проучването (Фигура 2а), въпреки че методът на маншета на опашката, използван за измерване на кръвното налягане, може да няма способността да разрешава малки разлики в кръвното налягане. AngII инфузия с HSD значително повишава съотношението албумин към креатинин в урината при WT мишки и този ефект допълнително се увеличава значително при Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки (Фигура 2b). Хипертонични Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки също показват значително повишена гломерулна склероза в сравнение с WT котила (Фигура 2c–e). В съответствие с измерената протеинурия, протеиновите отливки и тубулната дилатация са значително по-разпространени при мишки с подоцитен дефицит в ATG5 (Фигура 2f-h).

Фигура 2|Делецията на Atg5 специално в подоцитите води до значително увеличение на албуминурията,бъбрекнараняване и загуба на подоцити след 6 седмици инфузия на ангиотензин II (AngII) D диета с високо съдържание на сол (HSD). ( а ) Систолично кръвно налягане в Atg5lox/lox и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки по време на 36 дни на AngII þ HSD. n=9 мишки на генотип. Стойностите са представени като средно±SEM. Двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA): ns. В (b–m), n=10 мишки на генотип. В (b,g,h,k) стойностите са представени като отделни графики и средна стойност±SEM. (b) AngII þ HSD (продължение)

Фигура 2|(продължение) доведе до драматично повишаване на албуминурията в Nphs2. cre Atg5lox/lox мишки в сравнение с Atg5lox/lox контролни мишки. Двупосочен ANOVA: генотип, P=0.013; време, P=0.0018. (c–f) Представителни изображения на оцветени с трихром секции на гломерули на Masson от Atg5lox/lox контрол и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки след 6 седмици AngII þ HSD. Барове=50 mm в (c,d). Барове=100 mm в (e,f). (g,h) Сравнение (g) на дела на склеротичните гломерули и (h) на броя на тубулните отливки на микроскопско поле. Тест на Ман-Уитни: **P=0.0026 in (h), ***P=0.0003 in (g). (i,j) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на тумор на Wilm's 1 (WT1; червено) и подокаликсин (PODXL; зелено) в гломерули от Atg5lox/lox контрол и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки след AngII þ HSD за 6 седмици. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Барове=50 mm. ( k ) Количествено определяне на броя WT1þ клетки на гломерулен участък. Тест на Ман-Уитни: **P=0.0029 in (l,m). Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на CD44 (зелено) в гломерули от Atg5lox/lox контрола и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки след AngII þ HSD за 6 седмици. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Барове=50 mm. (n,o) Представителни трансмисионни електронни микроскопски фотомикрографии на участъци от гломерули от Atg5lox/lox контрол и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки след AngII þ HSD за 6 седмици, показващи изтриване на процес на подоцитно краче (стрелки) при хипертоничен Nphs2. cre Atg5lox/lox мишки. Барове=1 mm. n=3 мишки на генотип. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.kidney-international.org.

Фигура 3|Експресия и активност на калпаин в подоцитите. (a) Western blot анализ на експресията на калпаин-1, калпаин-2 и калпаин-4 в първични подоцити. Експресията на тубулин служи за нормализиране. (b) Активността на калпаин се измерва върху първични подоцити, третирани или нетретирани с ангиотензин II (AngII; 100 nM) в продължение на 24 часа със или без калпептин (10 mM). n=5 независими експеримента. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA): лечение, P=0.0035. Тест за множествено сравнение на Sidak: *P=0.0128 за AngII спрямо изходното ниво, ##P=0.0056 за AngII þ калпептин спрямо AngII. ( c ) Активността на калпаин се измерва върху първични подоцити от див тип (WT) иликалпастатинтрансгенни (CSTTg) мишки, третирани или нетретирани с AngII (100 nM) за 24 часа. n=7 независими експеримента. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Двупосочен ANOVA, сдвоен за лечение: генотип, P=0.0483. Тест за множествено сравнение на Sidak: ***P=0.0009 за WT AngII спрямо базовата линия, *P=0.0420 за CSTTg AngII спрямо базовата линия, #P=0.0424 за WT спрямо CSTTg AngII. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.бъбрек-international.org.

Броят на подоцитите на гломерул е значително намален в Nphs2. cre Atg5lox/lox мишки, третирани с AngII þ HSD (Фигура 2i–k). Увреждането на подоцитите при Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки с AngII инфузия þ HSD дори прогресира до фокална и сегментна гломерулосклероза, както се вижда от експресията на маркера за активиране на париеталните епителни клетки (PEC) CD44 в гломерулите (Фигура 2l и m). Анализът с електронен микроскоп идентифицира значителни промени, свързани с дефицит на ATG5 при хронична инфузия на AngII с HSD, включително изтриване на процеса на стъпалото при хипертоничен Nphs2. cre Atg5lox/lox мишки. Обратно, малко ултраструктурни дефекти бяха открити в подоцити от WT мишки дори след 10 седмици на AngII инфузия с HSD (Фигура 2n и o), което показва, че автофагичната активност на подоцитите е необходима за тяхната резистентност към AngII þ HSD-индуцирано увреждане. Като цяло нашите резултати показват, че в модела AngII þ HSD,автофагияинхибирането влошава увреждането и загубата на подоцити и индуцира последваща фокална и сегментна гломерулосклероза.

AngII D HSD активира активността на калпаин в подоцитите, което допринася за блокадата на автофагията

Тъй като беше установено, че активността на калпаин (i) се активира от AngII в няколко типа клетки и (ii) разцепва няколкоавтофагия-свързани протеини, 53 се чудехме дали AngII þ HSD– медиираната блокада на автофагия може да се дължи на повишена индуцирана от AngII активност на калпаин. Първо открихме, че първичните подоцити експресират 3-те повсеместни форми на калпаини (Фигура 3а). След това показахме, че AngII стимулира активността на калпаин в първичните подоцити. Това повишаване на активността на калпаин беше блокирано от селективен инхибитор на калпаин (Фигура 3b). Използвахме мишка за удар с допкалпастатинтрансгенна експресия (водеща до намалена активност на калпаин)43 за оценка на ролята на калпаините в AngII þ HSD-медииранбъбрекнараняване и блокада на автофагията. Първичните подоцити от CSTTg мишки показват намалена активност на калпаин в отговор на AngII в сравнение с подоцити от контролни мишки (Фигура 3с). По този начин,калпастатинсвръхекспресията в подоцитите намалява AngII-медиираното активиране на калпаин.

