Абсорбцията на цитокини по време на перфузия на човешки бъбрек намалява възпалителния генен подпис, свързан със забавената функция на присадката

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Джон Р. Фердинанд1,2|Сара А. Хосгуд2,3|Том Мур 2,3|Ашли Феро1|Кристофър Дж. Уорд1|Томас Кастро-Допико1|Майкъл Л. Никълсън2,3|Мена Р. Клатуърти1,2

1 Отдел за молекулярен имунитет, Катедра по медицина на Университета в Кеймбридж, Лаборатория по молекулярна биология, Кеймбридж, Обединеното кралство

2 Национален институт за здравни изследвания Отдел за изследване на кръвта и трансплантациите в донорството на органи, Кеймбридж, Обединеното кралство

3 Катедра по хирургия на Университета в Кеймбридж, Кеймбридж, Обединеното кралство

Трансплантацията е оптималното лечение за повечето пациенти в краен стадийбъбрекзаболяванено недостигът на органи е голямо предизвикателство. Нормотермичната машинна перфузия (NMP) е използвана за възстановяване на маргиналните органи; обаче механизмите, чрез които NMP може да повлияе на органите, не са добре разбрани. Използвайки двойки човешки бъбреци, получени от един и същ донор, сравнихме ефекта на NMP с този на хладилното съхранение върху глобалниябъбректранскриптом. Открихме, че хладилното съхранение води до глобално намаляване на генната експресия, включително гени на възпалителния път и тези, необходими за процесите на генериране на енергия, като оксидативно фосфорилиране (OXPHOS). За разлика от това, по време на NMP, имаше изразена регулация на OXPHOS гените, но също така и на редица гени на имунния и възпалителния път. Използвайки биопсии от бъбреци, подложени на NMP, които впоследствие бяха трансплантирани, открихме, че по-висока възпалителна генна експресия се наблюдава в органи с продължителна забавена функция на присадката (DGF). Затова използвахме хем-адсорбер (НА) за отстраняване на провъзпалителни цитокини. Тази атенюирана възпалителна генна експресия увеличава OXPHOS гените на пътя и има потенциално клинично важни ефекти при намаляване на експресията на DGF-асоцииран генен подпис. Заедно нашите данни предполагат, че адсорбцията на провъзпалителни медиатори от перфузата представлява потенциална интервенция, която може да подобри жизнеспособността на органа.

КЛЮЧОВИ ДУМИ:клинични изследвания/практика, забавена функция на присадката (DGF), донори и донорство: починали,бъбрек(алографт) функция/дисфункция,бъбрекзаболяване: имунна/възпалителна, бъбречна

Билка цистанче, подобряваща функцията на бъбреците

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Бъбректрансплантацията представлява оптималното лечение за повечето пациенти скраен стадийбъбрекзаболяване, с ползи както за качеството, така и за количеството на живота.1 Недостигът на органи е голямо предизвикателство и са използвани няколко стратегии за увеличаване на броя на наличните бъбреци, включително използването на починали донори със смърт от кръвообращението (DCD) и донори с разширени критерии (ECD ), като и двата са свързани с по-високи нива на забавена функция на присадката (DGF) в сравнение с починал донор със смърт на мозъчния ствол (DBD). 2,3 В DCD бъбреците излагането на топла исхемия по време на процеса на спиране на кръвообращението има значителен принос за DGF . DGF възниква поради увреждане или смърт на исхемични тубулни клетки, което може да стимулира вроденото имунно активиране чрез сглобяване на инфламазома NLRP3, водещо до генериране на интерлевкин (IL)1 и IL18.4-6 Наистина, наличието на възпалителни цитокини в урината е установено използван като биомаркер наостърбъбрекнараняванеи DGF.7-9

Нормотермичната машинна перфузия (NMP) позволява трансплантираните органи да бъдат перфузирани с топли, наситени с кислород червени кръвни клетки, в отсъствието на циркулиращи имунни компоненти, включително комплемент и неутрофили.{0}} Този процес е използван за оценка на маргинални органи15 и за " възстановяване на" органи, за да се улесни трансплантацията на бъбреци, които първоначално бяха отказани след предложение чрез национална служба за разпределяне на органи.16 Нашият предишен опит с използването на NMP предостави обосновката за рандомизирано контролирано проучване за оценка на неговата ефикасност при предотвратяване на DGF в DCD бъбреците,17 но механизмите, чрез които NMP може да повлияе на трансплантираните бъбреци, не са напълно разбрани. Освен това въпросът дали допълнителна манипулация набъбрекпо време на NMP, например чрез отстраняване на провъзпалителни цитокини и хемокини от перфузата, може да предложи допълнителни ползи при оптимизиране на органа преди трансплантация, не е разгледано при човешки бъбреци, но нашето проучване на NMP при свине демонстрира обещаващи резултати.18

Тук предприехме безпристрастен подход, за да отговорим на тези два въпроса, използвайки транскриптомичен анализ на човекабъбрекбиопсии, взети в началото и в края на NMP за оценка на глобалните промени в генната експресия. Използвахме двойки човешки бъбреци от един донор, което позволява сравнение на ефекта от различни интервенции в органи с идентичен генетичен произход и успяхме да оценим въздействието на тези промени върху прогнозата за резултата от присаждането.

