Експресията на Clr‑f регулира имунната и метаболитната хомеостаза на бъбреците Ⅲ
Nov 24, 2023
Дискусия
Възпаление и имунно-клетъчно медиираноувреждането играе водеща роля в развитието и прогресирането на бъбречно увреждане и дисфункция. В това проучване ние съобщаваме за изискване за Clr-f при поддържането наздравето на бъбрецитеи функциякато присъщ хомеостатичен контрол срещуимунно- и метаболитно медиирано бъбречно увреждане. Нашите открития показват инфилтрация на имунни клетки и отлагане на имуноглобулин и протеин на комплемента в бъбреците на мишки с дефицит на Clr-f. Тези имунни характеристики на Clr-f-дефицитни мишки са съчетани със свързаната с възрастта поява на тубулни и гломерулни лезии, ектопично натрупване на липиди и дисрегулация на множество транскрипционни процеси.
Щракнете за Cistanche herba за бъбречно заболяване
Clr протеините, кодирани в NKC сред техните генетично свързани NKR-P1 рецептори, са били в центъра на изследването като не-излишни MHC клас I-независими медиатори на липсващо саморазпознаване от NKR-P1, експресиращи имунни клетки9, 27-31. Съобщава се също, че повишената експресия на избрани Clr протеини в отговор на клетъчния стрес функционално ограничава имунните отговори на тъканно-резидентните имунни клетки 7, 12, 32. Съответно се предполага, че чревният Clr-f допринася за имунната толерантност в иначе силно имуногенната чревна среда чрез взаимодействието си с инхибиторните NKR-P1G рецептор-експресиращи интраепителни лимфоцити7. Работата, извършена от Leibelt et al. показаха, че мишки, предизвикани с поли(I:C), показват повишена експресия на Clr-f и че взаимодействията Clr-f/NKR-P1G in vitro са силно инхибиторни за NKR-P1G експресиращи клетки. Заедно тези открития могат да се тълкуват като потенциален механизъм, чрез който Clr-f може да предотврати реактивността на чревни интраепителни NKR-P1G положителни подгрупи към епителната бариера, която постоянно се провокира от микробни стимули7.
Генерирането на мишки с дефицит на Clr-f ни предостави първата възможност да оценимфункционални последицина експресията на Clr-f in vivo и ни позволи да изследваме потенциалните имунни хомеостатични роли на Clr-f в бъбреците. Увреждането на бъбреците, наблюдавано при Clr-f−/− мишки, е в съответствие с модела, че понижаването на Clr-f служи като индикатор за клетъчен стрес и нараняване, което освобождава ограничения върху NKR-P1G-експресиращите ефекторни клетки. Увеличаването на NKR-P1G върху Т клетките в бъбреците на Clr-f−/− мишки предполага, че или експресията на NKR-P1G е повишена сред резидентните на бъбреците Т клетки в отсъствието на Clr-f, или че бъбреците на Clr- f-/- мишки се подлагат на инфилтрация на NKR-P1G-експресиращи Т клетки. Липсата на забележима промяна в присъствието или разпределението на NKR-P1G-експресиращи клетки в червата на Clr-f−/− мишки може да означава, че функционалните последици от взаимодействието NKR-P1G: Clr-f в червата са ограничени за контрола на имунната реактивност в контекста на инфекция, а не на имунната толерантност. Алтернативно, излишните взаимодействия могат също да контролират активността на NKR-P1G-експресиращи клетки. Това се подкрепя от открития, че NKR-P1G се свързва не само с Clr-f, но и с Clr-d и Clr-g33, последният от които е умерено експресиран в тъканите както на бъбрека, така и на червата6. Докато нашите открития разкриват изискване за Clr-f за защита срещу автоимунно увреждане на бъбреците, NKR-P1G-медиираната роля в автоимунните бъбречни патологии на Clr-f-/- мишки е непълна. Трябва да се отбележи, че въпреки че има увеличение на NKR-P1G-експресиращите Т клетки в бъбрека на Clr-f-/-мишки, разликата е неустоима. Възможно е алтернативен рецептор да участва в наблюдението на Clr-f в бъбреците. За да се отговори напълно на тази ос на контрол в бъбречната хомеостаза, са необходими допълнителни изследвания
