Дихотомичните реакции към хроничната фетална хипоксия водят до предварително определен фенотип на стареене Ⅰ
Nov 29, 2023
Накратко
Използвайки протеомиката отдолу нагоре и бъбреците като парадигма, ние докладваме интегративна перспектива на клетъчните реакции към хроничната фетална хипоксия, разкривайки фундаментални механизми на феталното програмиране на теорията за болестите при възрастни, които са принципно приложими за всички други органи в тялото. Характерният тъканен и серумен биомаркер proфиle ще насърчи разработването на нови терапевтични подходи за противодействие на фенотипа на преждевременното стареене, който изглежда е свързан с феталното програмиране нахронични болести.
Акценти
• Хроничната фетална хипоксия предизвиква широко разпространени промени в експресията на протеини.
• Потиснатата репликация и транслация ограничават образуването на нови нефрони.
• Множество пътищапредопределят фенотип на стареенеоще по време на разработката.
• Синергия на ветвъзпалителни увреждания, неефективно възстановяване и променен метаболизъм.
• Намалено изобилие от протеини против стареенеклото и сиртуин 6 при мишки и хора.
Индуцираното от хипоксия вътрематочно ограничаване на растежа увеличава риска отсърдечно-съдови, бъбречна, и другихронични заболявания при възрастни, което представлява сериозен проблем за общественото здраве. Все пак не се знае много за феталните механизми, които предразполагат тези индивиди към заболяване. Използвайки предварително валидиран миши модел на фетална хипоксия и протеомика отдолу нагоре, ние характеризираме реакцията на феталния бъбрек към хроничен хипоксичен стрес. Феталните бъбреци показват дихотомна реакция на хронична хипоксия, включваща от една страна клетъчни адаптации, които насърчават оцеляването (гликолиза, аутофагия и намален ДНК и протеинов синтез), но от друга процеси, които индуцират подобен на стареене фенотип (инфилтрация на възпалителни клетки , увреждане на ДНК и намалена пролиферация). Важно е, че хроничната хипоксия също така намалява експресията на протеините против стареене klotho и Sirt6, механизъм, който е еволюционно запазен между мишки и хора. Взети заедно, ние разкриваме, че предварително определеното стареене по време на развитието на плода е ключово събитие вхронична хипоксия, установявайки солидна основа за хипотезата на Баркър за фетално програмиране на болести при възрастни. Този фенотип е свързан с характерен биомаркерен профил в тъканни и серумни проби, който може да се използва за откриване и насочване на ускореното стареене вхронични хипоксични човешки заболявания.
Теорията на Баркър за феталното програмиране на заболяванията при възрастни (1, 2) гласи, че неблагоприятните събития по време на развитието увеличават риска от множество хронични заболявания в зряла възраст, включителнохипертония,захарен диабет,обструктивна белодробна болест, илихронично бъбречно заболяване(CKD). В нашето постоянно застаряващо общество тези разстройства налагат огромна икономическа тежест, която прогресивно расте поради нарастващия брой пациенти, страдащи от едно или повече от тези разстройства. Сред тези,ХБНикраен стадий на бъбречно заболяване(ESRD) не само представляват независими рискови фактори за сърдечно-съдова заболеваемост и смъртност, но също така генерират нарастващи разходи за бъбречни заместителни терапии, което ги прави основен проблем за общественото здраве. Сред стратегиите за справяне с тази тенденция решаваща роля играе изясняването на механизмите, които свързват теорията на Баркър и развитието на ХБН. Правдоподобно обяснение за постепенната загуба на бъбречна функция при потомство с ниско тегло при раждане предполага създаването на порочен кръг, въртящ се между намалена повърхност на бъбречна филтрация, повишено натоварване на останалите нефрони и допълнително увреждане, което отновонамалява капацитета на филтриране(Brenner's hypothesis) (3). A common finding in intrauterine growth restriction (IUGR) babies is the reduced number of nephrons formed at the end of kidney development (4). Thus, a low nephron number at birth increases the risk for accelerated functional decline and irreversible renal tissue damage (5, 6). Among all possible intrauterine stress factors, chronic hypoxia due to placental insufficiency or pregnancy at high altitude (>2500 m надморска височина—засяга повече от 2% от световното население (7, 8)) принадлежи към най-критичните и клинично значими фактори за нарушаване на програмата за развитие на ембриона (9). Въпреки това, молекулярните механизми, чрез които хипоксията води до IUGR и нарушено бъбречно развитие, остават неразбрани и изискват