Полза от екстракт от Cistanche: предотвратяване на острибъбрекнараняване

2. РЕЗУЛТАТИ

2.1. Сдвоените бъбреци са генетично сходни и са полезен модел за оценка на интервенциите

Изследвахме транскрипционните промени, свързани със запазването на органи и NMP в две независими проучвания, всяко с пет чифта бъбреци, което прави общо 10 чифта/20 човешки бъбрека. От тях двама бяха от DBD и осем от донори на DCD (Таблица S1, S2 и Фигура S1). В тези проучвания взехме кортикални биопсии преди и след интервенция (хладилно съхранение или NMP) и изследвахме транскрипционния пейзаж, използвайки РНК секвениране (RNA-Seq). Използването на сдвоени бъбреци и сдвоени биопсии от същитебъбрекни позволиха да контролираме биологичните вариации и да регресираме този объркващ фактор извън анализа (Фигура S2A). Ние потвърдихме товабъбрекдвойките започват с общ транскрипционен пейзаж (фиг. S2B) и чрез прилагане на различни интервенции към всякабъбрекв двойка, ние сме в състояние да изследваме ефекта от интервенция, независимо от биологичните вариации.

ФИГУРА 1 Бъбреците, изложени на студено съхранение, показват ограничени промени в генната експресия в сравнение с тези, подложени на NMP. Бяха получени чифт бъбреци, които не бяха използвани за трансплантация. единбъбрекбеше поддържан в статичен хладилен склад, а другият беше подложен на нормотермична машинна перфузия (NMP). Взети са биопсии от външния кортекс в началото и след 2 часа. B, Графика на вулкан, показваща промяна в генната експресия на 2 часа за посочената група в сравнение с началото. Червените точки показват диференциално експресирани гени с коригирана P-стойност<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

ФИГУРА 2 Корелация на транскриптома след NMP с дължината на забавената функция на присадката. Експресията на ген е свързана с дължината на DGF в биопсии, взети след NMP като част от рандомизирано клинично изпитване. Начертани са нивата на експресия на 1000 гена с най-голяма корелация с резултата. B, GSEA беше извършена за корелация от A срещу набора от данни за отличителни белези. Само значими пътища (FDR q стойност<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP води до увеличаване на OXPHOS и гените на възпалителния път в сравнение със студеното съхранение

За да проучим потенциалните механизми, чрез които NMP може да повлияе на бъбреците, първоначално взехме петбъбрекдвойки (n {{0}} DCD донори и n=1 починал донор със смърт на мозъчния ствол [DBD], Фигура S1, Таблица S1) и извърши време 0 (0 часа) кортикална биопсия . В този момент бъбреците бяха рандомизирани на статично хладилно съхранение или NMP, както е описано по-рано 10 (Фигура 1А). След 2 часа е взета втора биопсия от двата бъбрека и е извършена RNA-Seq. Когато сравнявахме генната експресия между биопсиите от 0- до 2- часа, открихме, че бъбреците, поставени в статично хладилно хранилище, нямат статистически значима промяна в експресията на който и да е отделен ген, когато са коригирани за множество тестове (Фигура 1B , ляв панел). За разлика от това, по време на 2 часа NMP, 956 гена бяха регулирани нагоре и 353 гена бяха регулирани надолу (Фигура 1B, десен панел). След това оценихме промените в експресията на групи от гени в рамките на общ път, сравнявайки десетки или стотици гени, а не всеки отделен ген, като по този начин допълнително намалихме ефекта от биологичната междуиндивидуална вариация върху анализа. Това разкрива промени във функционално важни пътища, където експресията на всеки отделен ген в рамките на този път не е променена с достатъчна величина, за да достигне статистическа значимост. Този анализ на обогатяване на набор от гени (GSEA) показа, че хладилното съхранение има значително въздействие върху редица метаболитни пътища (Фигура 1C, ляв панел). По-специално, имаше значително намаляване на гените, участващи в окислителното фосфорилиране (OXPHOS), ключов път, необходим за генериране на ATP.19 За разлика от това, OXPHOS беше сред пътищата, значително регулирани нагоре по време на NMP (Фигура 1C, десен панел), с потенциални ползи за жизнеспособността на клетките и възстановяването на клетъчната хомеостаза. В допълнение, редица пътища, участващи в имунни или възпалителни процеси, са индуцирани по време на NMP, като "TNF сигнализиране чрез NFkB" демонстрира най-голямо увеличение. В съответствие с това, TNF, както и IL1B и хемокините CXCL8 (IL8) и CXCL2, набиращи неутрофили, са сред най-регулираните гени в 2-часови NMP биопсии (Фигура 1D). Анализът на струните на 50-те най-високо регулирани гена разкрива повишена регулация на биохимично свързани гени, които са групирани в четири основни възела; IL8 и хемокини, набиращи неутрофили, гени, свързани с инфламазома, NFkB сигнализиране и транскрипционна регулация (Фигура 1E). Трябва да се отбележи, че DBD и DCD бъбреците са транскрипционно сходни в началото (Фигура S2C), а генните пътища, променящи се по време на NMP, са сходни в DBD и DCD бъбреците (Фигура S2D). Заедно нашият анализ показва, че по време на NMP има повишена експресия на гени, които насърчават генерирането на енергия, с потенциално благоприятни ефекти за органа, но едновременно индуциране на провъзпалителни гени, което може да бъде вредно.