Имунно-медиираното увреждане на бъбреците се характеризира с инфилтрация на възпалителни клетки в интерстициалното пространство или в гломерула34. Бъбречните натрупвания на моноцити, В и Т клетки, антигломерулни антитела, повишени IL-12 и IFN цитокини и различни гломерулни патологии при Clr-f−/− мишки много наподобяват автоимунния пейзаж на LN миши модели ( т.е. MRL-Faslpr)35–37. Въпреки че Clr-f−/− бъбреците показват IgA доминантни мезангиални отлагания със свързано IgM и IgG отлагане и групирането на Clr-f−/− и IgAN транскрипционни профили, вероятно е преждевременно да се предполага, че тези фенотипове са показателни за тип ХБН с IgAN38. По-скоро тези увреждания, заедно с наличието на мезангиолиза, удебеляване на GBM и смърт на подоцити в Clr-f−/− бъбреците, както и тубулоинтерстициални промени, натрупване на мазнини и значителна дисрегулация в метаболитните пътища, са елементи, общи за различни патологии получени от метаболитни дефекти, изострени от имунната система37,39,40. Независимо от основната причина или типа заболяване на Clr-f−/− миша бъбречна дисфункция, Clr-f изглежда играе смекчаваща роля срещу развитието на автоимунитет с ясна патология, свързана с гломерулонефрит.
Нашето изследване на Rag1−/−Clr-f−/− мишки показва значителен принос на Т и В клетъчно независими медиатори към автоимунните отговори на Clr-f−/− мишки. По-специално, натрупването на перигломерулни CD11c+ клетки, F4/80+ клетки и NKp46+ клетки е още по-изразено в отсъствието на Т и В клетки и корелира със значително присъствие на гломерулно увреждане. Това предполага, че докато Т и В клетките могат да допринесат за увреждащо бъбреците възпаление и комплекси на автоантитела, при Clr-f−/− мишки те може да не са централни детерминанти на патологията, а или вторични допринасящи за възпалителната активност на други имунни клетки или потенциално изпълняват имунорегулаторна роля при мишки, които нямат Clr-f. Това контрастира с доказателства от ddY миши модел на IgAN, който показва силен Т1 поляризиран отговор, с IFN-продуциращи Т клетки, които се увеличават с възрастта и прогресията на гломерулното увреждане41. Бъбречната инфилтрация на В клетки в Clr-f-дефицитни мишки също е показана в миши модели на SLE42. Към днешна дата не е ясно дали В клетките в бъбрека допринасят за увреждащото възпаление при ХБН или играят повече регулаторни роли43. Скорошни доказателства за ХБН при пациенти в напреднала възраст установяват, че намаляването на популациите на В клетките е свързано с прогресията на бъбречното заболяване44. Показано е, че доказателствата както от Т, така и от В клетките имат имуносупресивна активност при автоимунни бъбречни заболявания 45, 46, и следователно степента, до която те допринасят или регулират патологиите на Clr-f-/- мишки, изисква допълнително изследване.
Нашите открития заедно показват изискване за експресия на Clr-f в тубуларния епител на проксималните извити тубули, подоцитите и/или чревния епител. Загубата на експресия на Clr-f води до изразена автоимунна и възпалителна каскада, която води до увреждане на бъбреците и свързаното с това затлъстяване. Имунните отговори, предизвикани от загубата на Clr-f, изглежда са независими от Т и В-клетките. Като цяло, функционалната роля на Clr-f в бъбрека може да се представи като инхибиторна молекула за наблюдаваните ефекторни имунни клетки в бъбрека, както е поставено в червата, или катовътрешен регулатор на функцията на тубулните клетки.
Материали и методи Мишки.
Всички мишки се поддържат в специална среда без патогени. C57BL/6 (WT) и B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) мишки бяха придобити от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME, USA). Мишки, носещи комбинираните нулеви мутации в Rag1 и Clr-f (Rag1−/−; Clr-f −/−), се генерират чрез кръстосване на Clr-f-дефицитни (Clr f −/−) мишки с (Rag1−/−) мишки . Цялото развъждане и манипулации, извършени върху животни, са в съответствие с университетските насоки и са одобрени от Комитета по етика на животните на Университета Далхаузи и Комитета за грижа и използване на животните (IACUC) на Университета в Отава. Всички планове на проучвания върху животни, експерименти и докладване са проведени в съответствие с насоките на ARRIVE.