по-нататъшно изследване. В това проучване ние оценихме на протеомно ниво молекулярните промени в бъбрека на плода при излагане на развиващия се миши ембрион на хроничен хипоксичен стрес и потвърдихме някои ключови открития в проби от човешки хипоксичен серум. Предоставяме съществени доказателства за набор от взаимодействащи механизми, които от една страна позволяват оцеляването на клетките при неблагоприятни условия, но от друга страна, насърчават намаления брой нефрони и фенотипа, подобен на преждевременно стареене. Допълнително показваме товаген-специфична ДНКхиперметилирането, но също и хипометилирането на ДНК допринасят за този дихотомичен отговор на хроничната хипоксия. По този начин нашите открития създават солидна основа за хипотезата на Баркър, разкривайки набор от пътища, които предопределятфенотип на стареенеоще по време на разработката.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОЦЕДУРИ
Експериментален дизайн и статистическа обосновка Целта на това проучвателно проучване беше да се разкрият промени в протеома на цели фетални бъбреци, получени от IUGR фетуси, за да се задълбочат знанията за феталните механизми, които предразполагат малки за гестационна възраст индивиди към хронични заболявания в зряла възраст. Изследването се основава на протеомично профилиране отдолу нагоре, използвайки нано-LC система, свързана с орбитален масспектрометър с висока разделителна способност. За тази цел шест E18.5 хипоксични бъбрека и шест E18.5 нормоксични бъбрека от мъже бяха използвани и анализирани в два екземпляра в контролиран експеримент по заслепен начин. Всички репликации бяха успешни, нито едно експериментално откритие не можеше да бъде възпроизведено. Данните за протеомиката бяха анализирани с помощта на софтуер MaxQuant 1.5.2.8 (включително търсачката Andromeda и пакета за статистически анализ на Perseus) и групиране на функционални анотации. За дългосрочните последици от хроничната фетална хипоксия върху бъбречната функция пет хипоксични и пет нормоксични мъжки потомци бяха избрани на случаен принцип и анализирани на 8 месеца (необходими са пет животни, за да се открие 30% намаление на GFR при фетални хипоксични животни, въз основа на вариация от 15%, алфа=0.05, мощност=0.9). Експериментът in vivo беше завършен с оценка на бъбречната фиброза и серумните маркери след 15 месеца. За потвърждаване на някои от ключовите открития на експериментите с животни бяха анализирани проби от човешки серум, които бяха събрани в предишни контролирани проучвания на здрави доброволци (10). Всички in vitro експерименти бяха анализирани и заслепени с подходящи контроли. Статистическият тест и експерименталните подробности са предоставени във всяка легенда на фигурата. Всички данни са представени и включват всички отклонения.
Животни
C57BL/6N мишки бяха закупени от лаборатории Janvier, Франция, и настанени при 23 ◦C и 50 до 60% влажност в IVC клетки със свободен достъп до храна и вода и 12-часов цикъл ден/нощ. Всички експерименти с животни са проведени съгласно швейцарския закон за хуманно отношение към животните и са одобрени от местните власти (кантон Берн BE96/11, BE105/14 и BE105/17). За разпределено време за чифтосване женските в разплод се проверяват за вагинални запушалки всяка сутрин и ако има такива, времевата точка се определя на гестационен ден (E) 0,5. Гравидните майки бяха разпределени на случаен принцип или към нормоксична контролна група (N=11), или изложени на постоянна хипоксия (N=11) в продължение на 7 дни. За индуциране на хипоксия майките в гестационен ден E11.5 се прехвърлят в хипоксична жабка (Coy Laboratory Products) и съдържанието на кислород постепенно се понижава до 10% в рамките на 3 до 4 часа. Електрически вентилатор в камерата поддържа адекватна циркулация на въздуха. Нивото на CO2 се поддържа ниско чрез хелатиране на излишния CO2 в патрони, пълни с натриева вар (Sigma, 72073), свързани към системата за циркулация на въздуха. Излишната влажност се абсорбира от силикагел оранжев гранулат (Sigma, 1.01969), сменян всеки ден. Девет майки от всяка група бяха евтаназирани при E18.5, а фетусите и плацентите бяха събрани, претеглени и подготвени за по-нататъшен анализ. Фетална кръв беше събрана от тялото на обезглавени E18.5 фетуси. Бъбреците на плода се дисектират в PBS с помощта на стереоскоп Leica M80. За дългосрочните анализи две майки бяха извадени от хипоксия няколко часа преди раждането и мъжкото потомство беше използвано за оценка на бъбречната функция (скорост на гломерулна филтрация - GFR) на 8 месеца, както е описано (11) и за оценка на бъбречна фиброза и серумни нива на клото и сиртуин 6 на 15 месеца.