След това оценихмеавтофагиянива в подоцити от CSTTg мишки. Ние генерирахме CSTTg мишки с GFP-LC3 трансген. LC3-GFP репортер позволява преброяване на автофагозоми като GFPþ/P62þ точки. P62 ще се натрупва в агрегати в клетките, когато автофагичният ефлукс е блокиран. В базалното състояние преброихме по-малко GFPþ P62þ точки (Фигура 4a, b и e) и по-малко натрупване на P62 (Фигура 4c, d и f) в подоцитите на CSTTg GFP-LC3 мишки, отколкото в подоцитите на нормалните GFP-LC3 мишки , което предполага повишен автофагичен ефлукс в подоцити на мишки с високо изобилие на калпастатин.

Фигура 4|Оценка на автофагичния ефлукс в подоцитите накалпастатинтрансгенни (CSTTg) мишки. (a, b) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на зелен FL флуоресцентен протеин (GFP) (зелен) и P62 (червен) в гломерули от 12-седмични GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки. Върховете на стрелките показват GFPþ P62þ автофагозоми. (c, d) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на P62 (зелено) и Podocalyxin (PODXL; червено) в гломерули от 12-седмични GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки. Подчастите на фигурата със заглавие показват по-голямо увеличение. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Барове=50 mm. (д) Количествено определяне на броя LC3þ P62þ точки на подоцит. Тест на Ман-Уитни: **P= 0.0065. (f) Количествено определяне на P62þ площ за гломерулен участък. Тест на Ман-Уитни: *P=0.0420. В (e,f), n=5 GFP-LC3 мишки и n=8 CSTTg GFP-LC3 мишки. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.бъбрек-international.org.

Автофагичният ефлукс може да се наблюдава чрез измерване на превръщането на цитоплазмената форма на LC3, LC3-I, в автофагозомно разцепената и свързана с фосфатидилетаноламин форма на LC3, LC3-II, върху Western blot . Подоцитите от CSTTg мишки показват повишена конверсия на LC3-I в LC3-II и намалена експресия на P62, както в присъствието, така и в отсъствието на бафиломицин А1 (Фигура 5а и b), което показва повишен автофагичен ефлукс в подоцити със свръхекспресия на калпастатин. И накрая, натрупването на GFPþ P62þ точки в подоцитите след прилагане на хлорохин е по-важно при CSTTg GFP-LC3 мишки, отколкото при GFP-LC3 мишки, като по този начин потвърждава, чекалпастатинсвръхекспресията индуцира автофагичен ефлукс в подоцитите in vivo (Фигура 5c–e). Като цяло нашите данни предполагат, че AngII стимулира активността на калпаин в подоцитите, т.еавтофагиясе инхибира от калпаин в подоцитите и че инхибирането на ендогенната активност на калпаин чрез свръхекспресия на калпастатин е достатъчно за стимулиране на автофагичен ефлукс в подоцитите.

CSTTg мишки са защитени от AngII D HSD-индуцирано увреждане на подоцитите

CSTTg мишки не показват никаквибъбрекпромяна до най-малко 12-месечна възраст (допълнителна фигура S5). Ние анализирахме увреждане на подоцитите при CSTTg мишки по време на лечение с AngII þ HSD. Въпреки че WT мишките развиха лека гломерулосклероза и увреждане на подоцитите след 4 седмици хипертония, както се вижда от анормална експресия на подокаликсин и нефрин, CSTTg мишки представиха по-малко склеротични гломерулни лезии (Фигура 6а и b) и запазена експресия на подокаликсин и нефрин (Фигура 6c-h) . Такива разлики във фенотипа на подоцитите се наблюдават на етап, при който плътността на ядрата на подоцитите не се различава между WT и хипертонични CSTTg мишки (Фигура 6i–k).

Фигура 5|Блокирането на автофагозомното разграждане потвърждава повишен автофагичен излив на подоцити вкалпастатинтрансгенни (CSTTg) мишки. ( а ) Western blot анализ на експресията на LC3, секвестозома 1 (SQSTM1)/P62 и ATG5 в първични подоцити от див тип (WT) или CSTTg мишки. Експресията на тубулин служи за нормализиране. Подоцитите се третират или не се третират с бафиломицин А1 (BafA1; 100 nM) в продължение на 4 часа преди спиране на културата. (b) Количествено определяне на съотношенията LC{{10}}II/тубулин и P62/тубулин. n=10 WT мишки и n=8 CSTTg мишки. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Двупосочен анализ на дисперсията, сдвоен за лечение: за LC3-II/тубулин: генотип, P=0.{{30}}008; лечение, P <0.0001; за="" p62/тубулин:="" генотип,="" p="0.0884;" лечение,="" p=""><0.0001. тест="" за="" множествено="" сравнение="" на="" sidak:="" за="" lc3-ii/тубулин:="" ***p="">< 0,0001="" за="" wt="" плюс="" bafa1="" спрямо="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" за="" csttg="" плюс="" bafa1="" спрямо="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" за="" wt="" þ="" bafa1="" спрямо="" csttg="" þ="" bafa1;="" за="" p62/тубулин:="" ***p=""><0,0001 за="" wt="" плюс="" bafa1="" спрямо="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p=""><0,0001 за="" csttg="" плюс="" bafa1="" спрямо="" csttg="" þ="" bafa1.="" (c,="" d)="" представителни="" имунофлуоресцентни="" изображения="" на="" експресията="" на="" зелен="" fl="" флуоресцентен="" протеин="" (gfp;="" зелен)="" и="" p62="" (червен)="" в="" гломерули="" от="" 12-="" седмични="" gfp-lc3="" и="" csttg="" gfp-lc3="" мишки.="" подчастите="" на="" фигурата="" със="" заглавие="" показват="" по-голямо="" увеличение.="" ядрата="" се="" оцветяват="" с="" hoechst="" (синьо).="" барове="50" mm.="" мишките="" бяха="" третирани="" с="" хлорохин="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" часа="" преди="" умъртвяването.="" върховете="" на="" стрелките="" показват="" gfpþ="" p62þ="" автофагозоми.="" (д)="" количествено="" определяне="" на="" броя="" lc3þ="" p62þ="" точки="" на="" подоцит.="" n="5" мишки="" на="" генотип.="" стойностите="" са="" представени="" като="" отделни="" графики="" и="">±SEM. Несдвоен t-тест с равно SD: *P=0.0302. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.бъбрек-international.org.