Екстракт от Cistanche tubulosa: подобрява бъбречната функция

2.3. Гени на възпалителния път в бъбреците на NMP, свързани с продължителна забавена функция на присадката

За да свържем транскрипционните промени, настъпващи по време на хладилно съхранение и NMP, с клиничните резултати, ние извършихме RNA-Seq върху биопсии, взети от 33 DCD бъбрека, които са били подложени на NMP като част от рандомизирано клинично изпитване, оценяващо в момента неговата ефикасност.17 Пробите бяха налични на подгрупа от бъбреци, рандомизирани в групата на NMP на изследването, която впоследствие беше трансплантирана (Таблица S3, Фигура S1). DGF е по-често при DCD бъбреци и класически се определя като изискване за диализа през първата седмица след трансплантацията. Въпреки това, в периода непосредствено след трансплантацията, някои пациенти получават един епизод на диализа за хиперкалиемия, което не отразява непременно наличието на значителна остра тубулна некроза. Затова използвахме модел, корелиращ генната експресия с времето между операцията по трансплантация и последната сесия на диализа (т.е. продължителността на DGF). Това показа по-забележими транскрипционни промени в трансплантатите, изискващи диализа след първите 24 часа след трансплантацията (Фигура 2А), както и значителна положителна корелация между експресията на гени на възпалителни пътища, включително "TNFA сигнализиране чрез NFkB" и пътища на "възпалителен отговор" и дължината на DGF, с по-голямо обогатяване на тези пътища в бъбреците, които са имали по-продължителен DGF посттрансплантация (Фигура 2B). Обратно, дължината на DGF отрицателно корелира с големината на експресията на гените на пътя на "OXPHOS" (Фигура 2В). Взети заедно, тези данни показват, че след NMP, бъбреците, които имат по-ниска експресия на гени на възпалителния път и по-висока експресия на гени на "OXPHOS" пътя, са по-малко податливи на удължен DGF след трансплантация. Това би подкрепило заключението, че молекулярните промени, възникващи по време на NMP, могат да имат както полезни (индуциране на гени на OXPHOS пътя), така и вредни (индуциране на гени на възпалителни пътища) ефекти.

2.4. Отделянето на урина и бъбречният кръвен поток по време на NMP демонстрират различни асоциации с OXPHOS и гените на възпалителния път

Количеството урина, произведена по време на NMP, е един от редицата параметри, включени в оценките за оценка на хирургичното качество, използвани за насочване на решенията за използване на органи,15 но дали високото отделяне на урина по време на NMP наистина предвещава добра прогноза за бъбрека и основните молекулярни пътища, активирани в бъбреци с високо отделяне на урина е неясна. В общо 10 бъбрека, подложени на NMP (бъбреци само за NMP, Таблица S1 и S2, Фигура S1), наблюдавахме диапазон на отделената урина от 0 до 340 ml за 2-часовия период на перфузия (Фигура 3A ляв панел). Трябва да се отбележи, че когато сравнихме пътищата, променящи се по време на NMP в пет бъбрека в два независими експеримента, ние открихме, че са индуцирани подобни пътища (Фигура S3A), потвърждавайки възпроизводимостта на нашия експериментален дизайн и ползата от сравняване на пътища, а не на отделни гени. В 2-часови постперфузионни биопсии експресията на 11 гена значително корелира с обема на урината, произведен през този период. Те включват протеини на топлинен шок (HSPs), HSPA1A, HSPA1B и HSPH1, които положително корелират с увеличеното отделяне на урина (Фигура 3A десен панел). Анализът на обогатяване на набор от гени показа, че отделянето на урина също корелира положително с гените на пътя на "TNF сигнализиране чрез NFkB" и отрицателно корелира с OXPHOS гените в постперфузионни биопсии (Фигура 3B, S3C). По подобен начин, при биопсии преди перфузия, OXPHOS корелира отрицателно с отделянето на урина в тези бъбреци, докато пътищата, свързани с имунната активация, включително "TNF сигнализиране чрез NFkB" и "отхвърляне на алографта", корелираха положително с отделянето на урина, което предполага, че NMP има малък ефект върху тези процеси , или по други анализирани пътища, при бъбреци с високо отделяне на урина (Фигура 3B, S3C-D). Тъй като индукцията на гени на възпалителния път е наблюдавана в нашите клинични проби с удължен DGF (Фигура 2B), тези данни оспорват догмата, че високото отделяне на урина възниква при по-жизнеспособни, „здрави“ бъбреци и предполагат, че всъщност тези бъбреци може да имат повече възпалителен потенциал, са по-малко способни да генерират енергия и това не се променя съществено по време на NMP.