Гломерулен брой
За цялостно имунофлуоресцентно оцветяване на E18.5 бъбреци, протоколът за оцветяване iDisco (12) (https://idisco.info/idisco-protocol/) с предварителна обработка с метанол беше приложен с помощта на антинефриново антитяло (R&D AF3159). Време за инкубация n=1 ден и обем на разтвора от 1,6 ml бяха използвани за съответните стъпки. Бъбреците бяха монтирани в 8-предметни стъкла за стъклени камери (Thermo Fisher, 154534) и незабавно заснети с помощта на цифров микроскоп IMIC (FEI, тип 4001) с полихромна V светлина източник, контролер за камера Orca-R2 от Hamamatsu (C10600) и софтуер за придобиване на живо (FEI, версия 2.6.0.14). Стомикрометрови Z-stack изображения на оцветени цели бъбреци E18.5 бяха анализирани със софтуера за обработка на изображения с отворен код Fiji (ImageJ, версия 2.0.0-rc69/1.52i, https:// imagej.net/ Фиджи). В приставката TrackMate v3.8.0 LoG детекторът на Downsample беше настроен на 80,0 пиксела за очаквания диаметър на петното с 16-праг на пикселите и коефициент на понижаване на дискретизацията 2. Броят на точките на кадър беше добавен, за да се изчисли броят на гломерулите на бъбрек. Беше избрано разстояние от 100 μm между кадрите, за да се избегне двойното преброяване на идентични гломерули в последователни изображения, като се има предвид среден гломерулен диаметър от 80 μm.
Транскутанна оценка на гломерулната филтрация GFR се определя при животни в съзнание, както е описано по-горе (11). Накратко, плазменият клирънс на FITC-синистрин (Fresenius-Kabi, LI9830076) се измерва през кожата с помощта на диоди, излъчващи светлина с максимум на излъчване за FITC при 470 nm и фотодиод, откриващ флуоресцентната светлина с максимална чувствителност при 525 nm. Намаляването на интензитета на флуоресценция с течение на времето след това се преобразува в GFR.
RT-qPCR Общата РНК се изолира с помощта на TRIzol реагент (Invitrogen 15596026) съгласно протокола на производителя. Концентрацията и качеството на РНК се определят със спектрофотометър Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific) и 1000 ng се транскрибират в cDNA, като се използва комплект реагент PrimeScript RT (Takara, RR037A). cDNA се разрежда до 2 ng/ul и се извършва qPCR с FAM-маркирана UPL сонда (Roche) плюс съответните генно-специфични праймери и TaqMan Fast Universal PCR Master mix (Applied Biosystems, 4352042) на 7500 Fast Real-Time PCR System (Приложни биосистеми). Анализът на данните беше извършен с Microsoft Excel. Методът 2(-ΔCt) беше използван за изчисляване на относителните нива на експресия за RT-qPCR. Последователностите на сондата и праймера са изброени в допълнителна таблица S1.
Подготовка на пробата за LC-MS/MS анализ Изолирани мъжки фетални бъбреци (n=3 за всяка група) се хомогенизират в буфер за проба (7,5 М урея, 1,5 М тиоурея, 4% CHAPS, 0.{{ 18}}5% SDS, 100 mM дитиотреитол (DTT)), използвайки ултразвукова пръчка. Концентрациите на протеин се определят с помощта на Bradford анализ (Bio Rad-Laboratories). Приложен е протокол за смилане в гел, както е описано по-рано (13, 14). Накратко, 80 ug от всяка проба бяха заредени в SDS-PAGE, което ни позволи да фракционираме пробата предварително, за да намалим нейната сложност. След фиксиране с 50% метанол/10% оцетна киселина, геловете се промиват и сенсибилизират с 0.02% Na2S2O3. След това геловете се оцветяват с 0,1% AgNO3 за 10 минути, изплакват се и се проявяват с 3% Na2CO3/0,05% формалдехид. След това всяка протеинова лента се нарязва на четири резена и се обезцветява. При редукция с DTT и алкилиране с йодоацетамид (IAA), протеините се усвояват ензимно с помощта на трипсин/Lys-C (клас MS; Promega Corporation). След смилането, пептидите се елуират, сушат и съхраняват при -20 °C до LC-MS/MS анализ.
