Ехинакозидът проявява противотуморна активност при рак на черния дроб
Mar 31, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Wen Li*, Jing Zhou, Yajie Zhang, Jing Zhang, Xue Li, Qiao Yan, Jiabing Han и Fangdi Hu*
Резюме
Заден план:Echinacoside (ECH) е основната активна съставка на Cistanches Herba, за която е известно, че има терапевтични ефекти върху метастатични тумори. Ефектите на ECH върху рака на черния дроб обаче все още са неясни. Това проучване има за цел да изследва ефектите на ECH върху агресията на раковите клетки на черния дроб.
Методи:Два вида чернодробни ракови клетки Huh7 и HepG2 бяха третирани с различни дози ECH в различно време и градиенти. МТТ и анализи за образуване на колонии бяха използвани за определяне на ефектите на ECH върху жизнеспособността на Huh7 и HepG2 клетките. Анализи Transwell и анализи на поточна цитометрия бяха използвани за откриване на ефектите от лечението с ECH върху инвазията, миграцията, апоптозата и клетъчния цикъл на Huh7 и HepG2 клетки. Използва се Western blot анализ за откриване на ефектите на ECH върху нивата на експресия на TGF- 1, smad3, smad7, протеини, свързани с апоптоза (Caspase-3, Caspase-8) и Cyto C в раковите клетки на черния дроб. Връзката между miR-503-3p и TGF- 1 беше открита с помощта на биоинформатичен анализ и луциферазен репортерен анализ.
Резултати:Резултатите показват, че ECH инхибира пролиферацията, инвазията и миграцията на Huh7 и HepG2 клетки по начин, зависим от дозата и времето. Освен това открихме, че ECH причинява Huh7 и HepG2 клетъчна апоптоза чрез блокиране на клетки в S фаза. Освен това беше установено, че експресията на miR-503-3p е намалена в чернодробните туморни тъкани, но лечението с ECH повишава експресията на miR-503-3p в Huh7 и HepG2 клетки. Освен това открихме, че TGF- 1 е идентифициран като потенциална цел на miR-503-3p. ECH насърчава активирането на сигналния път на TGF- 1/Smad и повишава нивата на експресия на Bax/Bcl-2. Освен това, ECH може да задейства освобождаването на митохондриален Cyto C и да причини реакцията Caspases grade.
Изводи:Това проучване демонстрира, че ECH проявява антитуморна активност чрез оста miR-503-3p/TGF- 1/Smad при рак на черния дроб и осигурява безопасно и ефективно антитуморно средство за рак на черния дроб.
Ключови думи: Ехинакозид, рак на черния дроб, апоптоза, MiR-503-3p, TGF- 1/smad
Cistanche е безопасно и ефективно противотуморно средство при рак на черния дроб.
Въведение
Ракът на черния дроб е един от най-честите злокачествени тумори с висок процент на заболеваемост и честотата на рак на черния дроб нараства бързо [1]. Хепатектомията е най-добрият начин за лечение на рак на черния дроб при пациенти в ранните му стадии [2]. Повечето пациенти обаче имат рецидив и метастази след операцията. Процентът на 5-годишната преживяемост е само около 3–5 процента [2]. Следователно спешно са необходими нови терапевтични подходи и средства.
През последните няколко години разработването на лекарства за рак и изследванията върху фитохимикалите започнаха да обръщат внимание на етнофармакологията [3, 4]. Голям брой клинични и експериментални проучвания показват, че лекарствените мономери могат да инхибират пролиферацията, метастазите на клетките на хепатоцелуларен карцином, да индуцират апоптоза и диференциация на ракови клетки [5]. Cistanches Herba е растение, принадлежащо към семейството на растенията, което е традиционна медицина в Китай и е известно като „пустинен женшен“ [6]. Cistanches Herba е богата на видове химически компоненти и изследователи в страната и чужбина са изолирали повече от сто съединения от нея, включително фенилетанол гликозиди, лигнани, циклоалифатни терпени, захари, аминокиселини и др. [7]. Echinacoside (ECH) е основният компонент на Cistanches Herba и обикновено се счита за негова основна активна съставка [6]. През последните години проучванията показват, че ECH може да бъде нова възможност за лечение на агресивни или широко метастатични тумори [8]. Проучванията са установили, че ECH може да инхибира рак на панкреаса, левкемия, рак на стомаха, рак на ендометриума и много други тумори [9]. Въпреки това, няма доклад за ефекта на ECH върху прогресията на рак на черния дроб.