Бъбречният кръвен поток по време на перфузия също е оценен като параметър, който може да отразява последващата трансплантационна функция.15 В 10-те изследвани бъбрека, бъбречният кръвен поток на 2 часа перфузия варира от 14,1 до 168,8 ml/минута (Фигура 3C ляв панел). В 2-часови постперфузионни биопсии, осем гена значително корелират положително с увеличаването на бъбречния кръвен поток (Фигура 3C десен панел), включително HSPA1L, но няма пряко припокриване между този списък с гени и тези, корелиращи с отделянето на урина (Фигура 3A ). Анализът на обогатяване на набор от гени показа, че високият бъбречен кръвоток корелира положително с OXPHOS гените в 0-часови биопсии, но за разлика от тези с най-голямо отделяне на урина, перфузията има значително въздействие, което води до отрицателна корелация с "OXPHOS" гени на пътя с 2 часа (Фигура 3D, Фигура S4A-B). Бъбречните кръвни потоци са в отрицателна корелация с редица имунни и възпалителни генни пътища както в 0-, така и в 2-часови биопсии (Фигура 3D, Фигура S4B), за разлика от отделената урина (Фигура 3B, Фигура S3C). Заедно тези данни предполагат, че бъбречният кръвен поток и отделянето на урина може да не са еквивалентни показатели за по-жизнеспособен бъбрек, но че първият може по-вярно да идентифицирабъбрекпо-малко вероятно е да имате удължен DGF.

полза и странични ефекти от цистанхе: противовъзпалително

2.5. Добавянето на хем-адсорбер към перфузионната верига няма ефект върху параметрите на перфузията, но значително намалява експресията на възпалителния ген, включително NLRP3 и IL1B

Анализи набъбрекперфузат са показали значително повишаване на концентрацията на провъзпалителни цитокини и хемокини по време на курса на хипотермия и NMP. 20, 21 Тези биоактивни молекули рециркулират в бъбреците с потенциал да индуцират допълнително възпаление. Като се има предвид, че нашият анализ на трансплантиранибъбрекпроби показват, че индукцията на TNF-зависими гени в NMP бъбреците е свързана с DGF (Фигура 2B), ние предположихме, че отстраняването на цитокини и хемокини от перфузионната верига може да намали възпалителната генна индукция, с потенциални благоприятни ефекти за бъбреците. Такъв подход показа известна ефикасност при пациенти със синдром на системен възпалителен отговор, 22, 23, и беше свързан с повишен бъбречен кръвен поток в свински бъбреци, подложени на NMP. 18 За да тестваме това в човешки бъбреци, взехме допълнителни пет двойки бъбреци и извършихме NMP за 4 часа с биопсии, взети на 0, 2 и 4 часа (Фигура S1). Във всеки случай, цитозолен хем-адсорбер (НА), който премахва молекули с молекулно тегло 10-50 kDa, беше добавен към перфузионната верига на един бъбрек във всяка двойка (NMP плюс HA) (Фигура 4А). Както се очакваше, добавянето на НА доведе до по-ниски концентрации на различни цитокини в перфузата (Фигура 4В), но няма ефект върху бъбречния кръвен поток, отделянето или състава на урината, консумацията на кислород и киселинно-алкалната хомеостаза (Фигура 4С, Таблица S4, S5). По този начин, в продължение на 4 часа NMP, HA не оказа влияние върху перфузионните параметри, използвани в момента клинично за генериране на резултати за оценка на качеството, но имаше съществен ефект върху генната експресия; След NMP, 1794 и 4026 гени бяха регулирани нагоре съответно на 2 и 4 часа, включително TNF и IL6 (Фигура 4D, E). но само половината от този брой (n=898 и n=2606) бяха увеличени, когато HA присъстваше (Фигура 4D, Фигура S5A и B). Броят на регулираните надолу гени също беше намален чрез добавянето на НА (Фигура 4D). След 4 часа NMP, 46 гена бяха значително повишени и 181 понижени с добавянето на HA (Фигура 4F). Този атенюиран транскрипционен отговор включва гени, свързани с активиране на инфламазома на NLRP3, като IL1B, NLRP3 и CASP1 (Фигура 4G, Фигура S4B) и някои хемокини, набиращи неутрофили (Фигура S5C), преди това свързани с увреждане на бъбреците при животински модели. 24, 25 Това показва, че разтворимите медиатори, освободени отбъбрекрециркулират и стимулират de novo експресия на възпалителни гени в органа, но това може да бъде облекчено чрез отстраняването им от перфузионната верига.

ФИГУРА 4 Добавянето на хем-адсорбер към нормотермичната машинна перфузионна верига има съществени ефекти върху нивото на цитокини в перфузата и транскриптома, но не и върху физическите параметри, записани на платформата. Чифт човешки бъбреци са взети от един и същ донор, единият от двойката е подложен на стандартния протокол за нормотермична машинна перфузия (NMP) за 4 часа, а другиятбъбрекпремина през NMP с добавяне на хем-адсорбер към веригата. Бяха взети проби за RNA-Seq преди перфузията (0 часа), след 2 часа и в края (4 часа). B, Концентрация на ключови цитокини в перфузата след 4 часа NMP. Линията показва двойки бъбреци. Измерванията на цитокини се нормализират до общото съдържание на протеин в перфузата. Посочената P-стойност е от тестване на двоен t-тест за намаляване на цитокините с добавяне на НА. C, Производство на урина и бъбречен кръвоток (RBF) през времевия ход на перфузията. Зелената линия показва само NMP, а оранжевата с добавяне на хем-адсорбер. D, диаграма на Venn, показваща броя на гените, значително диференцирано изразени при сравняване на пробите от 2-hr или 4-hr с пробите преди (0-hr). Червените диаграми са регулирани нагоре гени, а сините - регулирани надолу. Пресечната точка са гените, които се експресират с уважение в двете времеви точки в една и съща посока. E, log2 нормализирани стойности на експресия за посочените гени през перфузия от тъканния транскриптом, показани са стандартни ленти за грешки. F, Графика на вулкан за сравнение по двойки на NMP самостоятелно с NMP плюс HA на 4 часа. Червеното показва диференциално експресирани гени с коригирана P-стойност<0.05. g,="" as="" for="">