Генериране на Clr-f-дефицитни мишки. Clr-f-дефицитни (Clr-f −/−) мишки се генерират чрез хомоложна рекомбинация на прицелна конструкция, съдържаща касета с фосфоглицерат киназа (PGK) – неомицин и геномна последователност, обхващаща екзони 3, 4 и част от екзон 5 на Clr-f ген. Пълната насочена конструкция беше потвърдена чрез секвениране в Изследователския институт на болниците в Отава (OHRI) преди електропорация в C57BL/6 Bruce-4 ембрионални стволови (ES) клетки. Изборът на ES клон чрез G{{10}}резистентност беше извършен от IRCM (Монреалски клиничен изследователски институт) Transgenic Core Facility (Монреал, QC, Канада). Междувременно, 5' и 3' Clr-f сондите бяха тествани в анализ на полиморфизъм на дължината на рестрикционния фрагмент (RFLP), използвайки тимична геномна ДНК от мишка WT B6, която беше усвоена съответно с BamHI и PstI. Усвоените ДНК фрагменти се разделят върху 1% агарозен гел и се прехвърлят в петна с найлонова мембрана. Clr-f cDNA проби бяха белязани с радиоактивен 32P-dCTP (Perkin Elmer, Guelph, ON, Канада), като се използва комплектът NEB lot (New England Biolabs, САЩ). Блотовете се изследват с 32P-маркирани Clr-f cDNA сонди в хибридизационен разтвор (10% (w/v) декстран сулфат; 1 М NaCl; 1% SDS). Хибридизацията се провежда за една нощ при 65 градуса и се извършват промивания след хибридизация с разтвор, съдържащ 2 × SSC и 1% SDS, предварително затоплен до 65 градуса. Петната бяха изложени на фотографски филми, за да се разкрият хибридизационните сигнали (фигури S1A, S3B). Мембраните се оголват с 0.2% SSC/0.2% SDS за 30 минути при 85 градуса между различни хибридизации. Устойчивите на неомицин клонове бяха скринирани чрез Southern blot анализ и беше наблюдавана ефективност на насочване от ~15%. Избрани ES клонове бяха микроинжектирани в бластоцисти в IRCM Microinjection Service Facility, за да се генерират химерните мишки основатели на Clr-flox. Мишките бяха скринирани чрез Southern blot анализ и след това бяха развъждани с B6 женски за получаване на Clr-fwt/lox хетерозиготни мишки. Хетерозиготни мишки се кръстосват, за да се получат Clr-flox/lox мишки. За да се премахне неомициновата касета, Clr-flox/lox мишки се отглеждат с хомозиготни CMV-cre трансгенни мишки на фон В6 (Jackson Laboratory). Полученият двойно хетерозиготен CMV-CreTg/0; Clr-f−/+ мишки бяха кръстосани, за да произведат Clr-f−/− мишки, които нямаха CMV-cre трансген. Мишките бяха генотипирани с помощта на специфични праймери (Таблица 1, Фиг. S1B, C и Фиг. S3C, D). PCR амплификацията се извършва с помощта на AccuStart II Taq ДНК полимераза (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). PCR сместа се приготвя съгласно инструкциите на производителя. Екстрахирана с фенол/хлороформ ушна ДНК се използва като шаблони. Бяха използвани следните PCR циклични параметри: 30 цикъла на амплификация от 94 градуса за 40 s, 60 градуса за 45 s, 72 градуса за 60 s. WT и Clr-f −/− котила бяха използвани във всички експерименти, освен ако не е посочено друго.
In situ хибридизация.