Фигура 6 |Калпастатинсвръхекспресията предотвратява ангиотензин II (AngII) D диета с високо съдържание на сол (HSD) – медиирано увреждане на подоцитите. ( a, b ) Представителни изображения на оцветени с трихром секции на Masson от гломерули от див тип (WT) и калпастатин трансгенни (CSTTg) мишки след 6 седмици AngII þ HSD. Барове=50 mm. (c,d,f,g) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на (c,d) Podocalyxin (PODXL) и (f,g) нефрин (NPHS1) в WT и CSTTg мишки след 6 седмици AngII þ HSD и (e ,h) свързани количествени характеристики. Барове=50 mm. (i,j) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на тумор на Wilm's 1 (WT1; зелен) и PODXL (червен) в гломерули от WT и CSTTg мишки след 6 седмици AngII þ HSD и (k) свързано количествено определяне на броя на WT1 þ клетки на гломерулен участък. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Барове=50 mm. В (e,h,k) стойностите са представени като отделни графики и средна стойност±SEM. n=9 WT мишки и n=7 CSTTg мишки. Несдвоен t-тест с равно SD: **P=0.0095 in (e), *P=0.0249 in (h), P=0.7891 in (k). За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.бъбрек-international.org.

По подобен начин, след 6 седмици хипертония, GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки представиха увреждане на подоцитите, но лезиите бяха по-забележими при GFP-LC3 мишки (Фигура 7). Съотношението албумин към креатинин в урината е по-високо при GFP-LC3 мишки след 4 седмици AngII þ HSD (Фигура 7а). Броят на подоцитите не се различава между двата генотипа, но експресията на нефрин е значително по-намалена при GFP-LC3 (контролни) мишки (Фигура 7b–e). Корелирайки скалпастатин-медиирана защита, ултраструктурният анализ показа леко и фокално изтриване на процесите на крака на подоцитите при GFP-LC3 мишки, третирани с AngII þ HSD с по-добро запазване на изтриването на процесите на крака при CSTTg мишки, въпреки че глобалното количествено определяне на броя на процесите на крака на гломерулна основа дължината на мембраната (GBM) не е статистически различна, най-вероятно защото увреждането на подоцитите е фокално и сегментно в нашия модел (Фигура 7f-h). Трябва да се отбележи, че макрофагите и Т-лимфоцитната инфилтрация вбъбрецине се различават между групите (допълнителна фигура S6). Взети заедно, тези резултати показват товакалпастатинпредотврати AngII þ HSD-индуцирано увреждане на подоцитите.

Свръхекспресията на калпастатин възстановява автофагичния ефлукс в подоцити от мишки след лечение с AngII D HSD

Накрая се зачудихме даликалпастатин-медиирана гломерулна защита в AngII þ HSD модела включва поддържане на автофагия в подоцитите. Интересно е, че индуцираното от AngII þ HSD натрупване на P62 в подоцитите е предотвратено при CSTTg и GFP-LC3 CSTTg мишки (Фигура 8a-d), което показва, че калпастатинът предотвратява блокадата на подоцититеавтофагия. Трябва да се отбележи, че броят на GFPþ P62þ точки, маркирани на автофагозоми, е сходен в подоцити от хипертензивни GFP-LC3 и GFP-LC3 CSTTg мишки, което предполага, че AngII þ HSD индуцира забавяне на автофагичния ефлукс на подоцитите, а не пълно спиране (Фигура 8e– g).

In silico прогнозиране на мястото на разцепване на калпаин в подоцитни протеини

Използвахме няколко инструмента in silico, за да предвидим потенциални мишени на калпаин в подоцитите (допълнителни таблици S1 и S2). Бяха сравнени три онлайн бази данни: GPS-CCD, 54 CaMPDB, 55 и DeepCalpain. 56 Анализът в силико идентифицира няколко подоцитни протеина, сред тях нефрин и подоцин, които могат да бъдат разцепени от калпаини. По този начин,калпастатин-медиираната гломерулна защита може да бъде свързана с намаляване на ензимната активност на калпаин, което води до намалено разграждане на някои подоцитни протеини.

Освен това най-малко 3автофагия-свързаните протеини са директни мишени на калпаините. ATG5 се разцепва от калпаини, което води до смущение в образуването на ATG12-ATG5 комплекс.57,58 Прилагането на инхибитори на калпаин in vivo също предотвратява разцепването на автофагичния протеин Beclin-1.59 In silico анализ на предполагаемото място на разцепване на протеини, свързани с автофагия, подкрепя хипотезата, че калпаинът може да регулира автофагията чрез ензимно разцепване на протеини на автофагия.

Cistanche-бъбречна функция

mRNA експресия на ендоплазмен ретикулум (ER) и маркери за оксидативен стрес в гломерули от мишки, третирани с AngII плюс HSD

Ние оценихме стреса на ендоплазмения ретикулум (ER) и оксидативния стрес чрез количествена PCR в гломерули по време на лечение с AngII þ HSD (Таблица 1). На изходно ниво не наблюдавахме никаква промяна в експресията на иРНК на анализираните гени в гломерулите от WT и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки (допълнителна фигура S7). След 6 седмици хипертония, гломерули от Nphs2. cre Atg5lox/lox мишки показаха различен mRNA профил на гени на пътищата на ER стрес и оксидативен стрес с повишена експресия на Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 и Hsp90b1 в сравнение с WT гломерули, което предполага, чеавтофагияизчерпването на подоцитите благоприятства AngII þ HSD-индуциран ER стрес и оксидативен стрес. Обратно, гломерули от CSTTg мишки показват понижена регулация на няколко гена на пътищата на ER стрес и оксидативен стрес, както и намалена експресия на някои проапоптотични гени (Фигура 9).

Взети заедно, тези резултати показват товакалпастатинсвръхекспресията може да предотврати увреждане на гломерула чрез намаляване на AngII þ HSD-индуцирана ER и оксидативен стрес.