лечение на бъбречни заболявания екстракт от цистанче

2.6. HA, свързана с намаляване на генния подпис, свързан със забавена функция на присадката

Анализът на обогатяване на набор от гени показва значително намаляване на пътя на "TNF сигнализиране чрез NFkB" в NMP плюс HA бъбреци в сравнение с NMP самостоятелно (Фигура 5A-B). Трябва да се отбележи, че присъствието на НА не само намалява възпалителната генна експресия в рамките набъбрекно също така повишен OXPHOS и пътищата на метаболизма на мастни киселини, като и двата допринасят за генерирането на енергия (Фигура 5A-B). Следователно, промените в пътищата на генна експресия, настъпващи с HA, биха подкрепили заключението, че ефектите му са клинично полезни, тъй като намалява "TNFA сигнализирането чрез NFkB" гените на пътя и увеличава "OXPHOS" гените на пътя, като и двата са свързани с по-къс продължителност на DGF (Фигура 2B).

За по-нататъшно изследване на връзката между транскрипционните промени в NMP и клиничните резултати, ние се опитахме да излекуваме генен подпис, присъстващ в бъбреците с DGF. Идентифицирахме първите 100 положително (НАГОРЕ) и отрицателно (НАДОЛУ) регулирани гени (класирани по логаритмична промяна на гънките), които корелираха с дължината на DGF в 33 проби от клинични изпитвания (Фигура 5C, Данни S1). Открихме значително обогатяване на генния подпис, свързан с увеличена дължина на DGF в проби с по-високо отделяне на урина (Фигура 5D), което предполага, че високото отделяне на урина по време на NMP идентифицира бъбреците, изложени на риск от по-продължителен DGF. Няма статистически значима корелация между подписа на DGF и гените, свързани с по-високия бъбречен кръвен поток (Фигура 5E). След това оценихме дали и как добавянето на HA към NMP веригата повлия на експресията на DGF "UP" и "DOWN" генни подписи. Забележително е, че това показва, че експресията на генния подпис, свързан с увеличената дължина на DGF, е значително намалена чрез добавянето на HA, а подписът, свързан с намалената дължина на DGF, е значително увеличен чрез добавянето на HA (Фигура 5F).

Като цяло, транскрипционните промени, които идентифицирахме, предполагат, че NMP има потенциални ползи пред хладилното съхранение по отношение на неговите ефекти върху генерирането на енергия в бъбреците. Въпреки това, по време на перфузия, някои биоактивни молекули се освобождават от бъбрека в перфузионната верига, генерирайки усилваща верига, която предизвиква възпаление, когато навлязат отново в бъбрека. Отстраняването на тези молекули прекъсва този цикъл и може да бъде полезно за намаляване на възпалението и увеличаване на генерирането на енергия, като допълнително засилва благоприятните ефекти на NMP и намалява чувствителността към DGF (Фигура 6).

ФИГУРА 5 Добавянето на хам-адсорбер намалява DGF-свързания генен подпис. Анализ на GSEA на ефекта от добавянето на НА към транскриптома след 4 часа NMP срещу отличителния път на генетите. Начертават се само значими пътища. Червените точки показват положително обогатяване, а сините - отрицателно, размерът на точката е обратно пропорционален на стойността на FDR q и позицията показва нормализирания резултат на обогатяване (NES). B, Графики на обогатяване от GSEA за ключови пътища от базата данни на Hallmark за сравнение от A. Линията показва текущия резултат на обогатяване, а диаграмата на цигулката показва разпределението на гените-членове на генетичния набор в класирания генен списък, използван във всеки анализ. C, Heatmap на първите четири най-големи положителна (UP) и отрицателна (DOWN) корелация с дължината на DGF и използвана като част от сигнатурата на генната експресия за DGF. Пълен DGF подпис, даден в допълнителни данни. DF, свързаната с DGF генна сигнатура беше използвана с GSEA за изследване на експресията на сигнатурата в корелацията на 2-hr отделяне на урина с 2-hr транскриптом (D), корелация на 2-hr RBF с 2-hr транскриптом (E) и ефектът от добавянето на НА върху транскриптома на 4 часа (F). Парцели като за А

ФИГУРА 6 Графично обобщение. A, По време на студено съхранение има глобално намаляване на транскрипцията. По време на NMP експресията на гени в редица пътища се регулира нагоре, включително оксидативно фосфорилиране (OXPHOS) и гени на възпалителни пътища като TNF, IL8 и NFkB. B ляв панел, По време на NMP възпалителните медиатори (жълти кръгове) се освобождават отбъбрекв перфузионния разтвор. Те рециркулират и стимулират провъзпалителната генна транскрипция в бъбреците и са свързани с намаляване на гените за производство на енергийни пътища, намалявайки ATP. Десен панел, Наличието на хем-адсорбер (НА) прекъсва тази възпалителна верига на усилване