In situ хибридизационните анализи на Clr-f бяха постигнати чрез клониране на сенс веригата с пълна дължина CDS и Clr-f-обхващаща антисенс верига в pGEM-T Easy вектор, както е описано по-горе. Белязани с дигокси генин антисенс и сенс РНК проби се транскрибират от линеаризирани плазмиди, кодиращи Clr-f гена с Т7 полимераза, като се използва смес за маркиране на DIG РНК (Roche, Basel, Швейцария). Тъканите се събират от възрастни B6 мишки и се фиксират или в 10% формалин при стайна температура, или в 4% параформалдехид при 4 градуса с леко разклащане за до 24 часа. След това тъканите се поставят в парафин и се приготвят срезове от 4 µm върху предметни стъкла. Тъканните слайдове се декарбонизират чрез третиране с 0.2 N HCl за 15 минути и 30 µg/mL протеиназа К при 37 градуса за 20 минути. Тъканта се фиксира в 4% PFA за 10 минути, последвано от третиране с 0.25% оцетен анхидрид в 0.1 М триетаноламин два пъти за 5 минути всеки. След това слайдовете се хибридизират предварително с хибридизиращ разтвор (50% (обем/обем) формамид/5×SSC, pH 4,5; 2% (тегл/обем) блокиращ прах (Roche); 0,05% (т/об) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 µg/mL хепарин; 1 µg/mL дрождена РНК) в пещ при 58 градуса за най-малко 1 час и след това се инкубира с хибридизационен разтвор, съдържащ 500 ng/mL белязана с дигоксигенин проба за една нощ при 58 градуса. Промивания след хибридизация се извършват с 50% формамид/2 × SSC, рН 4,5 при 55 градуса 3 × за 20 минути всяко, и предметните стъкла се оцветяват с овче анти-дигоксигенин алкална фосфатаза-конюгирано антитяло при 1:1000 разреждане в блокиращ разтвор ( Рош). Развитието на цвета беше извършено чрез добавяне на нитро син тетразолий/5-бромо, 4-хлоро и 3-индоилфосфат (NBT/BCIP, Roche) субстрати към слайдовете. Слайдовете се държат на тъмно при стайна температура, докато се появят оптимални сигнали. Контролното маркиране беше извършено с помощта на сенс-верижна сонда и конкурентни изследвания на свързване със сенс и антисенс сонда, потвърдена специфичност. След това слайдовете се оцветяват обратно със светло зелено или метилово зелено и се визуализират под светлинен микроскоп.
RT‑PCR. Бъбречни тъкани от съвпадащи по възраст и пол WT и Clr-f −/− мишки бяха изрязани, изплакнати с PBS и замразени при -80 градуса. РНК се изолира от замразени тъкани с помощта на реагент за екстракция на RiboZol RNA (AMRESCO Inc., West Chester, PA, USA), следвайки инструкциите на производителя. Приблизително 1 ug от РНК се транскрибира в сДНК, като се използва Verso cDNA комплект (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). PCR амплификацията се извършва върху 1 μL cDNA продукт, като се използват специфични праймери (Таблица 1). Използваните PCR условия бяха 94 градуса за 30 s, 58 градуса за 30 s, 72 градуса за 60 s и 35 цикъла на амплификация. PCR продуктите се визуализират върху 1% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид (Фиг. 1C, Фиг. S3A).
Имунохистохимия.
Бъбречни тъкани на съвпадащи по възраст и пол WT и Clr-f −/− мишки бяха депарафинизирани чрез три 5-минутни инкубации в ксилен, две 5-минутни инкубации в 100% етанол, последвани от 90 % етанол, след това 80% етанол и накрая 70% етанол. Предметните стъкла се рехидратират чрез промиване в дестилирана вода (20 потапяния) и индуцираното от топлина извличане на епитоп се извършва с помощта на тенджера под налягане в цитратен буфер (рН 6.0). Ендогенните пероксидази бяха блокирани с 3% водороден пероксид в стерилна вода в продължение на 10 минути и протеините бяха блокирани с помощта на Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, USA). След това срезовете се инкубират с плъши анти-миши моноклонални анти-Clr-f антитела7 при 4 градуса за една нощ. На следващия ден предметните стъкла се изплакват с 0.1 М PBS и се инкубират в продължение на 1 час във вторични антитела. Оцветяването беше разработено с помощта на кит Goat-on-Rodent HRP-Polymer (Biocare Medical) и Betazoid DAB буфер (Biocare Medical), последвано от противооцветяване с хематоксилин. Същият процес беше използван за оцветяване на секция от бъбречна тъкан за IHC маркиране на NKp46+ и CD3+ клетки, използвайки анти-NKp46 (eBioscience, Санта Клара, Калифорния, САЩ, клонинг 29A1.4, CAT# 48-3351-82) и анти-CD3 (BioLegend CAT#100,327) съответно като първични антитела. IHC маркиране на F4/80 се извършва върху замразени бъбречни срезове, като се използва анти-F4/80 плъше моноклонално BM8 антитяло. Беше използвано козе анти-плъхово IgG H&L HRP-конюгирано вторично антитяло (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) както по-горе и бяха разработени IHCs, използван беше субстрат от пероксидаза от хрян (HRP) DAB Substrate Kit (Abcam, CAT# ab64238).