LC-MS/MS анализ
Както беше описано по-горе (13), пептидните проби бяха възстановени в 5 ul 30% мравчена киселина (FA), съдържаща 10 fmol всеки от четири синтетични стандартни пептида и разредени с 40 ul подвижна фаза А (97.9% H2O, 2% ACN, 0.1% FA). Синтетични пептиди [Glu1-Fribrinopeptide B – EGVNDNEEGFFSAR; M28 – TTPAVLDSDGSYFLYSK; HK0 – VLETKSLYVR; HK1 – VLETK(ε-AC)SLYVR] бяха добавени във всяка проба като вътрешен контрол на качеството за наблюдение на стабилността на LC-MS-системата. След това десет микролитра от този разтвор се инжектират в Dionex Ultimate 3000 nano LC-система, свързана с QExactive orbitrap масспектрометър, оборудван с йонен източник на наноспрей (Thermo Fisher Scientific). Като стъпка на предварителна концентрация, пептидите се зареждат в 2 cm × 75 μm C18 Pepmap100 предколона (Thermo Fisher Scientific) при скорост на потока 10 ul/min, използвайки мобилна фаза А. Елуиране на пептиди от предварителна колона до 50 cm × 75 μm Pepmap100 аналитична колона (Thermo Fisher Scientific) и последващо разделяне бяха постигнати при скорост на потока от 300 nl/min, използвайки градиент от 8% до 40% подвижна фаза B (80% ACN, 19.9% H2O, 0.1% FA) за 235 min. Беше извършено масспектрометрично откриване, извършвайки MS сканиране в диапазона от m/z 400 до 1400 при разделителна способност от 70 000 (при m/z =200). MS/MS сканиранията на 12-те най-разпространени йона бяха постигнати чрез HCD фрагментация при 30% нормализирана енергия на сблъсък и анализирани в орбитапара при разделителна способност 17 500 (при m/z =200). Всички проби бяха анализирани в два екземпляра. Протеомичните данни от масовата спектрометрия са депозирани в ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) чрез партньорското хранилище на PRIDE (15) с идентификатор на набор от данни PXD018999 и 10.6019/ PXD018999.
Идентификация на протеини и без етикет
Количествено определяне (LFQ) Идентифициране на протеини, количествено определяне без етикети (LFQ), както и статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуера MaxQuant 1.5.2.8, включително търсачката Andromeda и пакета за статистически анализ Perseus (16, 17), често използван работен процес за обработка и статистическа оценка на данни от пушка протеомика. Протеините бяха идентифицирани с помощта на базата данни UniProt за мускулни протеини (версия 170428 с 16 854 записа, ограничени само до прегледани записи), толеранс на пептидна маса от 25 ppm, толеранс на MS/MS съвпадение от 2{{21 }} ppm и максимум две пропуснати разцепвания с трипсин като протеаза. Критериите за търсене допълнително включват карбамидометилиране на цистеини като фиксирана модификация, окисление на метионин, както и ацетилиране на N-терминален протеин като променливи модификации и минимум две пептидни идентификации на протеин, поне една от тях уникална. Освен това, съвпадението между сериите беше извършено с помощта на 5-минутен времеви прозорец за съвпадение и 15-минутен времеви прозорец за подравняване. И за двете, пептиди и протеини, беше приложен процент на фалшиво откриване (FDR) от по-малко от 0,01. За статистически анализ бяха извършени взаимни сравнения между нормоксични и хипоксични бъбречни проби, за да се определят протеинови групи, които бяха значително повишени или понижени при хипоксия. За тази цел, използвайки пакета за статистически анализ Perseus, бяха изчислени разликите в стойностите на LFQ. Промените в стойностите на изобилие на протеини между нормоксични и хипоксични бъбречни проби се определят чрез двустранен t-тест с p <0,05 и минимум двукратна разлика в изобилието. Всички протеини, отговарящи на тези критерии, бяха разгледани в настоящото изследване. Освен това, за да се подчертаят най-стабилните регулаторни ефекти при хипоксия, значително регулирани протеини с глобален FDR<0.05 as determined by a permutation-based method were analyzed.