Билка цистанче, подобряваща функцията на бъбреците

3. ОБСЪЖДАНЕ

Нашите данни показват, че хладилното съхранение е ефективно за ограничаване на съществени промени в генната експресия. Това е в съответствие с моделите на гризачи, където бъбреците, съхранявани до 18 часа в хладилни помещения, показват малка промяна в експресията на провъзпалителни цитокини, включително IL1, TNF и IL6.26 Използването ни на безпристрастно, глобално транскрипционно профилиране вместо измерването на малък брой кандидат-гени ни позволи да анализираме експресията на групи от гени, открити в специфични пътища. Това разкрива значително намаляване на експресията на OXPHOS и гените на пътя на гликолизата в бъбреците, съхранявани на студено, което потенциално намалява капацитета на тези бъбреци да генерират АТФ, в съответствие с предишно проучване, показващо намалено ниво на АТФ в бъбреците, съхранявани на студено.27 Редица на провъзпалителните пътища също са били регулирани надолу по време на хладилно съхранение, включително активиране на TNF чрез NFkB и пътища на реактивни кислородни видове, които могат да бъдат потенциално полезни. Въпреки това, може да се окаже, че хладилното съхранение просто поставя временно задържане на тези пътища и че след реперфузия в реципиента ще настъпят подобни промени във възпалителната генна експресия, както се наблюдава при NMP.

NMP имаше противоположния ефект на студеното съхранение върху OXPHOS и гените на пътя на гликолизата, увеличавайки тяхната експресия, с потенциала да увеличи клетъчния капацитет за генериране на АТФ и възстановяване на хомеостазата. Трябва да се отбележи, че хипотермичната кислородна перфузия на човешки бъбреци също е показала, че повишава нивата на АТФ в сравнение със съхранението в студено 27, следователно възстановяването на оксигенацията може да бъде основният стимул за тези процеси, а не нормотермията. Независимо от това, тези промени вероятно ще бъдат полезни за органа, като се има предвид нашето наблюдение на отрицателна корелация между повишената експресия на гените на OXPHOS пътя и удължения DGF.

Скорошна статия от Hameed et al28 също извърши транскриптомичен анализ на NMP в три бъбрека, подложени на NMP. За съжаление, авторите не направиха своите данни публично достъпни, поради което не е възможно задълбочено сравнение с нашия набор от данни. Въпреки това, техният ръкопис показва индукция на гени, свързани с имунния отговор по време на NMP, включително IL1B, CXCL2 и TNF, което е в съответствие с нашите открития.

В нашия анализ на бъбреци, подложени на NMP в контекста на клинично изпитване, ние корелирахме сигнатурите на генната експресия с дължината на DGF, а не с честотата на DGF (дефинирана като необходимост от диализа в рамките на първата седмица след трансплантацията). Трябва да се отбележи, че бъбреците с продължителност на DGF от 1 ден или по-малко са силно транскрипционно подобни на тези без DGF, което вероятно отразява необходимостта от диализа поради свързана с пери-оперативна хиперкалиемия, а не на добросъвестна DGF. Ние открихме, че по-дълъг DGF е свързан с по-висока експресия на TNFA сигнализиране чрез гени на пътя на NFkB и по-ниска експресия на гени, свързани с OXPHOS. Тези данни предполагат, че бъбреците с повишен OXPHOS и намалено имунно сигнализиране могат да представят по-добър потенциал като бъбреци на донори, но това заключение изисква валидиране в по-голямо проспективно проучване.

Ние също така оценихме молекулярните процеси, които корелират с отделянето на урина и бъбречната кръв по време на NMP. Тези параметри са били използвани преди това, заедно с редица други мерки, за генериране на резултат за оценка на качеството на перфузирани бъбреци. Счита се, че високите стойности на отделянето на урина и бъбречния кръвен поток отразяват по-жизнеспособна присадка.15 Нашите данни разкриват, че пътищата, корелиращи с високото отделяне на урина и високия бъбречен кръвен поток, се различават и всъщност тези параметри демонстрират полярно противоположни асоциации с възпалителни пътища . Високото отделяне на урина се свързва с по-висока експресия на гени на имунния път, докато високият бъбречен кръвоток е отрицателно свързан с тези пътища. Ние също така открихме, че генният подпис на DGF, който генерирахме, е обогатен в бъбреците с високо отделяне на урина по време на NMP, което предполага, че този параметър може да идентифицира бъбреците, изложени на риск от по-дълъг DGF, за разлика от настоящата догма. Едно потенциално обяснение е, че много високото отделяне на урина отразява бъбреците с повече тубулни увреждания, които нямат способността да концентрират урината. По този начин може да има "ефект на Златокоска" по отношение на отделянето на урина, където бъбреците с ниско/малко отделяне на урина са тези със значителни аномалии в генерирането на филтрат, тези с много високо отделяне на урина имат значително тубулно увреждане, което изключва концентрацията на урина. Тази хипотеза трябва да бъде тествана в по-голям брой бъбреци, които впоследствие са били трансплантирани.