MiPHK играят основна роля в пост-транскрипционната регулация на генната експресия (10). Обширни проучвания показват, че miPHK са тясно свързани с рак на черния дроб [11] и множествена склероза. MiR-503-3p е новооткрита miRNA, която участва в пролиферацията, миграцията и инвазията на туморни клетки [12]. Въпреки това, неговата функция при рак на черния дроб е неясна. Понастоящем изследването на миРНК надолу по веригата целеви гени е в относително зрял етап, но много целеви генни локуси остават неоткрити. Пътят на сигнална трансдукция на TGF- 1/Smad3 е особено важен за туморогенезата и развитието [13]. Установено е, че пътят на TGF- 1/Smad3 е активиран в модела на хепатома, което предполага, че пътят на TGF- 1/Smad3 играе значителна роля в развитието на рак на черния дроб [14]. Високата експресия на TGF- 1/Smad3 пътя се счита за една от ключовите причини за появата на рак на черния дроб [15]. С цел по-нататъшно изследване на основния механизъм, който медиира ефектите на ECH върху рака на черния дроб, беше изследван пътят на miPHK/TGF- 1/Smad3.
В това проучване ние оценихме ефектите на ECH върху прогресията на раковите клетки на черния дроб и установихме, че ECH проявява антитуморна активност чрез оста miR-503-3p/TGF- 1/Smad при рак на черния дроб, и осигурява безопасно и ефективно противотуморно средство за рак на черния дроб.
cistanche tcmе противораково.
Методи и материали
Материали
Echinacoside (ECH) (purity>98 процента, монохидрат) е получен от Hetian Dichen sashing Pharmaceutical Development Co., Ltd (Xinjiang, Китай). Структурната формула е показана на фиг. 1.
Клетъчна култура и трансфекция
Клетъчните линии на човешки рак на черния дроб Huh7 и HepG2 бяха закупени от FENGHUISHENGWU (Hunan, Китай). Клетките се култивират в среда DMEM, допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS, Gibco, САЩ) при 37 градуса в 5 процента CO2 клетъчен инкубатор. MiR-503-3p mimic и miR-NC са получени от Shanghai Gene Pharmaceutical Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Всички трансфекции се извършват с помощта на реагент Lipofectamine 2000 (Invitrogen), следвайки инструкциите на производителя. След допълнителни 24–48 часа, трансфектираните клетки бяха събрани и обработени за по-нататъшни изследвания.
Луциферазен репортерен анализ
Общите РНК се екстрахират от клетките и TGF- се амплифицира с помощта на WT и MUT праймерите. Фрагмент от TGF- 1 беше вмъкнат в pGL3-Bashc луциферазен репортерен вектор, наречен TGF- -WT-Luc. Областта на свързване на 1 и miR-503-3p беше мутагенизирана, за да се образува мутантен плазмид, обозначен като TGF- 1-Mut-Luc. TGF 1-WT-Luc и TGF- 1-Mut-Luc бяха ко-трансфектирани в клетки с miR-503-3p мимик и pRLTK. Клетките се събират 6 часа след трансфекцията. Комплект за анализ на двоен луциферазен репортер (Promega, Madison, WI, USA) беше използван за определяне на луциферазната активност.