ДИСКУСИЯ

В настоящото проучване ние демонстрирахме, че при AngII þ HSD-индуцирана хипертония, автофагията на подоцитите е значително понижена. Освен това, мишки с подоцит-специфична делеция на Atg5 са по-склонни към AngII þ HSD-индуцирана гломерулосклероза и загуба на подоцити, като по този начин показват, чеавтофагияв подоцитите предотвратява развитието на хипертонична нефропатия, подчертавайки критичната роля на аутофагията при AngII þ HSD-индуцирано увреждане на подоцитите. Малко се знае за извънклетъчните стимули, които регулират клетъчната аутофагия, и тези резултати хвърлят светлина върху патофизиологичната регулация на подоцитната аутофагия от AngII.

При повечето гломерулопатии при хора изтриването на израстъка на подоцитното краче е отличителен белег на гломерулно увреждане, водещо до протеинурия. Автофагията вероятно ще играе съществена роля в поддържането на функцията на подоцитите, тъй като тези терминално диференцирани клетки показват високи нива наавтофагиядори и при липса на стрес. Предишно проучване показа, че AngII насърчава аутофагията чрез генериране на реактивни кислородни видове в условно обезсмъртена клетъчна линия от миши подоцити. неясен. За разлика от това последно изследване, ние използвахме миши първично култивирани подоцити, запазващи експресията на подоцин и нефрин и in vivo подходи, а не миши клетъчни линии. Потвърждаваме предишни доклади, че постмитотичните подоцити показват необичайно високо ниво на конститутивноставтофагия. Измерването на повишеното количество LC3-II след стимулация с AngII в присъствието или отсъствието на лизозомни инхибитори е необходимо, за да се определи дали автофагичният ефлукс е увеличен или блокиран. Предишни проучвания са пренебрегнали този феномен.60

Фигура 7 |Калпастатинсвръхекспресията предотвратява ангиотензин II (AngII) D диета с високо съдържание на сол (HSD) – медиирано увреждане на подоцити в зелен FL флуоресцентен протеин (GFP) – LC3 мишки. ( а ) AngII þ HSD води до драматично повишаване на албуминурията при GFP-LC3 мишки в сравнение с CSTTg (калпастатин трансгенни) GFP-LC3 мишки. n=8 до 13 мишки на генотип. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Двупосочен дисперсионен анализ: генотип, P=0.0429; време, P=0.0165. Тест за множествено сравнение на Sidak: *P=0.0453 за GFP-LC3 срещу CSTTg GFP-LC3 мишки на ден 28. (b,c) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на тумор на Wilm's 1 (WT1; зелен) и нефрин (NPHS1) (червен) в гломерули от 18-седмични GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки след 6 седмици инфузия на AngII þ HSD. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Барове=50 mm. Количествено определяне на (d) NPHS1þ площ на гломерулна секция и (e) броя на WT1þ клетки на гломерулна секция в 18-седмични GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки след 6 седмици инфузия на AngII þ HSD. n=19 GFP-LC3 мишки и n=25 CSTTg GFP-LC3 мишки. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Несдвоен t-тест с еднакво SD: **P=0.0010 in (d), P= 0.1158 in (e). ( f, g ) Трансмисионни електронни микроскопски изображения на гломерули от GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки след 6 седмици AngII þ HSD. Върховете на стрелките показват изтриване на процеса на крака. Барове=1 mm. ( з ) Количествено определяне на броя на процесите на стъпалото на микрометър от гломерулната базална мембрана (GBM). n=3 мишки на генотип. Стойностите са представени като индивидуални графики и означават SEM. Всеки график представлява средния брой подоцити на микрометър GBM на 1 непрекъсната дължина на GBM. Несдвоен t-тест с равно SD: P=0.7512. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.бъбрек-international.org.

Тук използвахме хипертоничен модел, базиран на AngII перфузия и HSD. Подоцитите проявяват AT1 рецептори и са изложени на свободно филтрирани пептиди като AngII.13,16,26,61–65 Предполага се, че наблюдаваните ренопротективни ефекти на инхибирането на RAAS могат да се дължат – поне частично – на блокада на този подоцит- специфичен RAAS. По същия начин, in vivo проучвания потвърждават ефекта на AngII върху увреждането на подоцитите и подоцит-специфичното генно насочване на AT1 демонстрира, че активирането на AT1 рецепторите в гломерула при експериментален лупусен нефрит е достатъчно за ускоряване набъбрекувреждане при липса на хипертония.66,67 Калпаин-медииранавтофагиядисрегулацията в нашия модел може да бъде свързана с директно сигнализиране на AngII-AT1 върху подоцитите или да бъде следствие от хипертония. Можем да дадем ранен отговор на този въпрос. Наистина, в модела на DOC-сол, ние също открихме натрупване на P62 в подоцити от хипертонични мишки (допълнителна фигура S3). Това предполага, че блокадата на аутофагията възниква в подоцитите в този модел, който се предполага, че е независим от AngII.68 По-нататъшни проучвания, оценяващи увреждането на подоцитите, отнасящо се до активността на калпаин и автофагичния ефлукс при мишки с дефицит на AT1 в подоцитите селективно, ще бъдат необходими, за да се очертае дали такава регулация на подоцитната аутофагия зависи от преки или косвени ефекти на AngII.

Фигура 8 |Калпастатинсвръхекспресията предотвратява индуцираната от ангиотензин II (AngII) D диета с високо съдържание на сол (HSD)автофагиярегулиране надолу в подоцитите. ( a, b ) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на P62 (зелен) и Podocalyxin (PODXL; червен) в гломерули от зелен FL флуоресцентен протеин (GFP) – LC3 и CSTTg (калпастатинтрансгенни) GFP-LC3 мишки след 6 седмици AngII þ HSD. Подчастите на фигурата със заглавие показват по-голямо увеличение. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Барове=50 mm. ( c, d ) Количествено определяне на P62þ площ на гломерулен участък. n=9 мишки от див тип (WT) и n=7 CSTTg мишки в (c), и n=16 GFP-LC3 мишки и n=16 CSTTg GFP-LC3 мишки в (d). Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Тест на Ман-Уитни: **P=0.0033 в (c), **P=0.0011 в (d). ( e, f ) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на GFP (зелено) и P62 (червено) в гломерули от GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки след 6 седмици AngII þ HSD. Подчастите на фигурата със заглавие показват по-голямо увеличение. Върховете на стрелките показват GFPþ P62þ автофагозоми. (g) Количествено определяне на броя LC3þ P62þ точки на подоцит. n=11 GFP-LC3 мишки и n=16 CSTTg GFP-LC3 мишки. Стойностите са представени като индивидуални диаграми и средна ±SEM. Несдвоен t-тест с равно SD: P=0.1014. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.бъбрек-international.org.