Имунофлуоресценция.
Бъбречните и/или чревните тъкани на съвпадащи по възраст и пол WT и Clr-f −/− мишки бяха криоконсервирани в 30% захароза при -80 градуса в съединение с оптимална температура на рязане на Tissue-Tek (Fisher Scientific, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ). 20 μm криостатни секции бяха фиксирани с ацетон в абсорбатор при стайна температура за 16 минути и изсушени на въздух за най-малко 30 минути, след промиване в 0.01 М PBS, рН 7.4. Неспецифичното свързване беше блокирано с 10% магарешки серум. Срезовете се инкубират една нощ при 4 градуса с първичните антитела: анти-Clr-f7, анти-NKR-P1G (плъхово анти-мише моноклонално антитяло, описано по-рано7), анти-IgA (козе анти-мише IgA алфа верига (Abcam, Cambridge) , UK CAT#ab97235), анти-IgG-PE (BioLegend, Сан Диего, Калифорния, САЩ CAT#405324, анти-IgM-FITC (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ CAT#A21042), комплемент C3 анти тяло (11H9 ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), анти-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, САЩ CAT#554411), анти-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), анти-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), анти-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), анти-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116) и анти-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) при концентрация 1:100 в 5% нормален серум във влажна камера. Вторично маркиране на антитяло на анти -Clr-f и анти-NKR-P1G антитела, като се използват FITC конюгирани поликлонални антитела, се извършва при RT за 1 ч. Пробите се оцветяват с DAPI ядрено при RT за 5 минути, промиват се с PBS и се поставят върху предметни стъкла с една капка VECTASHIELD PLUS противоизбледняваща среда за монтиране (Vector Laboratories, Сан Франциско, Калифорния, САЩ) и покрита със стъклено покривно стъкло. Слайдовете бяха изследвани с лазерно сканиращ конфокален микроскоп Zeiss LSM 510.
Оценяване на хистология и патология.
Бъбречни срезове на съвпадащи по възраст и пол WT, Clr-f −/−, Rag1−/− и Rag1−/−Clr-f −/− мишки (3 μm) бяха оцветени с периодична киселина-Schif (PAS). Бъбречната тъкан се оценява за мезангиална клетъчност (дефинирана като 4 или повече ядра на мезангиална област), ендокапилярна пролиферация, полумесеци и гломерулна склероза. Срезовете също бяха оценени за наличие на тубулопатия, интерстициална фиброза, тубулна атрофия и тубулоинтерстициални клетъчни инфилтрати. За оценка на патологията на гломерулите се използва полуколичествен резултат за оценка на степента на гломерулно увреждане. Бяха изследвани минимум 50 гломерула във всяка група и тежестта на лезията беше степенувана от 0 до +3: +1 лезия представляваше засягане на По-малко или равно на 30% на гломерула, +2 от 30–60%, докато +3 лезия показва, че е засегнат по-голям или равен на 60% от гломерула. Измерването на дебелината на GBM беше извършено върху гломерулни електронни микрографии на WT и Clr-f −/− с помощта на Image J V1.53a47. PAS-оцветена бъбречна тъкан от две Rag1−/− и две Rag1−/−Clr-f −/− мишки беше допълнително оценена сляпо за наличието на патологичните характеристики по-горе и количествено определените характеристики бяха изчислени от средните четири бъбречни секции на мишка.
Електронна микроскопия.