Тест за клетъчен растеж
Huh7 и HepG2 клетки (2 × 105) бяха поставени в 96-плаки с ямки. След това клетките се третират с ECH за 24, 36 и 48 часа. След това към всяка ямка се добавят 10 mL МТТ разтвор и клетките се инкубират в продължение на 4 часа. След това към ямките се добавят 150 μL DMSO. И абсорбцията при 570 nm беше измерена с ELISA четец (Aoweiya, Пекин, Китай).
Образуване на колонии
Едноклетъчна суспензия се приготвя от трансфектираните клетки и се култивира в инкубатор в продължение на 7 дни. След изхвърляне на средата, клетките се оцветяват с оцветяване на Wright за 5 минути и след това се оцветяват с разтвор на багрило Giemsa и разтвор на фосфомолибдатен буфер на Sorensen (1:9) за 10 минути. След промиване колониите се преброяват под микроскоп.
Трансуел анализ
Тестовете за миграция и инвазия бяха извършени в камери Transwell (Costar, Badhoevedorp, Te Nether lands), покрити с или без Maribel (BD Biosciences) върху горната повърхност на {{0}} μm (размер на порите) мембрана. За анализ на миграция, трансфектирани Huh7 и HepG2 клетки бяха ресуспендирани в 200 µL свободна от серум DMEM среда и посяти в горните камери. За анализа на инвазията Matrigel (30 ug/ямка) беше предварително покрит върху мембраните на горните камери и другите стъпки бяха същите като анализа на миграцията. След инкубация от 24 часа клетките, които са мигрирали или са нахлули през мембраната към долната повърхност, се фиксират с етанол и се оцветяват с 0, 2% кристално виолетово. Накрая клетките бяха наблюдавани и преброени в пет произволни полета с помощта на микроскоп.
Анализ на клетъчния цикъл
Клетките Huh7 и HepG2 се посяват в 6-плаки с ямки при плътност от 1 × 105 клетки/mL. Клетките се събират след третиране с ECH за 0, 24, 48 часа. Тези клетки след това се добавят с 1 ml предварително охладен с лед 75 процента етанол, фиксиран при 20 градуса за 2 часа. След това клетките се добавят с PI оцветяващ разтвор и се инкубират на тъмно в продължение на 15 минути. След това клетъчният цикъл се анализира чрез поточна цитометрия.
Анализ на апоптотични клетки
Клетките се поставят в 6-плаки с ямки при плътност от 5 × 105 клетки/ямка. След събирането, клетките се центрофугират и се добавят 195 μL свързващ разтвор на Анексин V-FITC за ресуспендиране на клетките. След това бяха добавени 5 μL Анексин V-FITC и 10 μL оцветяващ разтвор на пропидиев йодид. Клетките се инкубират на тъмно и след това се поставят в ледена баня.
Цистанче предпазва черния дроб.
Количествена PCR с обратна транскрипция (qRT‑PCR)
Общите РНК се екстрахират с TRIzol реагент (Haigene, Haerbin, Китай). Te viiA™ 7 PCR система в реално време беше използвана за qRT-PCR. РНК беше обратно транскрибирана в сДНК с помощта на BeyoRT™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Beyotime Institute of Biotechnology). U6 беше използван като ендогенен контрол [16]. Последователностите на праймера бяха както следва:
miR-503-3p: напред: 5′-CTGATGGTTAAGAGAATGT-3′,
miR-503-3p: реверс: 5′-GTCCTTGGACATCCGGGCCG-3′,
U6: напред: 5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′,
U6: реверс: 5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′.
Western blot анализ
Трансфектираните клетки бяха събрани и общите протеини бяха екстрахирани. Концентрациите на протеин се определят с помощта на BCA Protein Assay Kit. Протеиновите проби се разделят с 10 процента SDS-PAGE и се прехвърлят върху поливинилиден флуоридна мембрана. След това мембраната се инкубира с анти-TGF- 1 (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай), SMAD3 (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай), SMAD 7 (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай), Bcl-2 (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай), Bax (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай), Cyto C (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай), каспаза{ {19}} (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай), каспаза-8 (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай) и анти- -актиново антитяло (1:1000, Shifeng, Шанхай , Китай) през нощта. Мембраната се инкубира с анти-заешко вторично антитяло (1:1000, Shifeng, Шанхай, Китай) [17].