Таблица 1|Персонализиран RT2 Profiler PCR масив

Калпаин-1 и калпаин-2 са повсеместно разпространени провъзпалителни протеази, чиято активност се контролира откалпастатин, техен специфичен инхибитор. Наистина, калпастатин селективно инхибира калпаините и никакви други протеази до момента. Активирането на Calpain наскоро беше свързано сбъбрекнараняване в няколко патологични контекста.69,70 Установено е, че преходният потенциален канал на преходния рецептор на калциевия канал C6 активира калпаин-1 в подоцитите чрез активиране на Ca2þ/калциневрин. Бъбреците на пациенти с фокална и сегментна гломерулосклероза са имали повишена експресия на преходен рецепторен потенциален канал C6, повишена активност на калпаин и калциневрин и намалена експресия на калпаиновия целеви талин-1, който е критичен за стабилността на цитоскелета на подоцитите.71 Преходен рецепторен потенциален канал C6 също се свързва директно с калпаин-1 и калпаин-2. Това взаимодействие е от решаващо значение за регулирането на разцепването на талин-1 и контрола на подвижността на подоцитите.72

Трансгенни мишки свръхекспресиякалпастатинса защитени срещу съдово ремоделиране и AngII-зависимо възпаление73; срещу възпаление при модели на гломерулонефрит,43 сепсис,74 или отхвърляне на алографта75; и срещу свързано с възрастта възпаление.76 Увреждането на подоцитите при тези мишки не е проучено. Пелтие и др. показа, че свръхекспресията накалпастатинпредотвратява AngII-зависимо периваскуларно възпаление в бъбреците.43 По този начин, бъбречната защита при CSTTg мишки може да бъде медиирана, поне частично, от противовъзпалителен механизъм. Ние оценяваме инфилтрацията на макрофаги и лимфоцити в нашия модел и не открихме значителна разлика вбъбреквъзпаление между CSTTg и контролни мишки при анализ на глобалнобъбреклевкоцитна инфилтрация (допълнителна фигура S6).

Калпаинът беше включен наскоро в регулирането на автофагията (прегледано наскоро в Weber et al.53) с интересни и биозащитни свойства на инхибирането на калпаин в контекста на диабет чрез възстановяване наавтофагия.77 Тук докладвахме, че инхибирането на калпаин чрезкалпастатинсвръхекспресия (i) предотврати увреждане на подоцитите по време на хипертония и (ii) възстанови автофагията в подоцитите, като по този начин подчертава нова вредна роля на активирането на калпаин по време на хипертония чрез инхибиране наавтофагия.

Доказано е, че почти всички ATG протеини се разцепват от калпаини in vitro. 78 Тук постулирахме товаавтофагияподдържането при хипертонични CSTTg мишки се медиира от инхибиране на калпаин. За да подкрепим нашата хипотеза, ние показахме, че подоцитите от CSTTg имат намалена активност на калпаин, когато са предизвикани с AngII in vitro (Фигура 3в). Открихме повишено ниво на ATG5 протеин в подоцити от CSTTg мишки, което предполага, че свръхекспресията на калпастатин предотвратява медиираното от калпаин разцепване на ATG5 в този контекст (Фигура 5а). За разлика от това беше доказано, чекалпастатин-медиираното инхибиране на калпаин може да бъде независимо от инхибирането на тяхната протеазна активност79; по този начин не можем да изключим регулирането на аутофагията от калпастатин, независимо от ензимната активност на калпаин.

В обобщение, тези констатации разкриват непризната досега роля накалпастатинв регулацията на подоцититеавтофагияи предостави водеща роля за изследване на нови терапевтични стратегии за подобряване на преживяемостта на подоцитите по време на хипертонични нефропатии.

РАЗКРИВАНЕ

Всички автори декларираха, че нямат конкуриращи се интереси.

БЛАГОДАРНОСТИ

Тази работа беше подкрепена от Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) и Université de Paris. IB беше подкрепен от стипендия за висше образование от Министерството на националното образование, де ла Recherche et de la Technologie. OL беше финансиран чрез награда на Европейската фондация за изследване на диабета (EFSD), подкрепена от програмата EFSD/Novo Nordisk за изследване на диабета в Европа и грант от Société Francophone duDiabète (SFD). BR и CH бяха финансирани от Starting Grant 107037 от Европейския съвет за научни изследвания и Европейския съюз (P-LT). YS беше подкрепен от стипендия за висше образование от Fondation de France.

Благодарим на Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac и екипа на ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France) за съдействието при грижата и обработката на животните, Nicolas Sorhaindo за биохимичните измервания (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , Париж, Франция) и Alain Schmitt и Jean-Marc Masse за трансмисионна електронна микроскопия (Institut Cochin, Париж, Франция). Благодарим на Morgane Le Gall (Cochin proteomic facility 3P5, Paris, France) за помощ при in silico анализ. Признаваме административната подкрепа от Véronique Oberweis, Bruno Pillard и Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France).

ДОПЪЛНИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

Допълнителен файл (PDF)

Фигура S1. Първичната подоцитна култура експресира подоцитни маркери. Western blot анализ на експресията на подоцитните маркери NPHS1 и NPHS2 в първична подоцитна култура от WT и CSTTg мишки. Тубулин (TUBA) служи като контрол на натоварването. Представител на n=4 мишки за генотип.

Фигура S2. Високото базално ниво на подоцититеавтофагия. (A, B) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на GFP (зелено) и NPHS1 (червено) в гломерули от GFP-LC3 мишки, третирани или не с CQ (8 0 mg/kg) 4 часа преди умъртвяване. Стрелките показват GFPþ автофагозоми. (C, D) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на GFP (зелено) и P62 (червено) в гломерули от GFP-LC3 мишки, третирани или не с CQ (80 mg/kg) 4 часа преди умъртвяване. Стрелките показват GFPþ P62þ автофагозоми. (A–D) (0 ) представляват по-голямо увеличение. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Бар=50 мм. N=4 мишки за състояние (E–H) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на GFP (зелено) и P62 (червено) в първични подоцити от GFP-LC3 мишки, третирани (F, H) или не (E, G ) с бафифиломицин А1 (100 nM) за 4 часа. N=5 мишки за условие.