По време на 4 часа NMP имаше индукция на възпалителни гени в бъбрека. Заслужава обаче да се отбележи, че текущата клинична практика включва само 1 час NMP и този ефект може да не се прояви при по-кратко време на перфузия. Въпреки това, по-дългата перфузия може да има ползи по отношение на възстановяването на оксигенацията и генерирането на енергия и в нашия експеримент отрицателните ефекти от индукцията на имунния ген могат да бъдат значително отхвърлени чрез въвеждането на цитозол HA в перфузионната верига. Тези данни показват, че възпалителните медиатори, генерирани от бъбрека по време на хода на NMP, навлизат в перфузионната верига и са способни да изострят стерилното възпаление и че тяхното отстраняване подобрява индукцията на гените на пътя на възпалението, наблюдавани по време на NMP. Важно е, че ние показахме, че добавянето на HA засяга експресията на гени, които са свързани с по-лоши клинични резултати. Нашият DGF генен подпис е получен от проби, подложени на NMP като част от клинично изпитване, оценяващо неговата ефикасност, което ни позволява да свържем стабилно промените, които наблюдавахме в нашите сдвоени бъбречни проучвания, с клинични крайни точки в бъбреци, подложени на трансплантации. Въпреки това, приложението му в контекста на клинично изпитване ще бъде необходимо, за да се докаже окончателно ползата от приложението му върху бъбреци преди трансплантация. НА е неспецифична и може да премахне молекули, които са полезни, в допълнение към тези, които са вредни за органа. Ние открихме, че нетният ефект на НА върху бъбречния транскриптом изглежда полезен, но може да се окаже, че усъвършенстването за специално премахване на доказани, вредни медиатори може да бъде дори по-ефективно.

Двойките бъбреци, които използвахме, бяха от един и същ индивид и следователно бяха генетично идентични и са преживели подобна среда през целия живот на донора. Ние потвърдихме, че транскриптомът им за време 0 е изключително подобен (Фигура S2 A, B). Тези биопсии обаче вземат проба от малка част от бъбрека и двойките бъбреци могат да бъдат асиметрично засегнати от патология, например кисти или заболяване на малките съдове. Допълнително предупреждение е, че всички бъбреци, използвани в интервенционните експерименти, представени тук, са били отказани за трансплантация и някои представляват трансплантирани органи в долния край на качествения спектър. Въпреки това, ние наблюдавахме силно възпроизводими резултати при сравняване на генни пътища в групи от пет бъбрека. Успяхме също така да демонстрираме, че бъбреците от DCD и DBD имат подобен отговор на перфузията. Като комбинираме това с нашия подбран DGF подпис след NMP, успяхме да предвидим потенциални клинични ползи. Този експериментален подход може да се използва като предклиничен инструмент за скрининг на бъдещи интервенции за потенциална терапевтична ефикасност, за да се даде възможност за рационален подбор на кандидат интервенции за клинични изпитвания.

В обобщение, нашето проучване предоставя първия глобален транскрипционен профил на човешки бъбреци, подложени на NMP, разрешавайки различните молекулярни пътища, които се активират в NMP в сравнение с хладилното съхранение, и показва, че вредните ефекти на биоактивните молекули, произведени или освободени от бъбрека по време на NMP, могат да се обърне чрез добавяне на НА. Освен това, тази интервенция намалява експресията на гени, свързани с удължен DGF, осигурявайки силна механистична обосновка за прилагане на такава интервенция към бъдещо клинично изпитване. Нашите данни също имат значение за стратегиите за перфузия извън бъбреците, включително при трансплантация на черен дроб и бял дроб, което предполага, че отстраняването на биоактивни молекули от перфузатите трябва да се изследва в тези контексти, където NMP се използва все повече. И накрая, нашето проучване подчертава полезността на глобалното транскрипционно профилиране в двойкабъбрециза оценка на нови интервенции на перфузирани органи; транскрипционните промени предшестват промените в изобилието на протеини (традиционно използвани като биомаркери набъбрекнараняване) и десетки хиляди генни транскрипти могат лесно да бъдат измерени. По този начин измерването на РНК има потенциала да осигури ранно, чувствително отчитане на клетъчната функция на човешки органи, извлечени за трансплантация, което може да се приложи към бъдещи изследвания.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторите благодарят на всички донори на органи и техните семейства. Лабораторията Clatworthy е благодарна за основните съоръжения, предоставени от Лабораторията по молекулярна биология на MRC. Тази работа е извършена с помощта на ресурси, предоставени от Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3), управлявана от University of Cambridge Research Computing Service, предоставена от Dell EMC и Intel, използвайки Tier-2 финансиране от Изследване на инженерни и физически науки Съвет (капиталова субсидия EP/P020259/1) и финансиране от DiRAC от Съвета за научни и технологични съоръжения (www. Dirac. ac. Обединеното кралство).

РАЗКРИВАНЕ

Авторите нямат конфликт на интереси за разкриване, както е описано в American Journal of Transplantation.

АВТОРСКИ ПРИНОС

JRF, SH, MLN и MRC разработиха проучването и интерпретираха данните. JRF, SH, TM, CJW, AF и TCD извършиха експериментите. JRF, SH и MRC създадоха фигури и таблици. MRC написа основния ръкопис. JRF и SH създадоха методите и фигурните легенди, JRF, SH и MLN редактираха ръкописа.