Статистически методи
Данните бяха представени като средно ± стандартно отклонение (SD). Всички статистически анализи бяха извършени със софтуера SPSS 13.0. За сравнения беше използван t-тестът на студента. p-стойност < 0.05="" се="" счита="" за="">
Резултати
Ефект на ECH върху активността и пролиферацията на човешки рак на черния дроб
За да се изследва ефектът на ECH върху функцията на човешките чернодробни ракови клетки, беше извършен МТТ анализ и резултатите показаха, че клетъчната жизнеспособност на HepG2 (Фиг. 2а) и Huh7 (Фиг. 2b) постепенно намалява с увеличаването на дозата и времето на ECH лечение в сравнение с контролната група (p < 0.01).="" след="" 48="" h="" излагане="" на="" ech,="" жизнеспособността="" на="" клетките="" беше="" най-ниската,="" така="" че="" 48="" h="" излагане="" на="" ech="" беше="" избрано="" за="" по-нататъшен="" експеримент.="" резултатите="" от="" анализа="" за="" образуване="" на="" колонии="" показват,="" че="" броят="" на="" колониите="" от="" hepg2="" (фиг.="" 2c)="" и="" huh7="" (фиг.="" 2d)="" клетки="" постепенно="" намалява="" чрез="" третиране="" на="" ech="" по="" дозозависим="" начин="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група="" (p="">< 0="" .01,="" p="">< 0.001).="" тези="" резултати="" показват,="" че="" ech="" играе="" важна="" роля="" в="" активността="" и="" пролиферацията="" на="" hcc="">
Ефекти на ECH върху миграцията и инвазията на човешки рак на черния дроб
За по-нататъшно изследване на ефекта на ECH върху функцията на раковите клетки на човешкия черен дроб беше открита клетъчна миграция и инвазия. Както е показано на Фиг. 3a, b, в сравнение с групата без лечение на ECH, миграцията и инвазията на Huh7 и HepG2 клетките бяха значително намалени след лечение на ECH по дозозависим начин (p<0.01,><0.001), suggesting="" that="" ech="" inhibited="" the="" migration="" and="" invasion="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
ECH регулира разпределението и апоптозата на човешки рак на черния дроб
За да се изследва ефектът на ECH върху апоптозата на раковите клетки на черния дроб, беше проведена поточна цитометрия. Както е показано на Фиг. 4а, в сравнение с контролната група, процентът на Huh7 и HepG2 клетките във фазата G0/G1 беше значително намален след лечение с ECH по дозозависим начин (p<0.01), and="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" the="" s="" phase="" was="" gradually="" increased="" after="" ech="" treatment="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01), but="" there="" was="" no="" change="" of="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" g2/m="" phase="" after="" ech="" treatment="" (p="">0.05), което показва, че ECH е причинил спиране на S фаза на Huh7 и HepG2 клетки. В допълнение, с увеличаването на дозата на ECH, степента на апоптоза на Huh7 и HepG2 клетките постепенно се увеличава в сравнение с контролната група (фиг. 4b, p<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" induced="" the="" apoptosis="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
Ефектите на ECH върху пътя на TGF‑ 1/Smad
Известно е, че сигналният път на TGF- 1/Smad участва добре в клетъчната апоптоза. За да се изследва механизмът на ECH-индуцирана апоптоза в HepG2 клетки. Беше открита експресията на сигналния път на TGF- 1/Smad. В сравнение с контролната група открихме, че лечението с ECH значително намалява нивата на експресия на TGF- 1 и Smad3 както на нивата на иРНК (Фиг. 5а), така и на протеин (Фиг. 5b), и значително повишава експресията на Smad7 по дозозависим начин както на нивата на иРНК, така и на протеина (стр<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" inhibited="" the="" activation="" of="" the="" tgf-β1/smad="" signaling="">
TGF‑1 беше директна мишена на miR‑503‑3p