Обработката на тъкан за трансмисионна електронна микроскопия следва публикувания протокол48. Накратко, малки парчета бъбречни тъкани от 12-седмични мишки WT и Clr-f −/− бяха фиксирани в 2,5% разтвор на глутаралдехид и след това обработени с помощта на метода 1% осмиев тетроксид/уранил ацетат. Пробите бяха вградени в смола Epon Araldite преди рязане с ултрамикротом Reichert-Jung ultra cut E. Пробите бяха визуализирани на трансмисионен електронен микроскоп JEOL JEM 1230 и изображенията бяха заснети с помощта на цифрова камера Hamamatsu ORCA-HR.
Измерване на химически отпадъци от урина и плазма и електролити.
Приблизително 150 μL урина се събира ежедневно от 12-седмични мъжки мишки WT и Clr-f −/− по едно и също време на деня в продължение на 5 последователни дни. Урината се центрофугира при 10,000 rpm за отстраняване на остатъците и след това се съхранява при -80 градуса. Кръв от лицева вена се събира от същите мишки в хепаринизирани епруветки и се изолира чрез центрофугиране при 3000 g за 5 минути и се съхранява при -80 градуса. Проби от урина и плазма бяха изпратени до Idexx Laboratories (Markham, Онтарио) за измерване на концентрацията на протеин, креатинин и електролит.
Измерване на кръвното налягане на мишки на 12 и 24 седмици. Систолното и диастоличното кръвно налягане (BPs) бяха измерени чрез плетизмография на маншета на опашката на 12 и 24-седмични мъжки мишки WT и Clr-f −/− в стационарно състояние, като се използва модел BP2000 Visitech. АН се измерва ежедневно в една и съща стая и в един и същи час на деня в продължение на 5 последователни дни. Стойностите на BP от последните 3 последователни измервания бяха използвани за изчисляване на средната стойност на BP, тъй като първите 2 дни се считат за съществени за адаптацията на мишките.
Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30 × 106 дълбочина на четене на проба.
RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 и дневна граница на промяната на сгъване от 1,5. Предоставени са стойности на FPKM за всички времеви точки и проби (допълнителен файл с набор от данни 1). Анализ на функционалното обогатяване. Генната онтология и анализът на функционалното обогатяване бяха извършени с помощта на g: Profiler (версия e102_eg49_p15_7a9b4d6) с g: SCS метод за корекция на множествено тестване, прилагащ праг на значимост от 0,05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 и класификационната система PANTHER с точното тестване на Fisher и прага на FDR от<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53.
Създадени са мрежи за функционално обогатяване с помощта на набори от гени на GO Biological Processes (GO: BP) за Mus Musculus (GRCm38. p6) Версия на BioMart: 2020-12-08 изтеглено от g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). Анализът на обогатяване на набор от гени (GSEA) беше извършен с помощта на GSEA V4.0354,55 с използване на мрежово обогатяване на базата на FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).
Абдоминален и ектопичен анализ на липидите. Натрупването на мазнини се определя от теглото на коремната мазнина, разрязана от отделни мишки. Измерванията на телесното тегло са направени преди екстракция на мазнини. За оцветяване с маслено червено O (ORO), замразените бъбречни срезове се нарязват на 10 μm с помощта на криостат и след това се сушат на въздух за 30 минути. Оцветяването с ORO се извършва чрез фиксиране на срезовете с 3 промивания с 60% изопропанол, инкубирането им с работна концентрация (66%) на ORO разтвор (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) оцветяване за 15 минути. След това предметните стъкла се промиват бързо с 60% изопропанол, бързо се оцветяват с хематоксилин на Mayer, за да се подчертаят ядрата, и след това се монтират с помощта на VectaMount AQ Aqueous Mounting Media (Vector Laboratories).
Анализ на патотипа. Анализът на патотипа беше извършен с помощта на диференциално експресирани гени (DEG) с q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation.