Полза от Cistanche: подобряване на бъбречната функция

Препратки:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. Бъбречният регистър на Обединеното кралство, 19-ти годишен доклад: Глава 5 Преживяемост и причини за смърт при възрастни пациенти в Обединеното кралство на бъбречна заместителна терапия през 2015 г.: Национални и специфични за центъра анализи. Нефрон. 2017; 137 (1): 117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, et al. Анализ на факторите, които влияят върху изхода след трансплантация на бъбреци, дарени след сърдечна смърт в Обединеното кралство: кохортно проучване. Ланцет. 2010; 376 (9749): 1303–1311.
3. Съмърс Д.М., Джонсън Р.Дж., Хъдсън А., Колет Д., Уотсън К.Дж., Брадли Дж.А. Ефект от възрастта на донора и времето за съхранение в хладилни условия върху резултата при реципиенти на бъбреци, дарени след циркулаторна смърт в Обединеното кралство: кохортно проучване. Ланцет. 2013; 381 (9868): 727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Възпалителни клетки при исхемична остра бъбречна недостатъчност.БъбрекВътр. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Rock KL. Как умиращите клетки предупреждават имунната система за опасност. Nat Rev Immunol. 2008; 8 (4): 279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Имунотерапия при острибъбрекнараняване. Имунотерапия. 2012; 4 (3): 1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Следоперативните биомаркери предсказват остърбъбрекнаранявания и лоши резултати след сърдечна хирургия при възрастни. J Am Soc Nephrol. 2011; 22 (9): 1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, et al. IL-18 и NGAL в урината прогнозират диализа и възстановяване на присадката след товабъбректрансплантация. J Am Soc Nephrol. 2010; 21 (1): 189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Биомаркерите на забавената функция на присадката като форма на острабъбрекнараняване вбъбректрансплантация. Sci Rep. 2015; 5: 11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Първата бъбречна трансплантация при мъж след ех vivo нормотермична перфузия. Трансплантация. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Ex-vivo нормотермична перфузия при бъбречна трансплантация: минало, настояще и бъдеще. Curr Opin трансплантация на органи. 2016; 21 (3): 301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, et al. Обсервационно проучване на донорска белодробна перфузия Ex Vivo при белодробна трансплантация в Обединеното кралство: DEVELOP-UK. Health Technol Assess. 2016; 20 (85): 1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, et al. Стандартно получаване на донорски бели дробове с нормотермична белодробна перфузия ex vivo: Проспективно рандомизирано клинично изпитване. J Трансплантация на сърце и бял дроб. 2017; 36 (7): 744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. Рандомизирано проучване за нормотермично запазване при чернодробна трансплантация. Природата. 2018; 557 (7703): 50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, et al. Използване на Ex Vivo нормотермична перфузия за оценка на качеството на изхвърлени човешки донорски панкреаси. Am J трансплантация. 2015; 15 (9): 2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Успешна трансплантация на човешки бъбреци, считани за нетрансплантируеми, но реанимирани чрез Ex Vivo нормотермична машинна перфузия. Am J трансплантация. 2016; 16 (11): 3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Протокол от рандомизирано контролирано, отворено изпитване на ex vivo нормотермична перфузия спрямо статично студено съхранение при донорство след бъбречна трансплантация със смърт на кръвообращението. BMJ Open. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Хемоадсорбцията намалява възпалителния отговор и подобрява кръвния поток по време на ex vivo бъбречна перфузия в експериментален модел. J Transl Med. 2017; 15 (1): 216.
19. Кребс HA. Историята на цикъла на трикарбоксилната киселина. Perspect Biol Med. 1970; 14 (1): 154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Стойността на концентрацията на биомаркера за машинна перфузия в DCDбъбректрансплантации. Трансплантация. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, et al. Протеини в консервираща течност като предиктори на забавена функция на присадката в бъбреците от донори след циркулаторна смърт. Clin J Am Soc Nephrol. 2017; 12 (5): 817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Хемоадсорбция от CytoSorb при септични пациенти: серия от случаи. Критична грижа. 2017; 21 (1): 74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Ефект от екстракорпоралното отстраняване на цитокини върху функцията на съдовата бариера при пациент със септичен шок. J Интензивно лечение. 2017; 5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, et al. IL-17, произведен от неутрофили, регулира медиираната от IFN-гама неутрофилна миграция при мишкабъбрекисхемично-реперфузионно увреждане. J Clin Invest. 2010; 120 (1): 331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, et al. Благоприятен ефект на инхибитор на неутрофилна еластаза върху бъбречна топла исхемия-реперфузионно увреждане при плъхове. трансплантация Proc. 2006; 38 (7): 2201–2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, et al. Сравнение на възпалителни, цитопротективни и профили на генна експресия на увреждане в бъбреците от донори с мозъчна смърт и сърдечна смърт. Трансплантация. 2014; 98 (1): 15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, et al. Стратегии за възстановяване на нивото на аденозин трифосфат (ATP) след повече от 20 часа време на студена исхемия при маргинални човешкиБъбрекПрисадки. Ан Трансплант. 2018; 23: 34-44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, et al. Кратка нормотермична машинна перфузия подмладява изхвърлените човешки бъбреци. Директно трансплантиране. 2019;5(11):e502.