В допълнение, онлайн инструментът за прогнозиране Starbase v2. показа, че TGF- 1 е потенциална цел на miR-503-3p (фиг. 6а). Резултатите от анализа на луциферазен репортерен ген показват, че луциферазната активност на HepG2 клетки и Huh7 клетки, ко-трансфектирани с miR-503-3p mimic и TGF- 1-WT, е значително намалена, но не и на клетките, ко-трансфектирани с miR{ {10}}p мимика и TGF- 1-MUT (фиг. 6b, p<0.01). similarly,="" the="" luciferase="" activity="" of="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-="" mut="" was="" signifcantly="" increased,="" but="" not="" the="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-wt="" (fig.="" 6c,=""><0.01). furthermore,="" the="" expression="" levels="" of="" tgf-β1="" were="" signifcantly="" reduced="" in="" the="" mir-503-3p="" mimic="" group="" compared="" with="" that="" in="" the="" nc="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.01), but="" signifcantly="" increased="" in="" the="" mir-503-3p="" inhibitor="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.05). these="" results="" suggested="" that="" tgf-β1="" was="" a="" direct="" target="" of="" mir-503-3p.="" to="" further="" investigate="" whether="" mir-503-3p="" mediated="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="" cancer,="" the="" expression="" of="" mir-503-3p="" was="" detected="" in="" liver="" cancer="" tissues="" and="" it="" showed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" were="" decreased="" in="" liver="" cancer="" tissues="" compared="" with="" that="" in="" normal="" liver="" tissues="" (fig.="" 6f,=""><0.01). moreover,="" the="" expression="" levels="" of="" mir503-3p="" were="" further="" decreased="" in="" metastasis="" liver="" cancer="" tissues="" than="" that="" in="" nonmetastatic="" liver="" cancer="" tissues="" (fig.="" 6g,=""><0.01). the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" were="" gradually="" increased="" after="" ech="" exposure="" (fig.="" 6e,=""><0.05,><0.01). taken="" together,="" these="" results="" suggest="" that="" mir-503-3p/tgf-β1="" may="" mediate="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="">
Ефект на ECH върху активността на цитохром С и каспазите
Както е показано на Фиг. 7а, в сравнение с контролната група, ние открихме, че лечението с ECH индуцира значително намаляване на нивата на експресия на Bcl-2 в зависимост от дозата (p<0.01,><0.001), while="" the="" expression="" levels="" of="" bax="" were="" signifcantly="" increased="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01,><0.001). it="" was="" demonstrated="" that="" bcl-2="" and="" bax="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells.="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" cyto="" c,="" caspase-8,="" and="" caspase-3="" were="" signifcantly="" increased="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" (fig.="" 7b,=""><0.01,><0.001), indicating="" that="" the="" release="" of="" cyto="" c="" and="" the="" activation="" of="" caspase-8="" and="" caspase-3="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="">
Дискусия
Хирургичната резекция е основният метод за лечение на пациенти с рак на черния дроб, а честотата на рецидиви и метастази след чернодробна резекция е висока [18, 19]. В това проучване открихме, че ECH има известен инхибиторен ефект върху чернодробните тумори и осигурява безопасно и ефективно противотуморно средство за рак на черния дроб. Клиничната практика показва, че традиционната китайска медицина може ефективно да облекчи клиничните симптоми при пациенти с рак на черния дроб [20]. За ECH проучванията показват, че ECH има антиоксидантни, антидепресантни, противовъзпалителни, антивирусни, противотуморни и антибактериални ефекти [21, 22]. При колоректален рак ECH може да индуцира апоптоза на туморни клетки чрез регулиране на каспаза-3 и ензими за възстановяване на ДНК, за да индуцира окисление на ДНК [23]. В това проучване открихме за първи път, че ECH проявява антитуморна активност чрез оста miR 503-3p/TGF- 1/Smad при рак на черния дроб.