Фигура S3. P62 се натрупва в подоцитите в DOC-солевия модел на хипертония. (A–C) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на P62 (зелено) и PODXL (червено) в гломерули от WT мишки след 2 до 6 седмици на модел на DOC-сол. (0 ) представляват по-голямо увеличение. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). Ширина ¼ 50 мм. (D) Количествено определяне на площта на P62 за площ на подоцит (процент). N=5–6 мишки за условие. Еднопосочен анализ на дисперсията: време P=0.0059, тест за множествено сравнение на Sidak: D42 срещу D14 **P=0.0055, D28 срещу D14 P=0.8590.

Фигура S4. Подоцитавтофагияе незаменим за развитието на подоцитите. (A) Систолично кръвно налягане, (B) съотношение албумин към креатинин в урината и (C) нива на уреен азот в кръвта при Atg5lox/lox и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки. N=5–6 мишки на генотип. Ценностите са представени като отделни сюжети и средства±SEM. Тест на Ман-Уитни: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) и P=0.6623 (C). (D–E) Представителни изображения на оцветени с трихром секции на гломерули на Masson от мишки Atg5lox/lox и Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F–G) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на PODXL (зелено) и WT1 (червено) в Atg5lox/lox и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки. Ядрата се оцветяват с Hoechst (синьо). (D–G) Бар=50 мм. N=6 мишки на генотип. (H–I) Представителни фотомикрографии на трансмисионни електронни микроскопски секции на гломерули от Atg5lox/lox и Nphs2.cre Atg5lox/lox мишки. Бар=1 mm. N=3 мишки на генотип.

Фигура S5.Калпастатинсвръхекспресията не влияебъбрекфункция на изходно ниво. (A) уреен азот в кръвта и (B) плазмени нива на албумин в 12-седмични GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки. N=5 GFP-LC3 и N=6 CSTTg GFP-LC3. Ценностите са представени като отделни сюжети и средства±SEM. Тест на Ман-Уитни: P=0.6623 (A) и P=0.9307 (B). (C, D) Представителни изображения на оцветени с трихром секции на Masson от гломерули от GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки. (E – H) Представителни имунофлуоресцентни изображения на експресията на PODXL (E, F) и NPHS1 (G, H) в GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки. (C–H) Бар=50 mm. (I, J) Свързано количествено определяне на PODXL и NPHS1 площ на гломерулен участък. N=5 GFP-LC3 и N=6 CSTTg GFP-LC3. Ценностите са представени като отделни сюжети и средства±SEM. Тест на Ман-Уитни: P=0.1898 (A) и P=0.8413 (B).

Cistanche-бъбречна функция

Фигура S6.Калпастатинсвръхекспресията не влияе на глобалното възпаление на бъбреците. Представителна имунохистохимия на експресията на F4/80 (A, B) и CD3 (D–E) в GFP-LC3 и CSTTg GFP-LC3 мишки след 6 седмици ангиотензин II þHSD. Бар=200 мм. (C, F) Свързано количествено определяне на F4/80 и CD3 площ набъбрекраздел. N=7 CSTTg GFP-LC3 и N=8 GFP-LC3 мишки. Стойностите са представени като индивидуални графики и означават SEM. Тест на Ман-Уитни: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).

Фигура S7. Подоцитавтофагияdeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.

Таблица S1. In silico предвиждане на местата на разцепване на калпаин. Местата на разцепване на калпаин бяха предвидени в свързани с подоцити и свързани с автофагия протеини с GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP://calpain.org) и DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. ракбио. info/help.php). Допълнителен файл (Excel)

Допълнителна таблица S2. Пълният файл на in silico prevision на местата на разцепване на калпаин. Местата на разцепване на калпаин бяха предвидени в свързани с подоцити иавтофагия-свързани протеини с GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) и DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Предсказуемите места на разцепване се възобновяват за всеки протеин за GPS-CCD и DeepCalpain Predict.

ПРЕПРАТКИ

1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA, et al. Разпространение на хроничнибъбрекзаболяване в Съединените щати. ДЖАМА. 2007; 298: 2038-2047.

2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, et al. Към кого трябва да бъде насочен скринингът за ХБН? Влияние на диабета, хипертонията и сърдечно-съдовите заболявания. Am J Kidney Dis. 2009; 53: S71–S77.

3. Chang TI, Li S, Chen SC, et al. Рискови фактори за ESRD при лица със запазена изчислена GFR със и без албуминурия: резултати от Програмата за ранна оценка на бъбреците (KEEP). Am J Kidney Dis. 2013; 61: S4–S11.

4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Повишено кръвно налягане и риск от краен стадий на бъбречно заболяване при лица без изходно бъбречно заболяване. Arch Intern Med. 2005; 165: 923-928.

5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, et al. Увреждането на подоцитите е в основата на гломерулопатията при хипертонични плъхове с Dahl сол и се възстановява от блокер на алдостерон. Хипертония. 2006; 47: 1084-1093.

6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. Екскреция на подоцити в урината като маркер за прееклампсия. Am J Obstet Gynecol. 2007; 196, 320.e321–e327.

7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Подоцитурия предхожда протеинурия и клинични характеристики на прееклампсия: надлъжно проспективно проучване. Хипертония. 2013; 61: 1289-1296.

8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, et al. Загуба на подоцити при човешка хипертонична нефросклероза. Am J Hypertens. 2009; 22: 300-306.

9. Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Интраренална експресия на miPHK при пациенти с хипертонична нефросклероза. Am J Hypertens. 2010; 23: 78-84.

10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Хронични протеинурични нефропатии: резултати и отговор на лечението в проспективна група от 352 пациенти с различни модели на бъбречно увреждане. Am J Kidney Dis. 2000; 35: 1155-1165.

11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. Ангиотензин II-зависимата персистираща загуба на подоцити от дестабилизирани гломерули причинява прогресия на краен стадийбъбрекзаболяване. Kidney Int. 2012; 81: 40-55.

12. Tuncdemir M, Ozturk M. Ефектите на ангиотензин-II рецепторните блокери върху увреждането на подоцитите и гломерулната апоптоза при плъх модел на експериментална индуцирана от стрептозотоцин диабетна нефропатия. Acta Histochem. 2011; 113: 826-832.