Усвоената тъкан беше прекарана през 70-μm найлонов филтър, PBS промит и останалите червени клетки бяха лизирани с ACK лизиращ буфер за 5 минути върху лед. Бъбречните имунни клетки се изолират чрез RT центрофугиране при 2000 rpm за 30 минути в 40% Percoll. Клетъчната пелета се ресуспендира в PBS и броят на клетките се получава чрез хемоцитометър. Различни моноклонални антитела бяха използвани за проверка на експресията на протеин на клетъчната повърхност, клетките бяха оцветени за анализ чрез цитометрия с флуорохром-маркирани миши антитела: анти-CD45 (eBioscience, клон 30-F11), анти-TCR (eBioscience, клон H{ {12}}), анти-NK1.1 (eBioscience, клон PK136), анти-CD19 (BioLegend, клон 1D3/CD19), анти-CD11b (BioLegend, клон M1/70), анти-F4/80 (BioLegend, клон BM8), анти-MHCII(IA/IE) (BioLegend, клон M5/114.15.2), анти-Ly6G (BioLegend, клон 1A8), анти-NKp46 (eBioscience, клон 29A1.4) и изотипни контроли. Клетъчната жизнеспособност се определя с помощта на Fixable Viability Dye (eBioscience, Cat# 65-0865-14). За идентифициране и количествено определяне на имунните клетъчни популации в WT и Clr-f −/− бъбреците бяха използвани мултипараметрични анализи на фот цитометрия, използващи антитела срещу клетъчно-специфични маркери, за идентифициране на неутрофили (CD11b+Ly6G+), макрофаги (CD11b+Ly6G−F4/{ {57}}MHCII+), NK клетки (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+) и NKp46+ клетки (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), Т клетки (Ly6G−NK1 .1−TCR +) и В клетки (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Всички проби са получени на BD-Fortessa fow цитометър.
Препратки
1. Hato, T. & Dagher, PC Как вродената имунна система усеща проблемите и ги причинява.Clin. J. Am. Soc. Нефрол.10, 1459–1469 (2015).
2. Крюгер, Т.ет ал.Идентифициране и функционално характеризиране на дендритни клетки в здрави миши бъбреци и в експерименталнигломерулонефрит.J. Am. Soc. Нефрол.15, 613–621 (2004).
3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Дендритни клетки и макрофаги: стражи в бъбреците.Clin. J. Am. Soc. Нефрол.10, 1841–1851 (2015).
4. Волтман, AMет ал.Количествено определяне на подгрупи дендритни клетки в човешка бъбречна тъкан при нормални и патологични състояния.Kidney Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Готшалк, К.ет ал.Batf3-зависимите дендритни клетки в бъбречните лимфни възли предизвикват толерантност към циркулиращите антигени.J. Am.Soc. Нефрол.24, 543–549 (2013).
6. Джан, К.ет ал.Миши Nkrp1-Clr генни клъстерни последователности и анализи на експресия разкриват консервация на тъканно-специфичен MHCнезависимо имунологично наблюдение.PLoS One7, e50561 (2012).
7. Лайбелт, С.ет ал.Специализирано имуносензиране на чревния епител на мишка, улеснено от двойка генетично свързани лектиноподобнирецептори.Мукозен имунол.
8, 232–242 (2015). 8. Рахим, ММАet al.Мишка NKR-P1B: Системата за разпознаване на Clr-b е отрицателен регулатор на вродените имунни отговори.Кръв125, 2217–2227 (2015).
9. Карлайл, младшиет ал.Липса на саморазпознаване на Ocil/Clr-b от инхибиторни NKR-P1 естествени клетъчни рецептори убийци.Proc. Natl. акад. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004).
10. Рутковски, Е.ет ал.Clr-a: Нова, свързана с имунитета С-тип лектиноподобна молекула, експресирана изключително от епител на червата на мишка.J. Immunol.198, 916–926 (2017).
11. Баладжи, ГРet al.Разпознаването на Clr-b на гостоприемника от инхибиторния NKR-P1B рецептор осигурява основа за саморазпознаване на липсващи.Нац.Общ.9, 4623 (2018)
12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Select Clr-g експресия върху активирани дендритни клетки улеснява родственото взаимодействиес малка подгрупа от NK клетки на далака, експресиращи инхибиторния Nkrp1g рецептор.J. Immunol.200, 983–996 (2018).
13. Абу-Самра, Е.ет ал.Експресията на NKR-P1B в свързаните с червата вродени лимфоидни клетки е необходима за контрола на стомашно-чревния трактинфекции на тракта.клетка. Mol. Immunol.16, 868–877 (2019).
14. Жермен, С.ет ал.Характеризиране на алтернативно сплайсирани варианти на транскрипт на CLEC2D ген.J. Biol. Chem.285, 36207–36215 (2010).
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