Междуклетъчната фаза на клетъчния цикъл на еукариотните клетки може да бъде разделена на G1, S и G2. Регулаторните точки на клетъчния цикъл в различни периоди се регулират от различни регулаторни фактори [24]. Това проучване установи, че процентът на клетките Huh7 и HepG2 във фазата G0/G1 и G2/M е намален, а процентът на клетките в S фазата е увеличен след ECH, което показва, че ECH причинява спиране на S фаза на Huh7 и HepG2 клетки. Дисбалансът на апоптозата е един от основните механизми на човешките тумори. Съобщава се, че противотуморните химиотерапевтични лекарства обикновено индуцират апоптоза на раковите клетки и контролират прогресията на рака. В нашето проучване открихме също, че ECH може да индуцира апоптоза на ракови клетки на черния дроб по дозозависим начин, което предполага, че индуцирането на апоптоза на ракови клетки може да бъде един от основните механизми на ECH при рак на черния дроб.
MiPHK играят ключова роля в регулирането на HCC клетъчната пролиферация, цикъла, апоптозата, миграцията чрез взаимодействия с различни сигнални пътища и молекули [25, 26]. Например, установено е, че miR-26a е силно експресиран в нормалните чернодробни клетки, но е значително понижен в чернодробните ракови клетки и инхибира пролиферацията [27]. Свръхекспресията на miR-503-3p индуцира апоптоза на белодробни ракови клетки и инхибира клетъчната инвазия и миграция [28]. В допълнение, голям брой проучвания показват, че сигналният път на TGF- 1/Smad играе ключова роля в развитието на рак на черния дроб [7]. Освен това, когато ракът на черния дроб продължава да прогресира, се съобщава, че експресията на TGF- 1 постепенно се увеличава [29]. В това проучване открихме, че ECH регулира надолу TGF- 1 и Smad3 и повишава Smad7, демонстрирайки, че ECH инхибира активирането на сигналния път на TGF- 1/Smad. В това проучване открихме, че е установено, че експресията на miR-503-3p е намалена в чернодробните туморни тъкани, но лечението с ECH повишава експресията на miR-503-3p в Huh7 и HepG2 клетки. Освен това открихме, че TGF- 1 е идентифициран като потенциална цел на miR-503-3p. ECH насърчава активирането на сигналния път на TGF- 1/Smad и повишава нивата на експресия на Bax/Bcl-2. Тези резултати предполагат, че miR-503-3p/ TGF- 1/Smad сигнализиращ път може да медиира ефектите на ECH върху рака на черния дроб. Известно е, че повишеното съотношение Bax/Bcl-2 може да доведе до освобождаване на Cyto C в митохондриите в цитоплазмата. Cyto C взаимодейства с Caspase-8 и образува апоптотично тяло, което след това набира и активира Caspase-3, което причинява каскадата Caspases и насърчава клетъчната смърт [30]. В това проучване установихме, че ECH намалява експресията на Bcl-2 и повишава експресията на Bax, Cyto C, каспаза-8 и каспаза-3. Тези резултати предполагат, че ECH може да възстанови митохондриалното увреждане до известна степен.
Заключение В това проучване открихме, че лечението с ECH инхибира пролиферацията, инвазията и миграцията и индуцира апоптозата на раковите клетки на черния дроб. Установено е, че основният механизъм на лечение с ECH върху ракови клетки на черния дроб е свързан с miR-503-3p/TGF- 1/Smad сигнален път. Това проучване ще осигури определена експериментална основа за изследване на ECH върху противотуморните заболявания. Струва си да се отбележи, че настоящото изследване е ограничено от липсата на експерименти с животни. Следователно нашето бъдещо проучване ще извърши експерименти с животни, за да потвърди допълнително нашите открития.