13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. Ангиотензин II допринася за увреждане на подоцитите чрез увеличаване на експресията на TRPC6 чрез NFAT-медиирана положителна обратна сигнална пътека. Am J Pathol. 2011; 179: 1719–1732.

14. Групата за проучване на EUCLID. Рандомизирано плацебо-контролирано проучване на лизиноприл при нормотензивни пациенти с инсулинозависим диабет и нормоалбуминурия или микроалбуминурия. Ланцет. 1997; 349: 1787–1792.

15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH, et al. Протеинурия, цел за ренопротекция при пациенти с диабетна нефропатия тип 2: уроци от RENTAL. Kidney Int. 2004; 65: 2309-2320.

16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Промените в селективността на гломерулната перма, предизвикана от ангиотензин II, предполагат дисфункция на подоцитите и пренареждане на протеина на диафрагмата. Семин Нефрол. 2004; 24: 131-140.

17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Характеризиране на подтипове рецептори на ангиотензин II в подоцитите. J Lab Clin Med. 2003; 142: 313-321.

18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, et al. Протеинурия и експресията на протеина на подоцитната диафрагма, нефрин, при диабетна нефропатия: ефекти от инхибирането на ангиотензин-конвертиращия ензим. Диабетология. 2002; 45: 1572–1576.

19. Накамура Т, Ушияма С, Сузуки С и др. Ефекти на инхибитор на ангиотензин-конвертиращия ензим, ангиотензин II рецепторен антагонист и калциев антагонист върху уринарните подоцити при пациенти с IgA нефропатия. Am J Nephrol. 2000; 20: 373-379.

20. Henger A, Huber T, Fischer KG, et al. Ангиотензин II повишава цитозолната калциева активност в подоцити на плъхове в култура. Kidney Int. 1997; 52: 687–693.

21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, et al. Дългосрочни благоприятни ефекти от инхибирането на ангиотензин-конвертиращия ензим при пациенти с нефротична протеинурия. Am J Kidney Dis. 1992; 20: 240-248.

22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, et al. Ангиотензин II повишава вътреклетъчната калциева активност в подоцитите на интактния гломерул.БъбрекВътр. 2000; 57: 41-49.

23. Gloy J, Henger A, Fischer KG, et al. Ангиотензин II модулира клетъчните функции на подоцитите. Kidney Int Suppl. 1998; 67: S168–S170.

24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Разтягането намалява експресията на нефрин чрез ангиотензин II-AT (1)-зависим механизъм в човешки подоцити: ефект на розиглитазон. Am J Physiol Renal Physiol. 2010; 298: F381–F390.

25. Endlich N, Endlich K. Разтягане, напрежение и адхезия - адаптивни механизми на актиновия цитоскелет в подоцитите. Eur J Cell Biol. 2006; 85: 229-234.

26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Активиране на локална тъканна ангиотензинова система в подоцитите чрез механично напрежение. Kidney Int. 2004; 65: 30-39.

27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. Силата на циклично разтягане селективно регулира нагоре бета изоформите на трансформиращия растежен фактор в култивирани мезангиални клетки на плъх. Am J Pathol. 1996; 148: 1915–1923.

28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Увреждането на подоцитите е критична стъпка в развитието на гломерулосклероза при унинефректомиран с дезоксикортикостерон хипертензивен плъх. Virchows Archiv. 1994; 425: 181-193.

29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J и др. Загубата на автофагия намалява масата и функцията на бета-клетките на панкреаса с последваща хипергликемия. Cell Metab. 2008; 8: 318-324.

30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Автофагияе важен за островната хомеостаза и компенсаторното увеличаване на бета-клетъчната маса в отговор на диета с високо съдържание на мазнини. Cell Metab. 2008; 8: 325-332.

31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, et al. Аутофагията на ендотелните клетки и подоцитите синергично защитава от индуцирана от диабет гломерулосклероза. Автофагия. 2015; 11: 1130–1145.

32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Автофагията влияе на чувствителността към гломерулна болест и поддържа хомеостазата на подоцитите при стареещи мишки. J Clin Invest. 2010; 120: 1084-1096.

33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, et al. Два вида аутофагия в подоцитите в проби от бъбречна биопсия: ултраструктурно изследване. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006; 38: 167-174.

34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. MAP-LC3, обещаващ автофагозомен маркер, се обработва по време на диференциацията и възстановяването на подоцити от PAN нефроза. FASEB J. 2003; 17: 1165–1167.

35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.Автофагиябори се с болестта чрез клетъчно самосмилане. Природата. 2008; 451: 1069-1075.

36. Yang L, Li P, Fu S, et al. Дефектната чернодробна аутофагия при затлъстяване насърчава ER стреса и причинява инсулинова резистентност. Cell Metab. 2010; 11: 467-478.

37. Xie Z, Klionsky DJ. Образуване на автофагозоми: основни машини и адаптации. Nat Cell Biol. 2007; 9: 1102-1109.

38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Отчитане на хранителни вещества, автофагия и диабетна нефропатия. Диабет. 2012; 61: 23-29.

39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Автофагия: нова терапевтична цел забъбрекзаболявания. Clin Exp Nephrol. 2012; 16: 827-832.

40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Възникваща роля наавтофагияпри бъбречна функция, заболявания и стареене. Автофагия. 2012; 8: 1009-1031.

41. Weide T, Huber TB. Последици от аутофагията за гломерулно стареене и заболяване. Cell Tissue Res. 2011; 343: 467-473.

42. Bork T, Liang W, Yamahara K, et al. Подоцитите поддържат високи базални нива на аутофагия, независимо от сигнализирането на mtor. Автофагия. 2020; 16: 1932 – 1948.

43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Активирането и секрецията на калпаин насърчават гломерулно увреждане при експериментален гломерулонефрит: доказателства откалпастатин- трансгенни мишки. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 3415-3423.

44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Подоцит-специфична експресия на Cre рекомбиназа в трансгенни мишки. Битие. 2003; 35: 39-42.

45. Хара Т, Накамура К, Мацуи М и др. Потискането на базалната аутофагия в нервните клетки причинява невродегенеративно заболяване при мишки. Природата. 2006; 441: 885–889.