Функционална анотация и групиране
Групирането на функционални анотации беше извършено с помощта на базата данни с ресурси за генна онтология (18–20) и платформата DAVID (21) (https://david.ncifcrf.gov). Протеиновите мрежи бяха генерирани с помощта на базата данни STRING (22). Стойностите на диференциална експресия между бъбреците на нормоксична и хипоксична контролна група E18.5 бяха картографирани с Heatmapper (23) (http://www.heatmapper.ca).
Имунохистохимия
Фиксирани с PFA, вградени в парафин тъканни срезове бяха рехидратирани и ендогенната пероксидаза беше блокирана чрез инкубиране на слайдовете в 1,5% разтвор на H2O2 (0.02 М лимонена киселина, 0.{ {40}}6 М Na2HPO4) при стайна температура за 15 минути на тъмно. Извличането на антиген се извършва чрез кипене в Tris-EDTA (рН 9) или буфер с лимонена киселина в продължение на 20 минути, последвано от бавно охлаждане до стайна температура. След блокиране в 2% BSA в PBS при RT за 1 час, срезовете се инкубират с първични антитела в блокиращ разтвор o/n при 4 °C (MPO, ab208670; CAV1, ab32577; и двете Abam). След три стъпки на промиване в PBS, срезовете се инкубират с HRP конюгирано вторично анти-заешко антитяло (K4003, Dako EnVision+ System от Agilent) в продължение на 1 час при RT. След три стъпки на промиване в PBS, сигналът се проявява с DAB (Agilent, K3468). Срезовете бяха насрещно оцветени, дехидратирани и монтирани с помощта на Eukitt среда (Sigma, 03989). За откриването на 8-OHdG (MOG-100P, JaICA) беше използван комплектът за имунооткриване Vector MOM (BMK-2202) според производителя. Изображенията в светло поле са получени на микроскоп Nikon E600 (обектив Plan Fluor ELWD 20×/0,45) с контролер за камера Digital Sight DS-UE и камера DS-Ri1 (и двете Nikon), използвайки софтуера на Nikon NIS Elements 4.0.
Ензимна
Количествено определяне на лактат Нивата на лактат в бъбреците E18.5 се определят след депротеинизиране на пробата с въртящи се колони, като се използва ензимен комплект MAK064- 1KT (Sigma), според производителя.
Човешки изследвания
Изследването на хора беше одобрено от Комитета по етика на Швейцарския федерален технологичен институт (EK 2011-N-51) и проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки. Накратко, информирано съгласие е получено от девет здрави жители на низините, които не пушат (осем мъже и една жена). Тези доброволци бяха последователно оценени за множество физиологични параметри преди, по време и след 4-седмично непрекъснато пребиваване на голяма надморска височина, както беше съобщено по-рано (10).
Клетъчна култура
Първични проксимални тубулни клетки (pPTCs) бяха изолирани от {{0}} до 4- седмични C57BL/6N мъжки бъбреци, както е описано по-горе (24). Накратко, проксималните тубулни фрагменти бяха получени чрез смилане на кортикална бъбречна тъкан с колагеназа и последващо филтриране през мембрана с размер на порите 250 μm и 80 μm. PTCs се култивират в DMEM/F12 (Gibco, 21041-025), допълнен с 15 mM HEPES, 0,55 mM NaPyruvate, 1% NEAA и добавки за растежна среда на бъбречни епителни клетки (REGM) (Lonza, CC-4127) . При сливане, pPTCs се разделят веднъж с помощта на разтвор на Accutase (Sigma, A6964) и се поставят отново. За хипоксия, клетъчната култура се извършва при 1% кислород за 48 часа; нормоксичните контроли се култивират при 19% кислород.
ELISA
Серумните нива на Klotho или Sirt6 бяха определени с помощта на следните комплекти за проби от мишки (CSB-E14362m, технология Cusabio и OKCD02892, Aviva Systems Biology) и човешки проби (CSB E17018h и CSB-E13235h; и двете технология Cusabio), следвайки предоставените протоколи. Кръв от фетус на мишка беше събрана от багажника на обезглавени фетуси E18.5. Кръвта на мишка от възрастни животни е взета от вената сафена. Проби от човешки серум са получени от предишно проучване (10).
Бисулфитна PCR
ДНК от животни, третирани с E18.5 хипоксия или нормоксия, се екстрахира чрез Qiagen Blood и тъканен комплект и бисулфитно преобразувана с помощта на EpiTect Bisulfite Kit от Qiagen съгласно инструкциите на производителя. Двадесет нанограма преобразувана ДНК бяха използвани като матрица в PCR реакция с AmpliTaq Gold (Invitrogen). Следните праймери са проектирани с помощта на MethPrimer 2.0: Klotho, 248 bp фрагмент (−234/+14 от TSS), Kl_BS_F (TAG TTT TAG GAA GGT AAA GGG AGT G) и Kl_BS_R (AAC AAT AAT TAT CCA AAA CAA AC) (25); Mki67, 497 bp фрагмент (~1 kb нагоре от TSS), Mki67_BS_F (TTG GAA GAA TAT TGA TTT AGG AA) и Mki67_BS{{20} }R (ACC TAT AAA CTC CCT CTC CAA AAA T). PCR продуктите бяха лигирани в pCR4-TOPO-вектор с помощта на комплекта за клониране TOPO TA за секвениране (Invitrogen) и трансформирани в DH10 бактерии. Клоновете бяха изпратени за секвениране (Microsyth Seqlab GmbH). Инспекция, подравняване, визуализация и статистика бяха извършени с QUMA инструмент за количествено определяне за анализ на метилиране (26).
Статистика
Извършен е статистически анализ и са направени графики с GraphPad Prism версия 8 (https://www.graphpad.com). Две групи бяха тествани за значимост чрез несдвоени двустранни t-тестове със или без корекцията на Welch (корекцията на Welch беше за ненормално разпределени данни, F тестът на вариациите беше статистически значим, p < 0.05). Множество групи бяха тествани с помощта на RM еднопосочна ANOVA с корекция на Geisser–Greenhouse и тест за множество сравнения на Dunnett. p стойности<0.05 were assumed significant. Means with standard deviation (SD) are shown.
Изходни данни
Необработените данни за всички експерименти, които не са резултат от масспектрометричния анализ, могат да бъдат намерени в електронната таблица Source Data File S1 в допълнителния набор от данни. Това включва данни, лежащи в основата на Фиг. 1A и D–H, Фиг. 3E и F, Фиг. 5B, Фиг. 7D–I, Фиг. 8 и допълнителни Фиг. S1 и Фиг. S6.
РЕЗУЛТАТИ
Хронична
Феталната хипоксия води до ограничен растеж на ембриони и намалена бъбречна функция при възрастни потомци. За да се изложат чифтосвани майки на постоянна хипоксия (10% кислород) в продължение на 7 дни (фиг. 1A), беше използвана хипоксична камера. Подобно на предишната ни работа (27), язовирите бързо се адаптираха към хипоксичната среда и при раждането размерът на котилото и масата на плацентата бяха подобни на нормоксичните контролни бременности (допълнителна фигура S1, A–C). Независимо от това, хипоксичните E18.5 фетуси имат намалено телесно тегло в сравнение с нормоксичните контроли, отговаряйки на критериите за IUGR (28) (фиг. 1 и допълнителна фигура S1D) и 40% намален брой нефрони (фиг. 1, C и D). Това намаление не се дължи на дегенерация на нефрон (некроза или апоптоза) по време на вътрематочно развитие при хипоксични условия, както беше съобщено по-рано (27). Освен това, въпреки значителния период на наваксване на растеж 3 седмици след раждането, който докладвахме преди (27), възрастни хипоксични потомци показват силно намалена бъбречна функция на 8 месеца (Фиг. 1E) и повишена експресия на фиброзни маркери на 15 месеца (Фиг. 1, F–H), по този начин потвърждавайки валидността на нашия подход като стабилен модел на IUGR и илюстрация на теорията на Barker за фетално програмиране на заболявания при възрастни.
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