46. ​​Lazareth H, Henique C, Lenoir O, et al. Тетраспанинът CD9 контролира миграцията и пролиферацията на париеталните епителни клетки и прогресията на гломерулното заболяване. Nat Commun. 2019;10:3303.

47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, et al. Рецепторът на епидермалния растежен фактор насърчава гломерулно увреждане и бъбречна недостатъчност при бързо прогресиращ сърповиден гломерулонефрит. Nat Med. 2011; 17: 1242-1250.

48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. Директното действие на ендотелин-1 върху подоцитите насърчава диабетната гломерулосклероза. J Am Soc Nephrol. 2014; 25: 1050-1062.

49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, et al. Свързаният с ядрения фактор еритроиден 2-фактор 2 задвижва подоцит-специфична експресия на активиран от пероксизомен пролифератор рецептор g, който е от съществено значение за резистентността към полумесечен GN. J Am Soc Nephrol. 2016; 27: 172-188.

50. Perez J, Dansou B, Herve R, et al. Калпаините, освободени от Т-лимфоцитите, разцепват TLR2, за да контролират експресията на IL-17. J Immunol. 2016; 196: 168-181.

51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. калпаинът/калпастатинсистема има противоположни роли в растежа и метастатичното разпространение на меланома. PLoS One. 2013; 8: e60469.

52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. Калпаините допринасят за възстановяването на съдовете при бързо прогресиращата форма на гломерулонефрит: потенциална роля на тяхното екстернализиране. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012; 32: 335-342.

53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E, et al. Убиване на две ядосани птици с един камък:автофагияактивиране чрез инхибиране на калпаини при невродегенеративни заболявания и не само. Biomed Res Int. 2019; 2019: 4741252.

54. Liu Z, Cao J, Gao X, et al. GPS-CCD: нова изчислителна програма за прогнозиране на местата на разцепване на калпаин. PLoS One. 2011;6:e19001.

55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: ресурс за калпаин и модулираща протеолиза. Genome Inform. 2010; 22: 202-213.

56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Прецизно предсказване на местата на разцепване на калпаин и тяхното отклонение, причинено от мутации в рака. Преден генет. 2019; 10: 715.

57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Медиираното от калпаин разцепване на Atg5 превключва аутофагията към апоптоза. Nat Cell Biol. 2006; 8: 1124–1132.

58. Xia HG, Zhang L, Chen G, et al. Контрол на базалната аутофагия чрез медиирано от калпаин1 разцепване на ATG5.Автофагия. 2010;6:61–66.

59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Калпаин-медиирано разцепване на Beclin-1 и дерегулация на аутофагията след исхемично увреждане на ретината in vivo. Клетъчна смърт Dis. 2011;2:e144.

60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, et al. ANG II насърчаваавтофагияв подоцитите. Am J Physiol Cell Physiol. 2010; 299: C488–C496.

61. Flannery PJ, Spurney RF. Трансактивиране на рецептора на епидермалния растежен фактор от ангиотензин II в гломерулни подоцити. Нефрон Експ Нефрол. 2006; 103: e109–e118.

62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, et al. Имунохистохимична локализация на ANG II AT1 рецептор при възрастен плъхбъбрекс помощта на моноклонално антитяло. Am J Physiol. 1997; 273: F170–F177.

63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Функционална експресия на системата ренин ангиотензин в човешки подоцити. Am J Physiol Renal Physiol. 2006; 290: F710–F719.

64. Pavenstadt H. Franz Volhard Award 2000: ангиотензин II сигнализиране в подоцита. Бъбречна кръвна преса Res. 2000; 23: 156-158.

65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Системата ренин-ангиотензин алдостерон в подоцитите. Семин Нефрол. 2012; 32: 377-384.

66. Jia J, Ding G, Zhu J, et al. Инфузията на ангиотензин II индуцира промени в експресията на нефрин и апоптоза на подоцитите. Am J Nephrol. 2008; 28: 500 – 507.

67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Гломерулни тип 1 ангиотензин рецептори увеличават увреждането на бъбреците и възпалението при миши автоимунен нефрит. J Clin Invest. 2009; 119: 943-953.

68. Song K, Stuart D, Abraham N, et al. Събирането на ренин в канала не медиира DOCA-солна хипертония или бъбречно увреждане. PLoS One. 2016; 11: e0159872.

69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Защитна роля на нокаут на ендотелния калпаин при остър, индуциран от липополизахаридбъбрекнараняване чрез отслабване на пътя на p38-iNOS и производството на NO/ROS. Exp Mol Med. 2020; 52: 702-712.

70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Активността на калпаин-10 е в основата на индуцираното от ангиотензин II производство на алдостерон в клетъчен модел на надбъбречен глоум рулоза. Ендокринология. 2015; 156: 2138–2149.

71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Калциево-зависимата протеаза калпаин-1 свързва активността на TRPC6 с увреждането на подоцитите. J Am Soc Nephrol. 2018; 29: 2099-2109.

72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ, et al. TRPC6 се свързва с и активира калпаин, независимо от неговата канална активност, и регулира цитоскелета на подоцитите, клетъчната адхезия и подвижността. J Am Soc Nephrol. 2019; 30: 1910–1924.

73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Насочване към системата калпаин/калпастатин като нова стратегия за предотвратяване на сърдечно-съдово ремоделиране при индуцирана от ангиотензин II хипертония. Circ Res. 2008; 102: 720-728.

74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Калпастатинконтролира полимикробния сепсис чрез ограничаване на освобождаването на прокоагулантни микрочастици. Am J Respir Crit Care Med. 2012; 185: 744-755.

75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Критична роля на баланса калпаин/калпастатин при остро отхвърляне на алографт. Eur J Immunol. 2011; 41: 473–484.

76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Специфично инхибиране на калпаин защитавабъбрексрещу възпаление. Sci Rep. 2017; 7: 8016.

77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, et al. Инхибирането на калпаин се възстановяваавтофагияи предотвратява митохондриалната фрагментация в човешки iPSC модел на диабетна ендолиопатия. Представител на стволови клетки 2019; 12: 597–610.

78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. Разцепването in vitro на високите протеини чрез протеази на клетъчната смърт. Автофагия. 2010; 6: 1042-1056.

79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Диференциална регулация на комплекса калпаин-калпастатин от L-домена накалпастатин. Biochim Biophys Acta. 2014; 1843: 2583–2591.