Оценка на експозицията на амонячен азот в имунната защита, присъстваща в далака и главата на бъбреците на Wuchang Bream (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Резюме:Амонякът е един от най-важните фактори на околната среда във водните екосистеми. Въпреки това има ограничени проучвания за ефектите от хроничния или дългосрочен амонячен стрес и неговия потенциален молекулярен механизъм при рибите. Това проучване имаше за цел да изследва имунния отговор и молекулярните механизми в далака и бъбрека на главата на риба след хронично излагане на амоняк.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}}.48 g) беше изложено на различни концентрации на общ амонячен азот (0–30 mg/L) в продължение на 30 дни. Експозицията на амоняк причинява значително повишаване на нивата на кортизола и понижаване на концентрациите на лизозим и комплемент 3/4 в серума, което показва инхибиторни ефекти на стреса на амоняка върху вродените имунни отговори. Експозицията на амоняк също предизвиква зависещи от концентрацията увеличения на концентрациите на амоняк в тъканите, патологични увреждания и индекси на далака и главния бъбрек. Освен това съдържанието на имуноглобулин М (IgM), интерлевкин 1 (IL-1 ) и фактор на туморна некроза (TNF- ), както и нивата на мРНК на подобни на такса рецептори (TLRs)/миелоиден фактор на диференциация 88 (MyD88)-независими сигнални молекули в далака и главния бъбрек бяха значително понижени след излагане на амоняк. Нашите открития предполагат, че хроничното излагане на амоняк причинява потискане на вродените и адаптивни имунни отговори чрез регулиране на TLR/MyD88-независимо сигнализиране. Неблагоприятните влияния на хроничния амонячен стрес са по-тежки в далака, отколкото в главния бъбрек.
Ключови думи: амоняк; стрес; подобни на такса рецептори; далак; глава-бъбрек; имунитет
НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ БИЛКА ЦИСТАНЧА ЗА БЪБРЕЦИ
1. Въведение
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) понякога, поради неефективно или несъществуващо пречистване на отпадъчни води или други причини [9,10].
Доказано е, че имуносупресивните ефекти на амоняка при рибите допринасят за епидемии [11,12]. В някои проучвания върху Takifugu rubripes, Scophthalmus maximus и Pelteobagrus fulvidraco, острата експозиция на амоняк може да повиши нивата на генна експресия на B-клетъчен активиращ фактор, протеин на топлинен шок 70/90, tnf- и интерлевкин- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang и др. също съобщава, че активността на серумния лизозим е намалена значително в Acanthopagrus schlegelii след 24 часа експозиция на амоняк [16]. По подобен начин, понижени нива на иРНК на комплемента C3 и IgM се наблюдават в далаците на Pelteobagrus vachellii и Rhynchocypris lagowski при остра експозиция на амоняк [17,18]. Въпреки че е обърнато много внимание на ефектите от острата експозиция на амоняк върху имунитета на рибите, има само ограничени проучвания за ефектите от хроничния или дългосрочен амонячен стрес и неговия потенциален молекулен механизъм. В допълнение, някои изследователи съобщават за неблагоприятни ефекти на амонячен азот върху експресията на иРНК на TLR чрез транскрипционен анализ [16,19–22]. Следователно, ние предполагаме, че постоянната експозиция на амоняк също може да повлияе на имунитета на рибите, в който сигналният път на TLR може да играе важна роля.
Далакът и главният бъбрек са основните имунни органи при телестните риби, които са отговорни за улавянето и изчистването на чужди частици и поддържането на стабилна вътрешна среда [23,24]. Те са и основните места, където се произвеждат имунни антитела [25–27]. Освен това при рибите вродената имунна система се състои от фиксирани и подвижни клетки, както и широка гама от защитни молекули (като лизозим, комплемент и цитокини) [28,29]. Платиката Wuchang ( Megalobrama amblycephala ) е ципринидна риба, произхождаща от басейна на Яндзъ в Китай, която беше класирана на 11-то място в света по общо годишно производство на тази риба през 2014 г. [30]. Като основен вид в аквакултурата, M. amblycephala е относително чувствителен вид към амонячен азот и често страда от стрес, предизвикан от амонячен азот [31–33]. В светлината на горното беше проведен експеримент с хронична експозиция в платика Wuchang, за да се изяснят характеристиките на имунните отговори след хронична експозиция на амоняк и механизмът зад тези ефекти чрез откриване на промени в серумните имунни параметри, хистология и молекули, свързани с пътя на TLR в далака и главата-бъбрек. Нашите резултати също са благоприятни за наблюдение на здравния статус и благосъстоянието на M. amblycephala в интензивни системи за аквакултури.
2. Резултати
2.1. Съдържание на амоняк в далака и главния бъбрек
Фигура 1 показва съдържанието на амоняк в далака и главния бъбрек на M. amblycephala след 30 дни на излагане на различни нива на амоняк. Наблюдава се значително повишаване на нивото на амоняк в далака на риба, изложена на 30 mg/L общ амониев азот в сравнение с контролната група (p <0,05). Няма статистическа разлика в нивата на амоняк в главния бъбрек между всички групи на лечение с амоняк и контролната група (р > 0,05).
Фигура 1. Ефекти от хроничната експозиция на амоняк върху натрупването на амоняк в далака и главния бъбрек на M. amblycephala. Всяка колона представлява средната стойност ± SE от шест дубликата. Стойностите на p < 0.05 са представени като "*" над колоната, което показва значителни разлики спрямо контролата, съответно.
2.2. Серумни нива на кортизол, лизозим, C3 и C4
Както е показано на фигура 2, нивата на серумния кортизол се повишават значително във всички групи, лекувани с амоняк, в сравнение с контролната група (p < 0.05). Обратно, серумните лизозимни активности са значително намалени при рибите, изложени на по-високи концентрации на амоняк (20 и 30 mg/L общ амониев азот) (p <0,05). Нивата на C3 и C4 на комплемента в серума са значително намалени в групите, третирани с 10 до 30 mg/L общ амонячен азот (р <0,01).
Фигура 2. Ефекти от хроничната експозиция на амоняк върху нивата на серумен кортизол, лизозим, C3 и C4(AD) в M. amblycephala. Всяка колона представлява средна стойност + SE от шест дубликата. Стойностите на p < 0.05 и 0.0l са представени като "" и "" над колоната, което показва значителни разлики спрямо контрола, съответно.
2.3. Индекси на органите на имунитета
Индексите на далак и глава-бъбрек се повишават с увеличаването на общите концентрации на амонячен азот след експозиция (Фигура 3). В сравнение с контролната група, индексът на далака е значително повишен при рибите, третирани с по-висок общ амонячен азот (20 и 30 mg/L) (p <0,05). Не е открита значителна разлика в индекса глава-бъбрек между всички групи, лекувани с амоняк, и контролната група (р > 0,05).
Фигура 3. Ефекти от хроничната експозиция на амоняк върху далака (A) и индексите на главата и бъбреците (B) при Mamblycephala. Стойностите се изразяват като мин. до макс. (n=18). Стойностите на p < 0.05 и 0,01 са представени като "" и "u" над колоната, което показва значителни разлики спрямо контрола, съответно.
2.4. Патологична оценка
Далакът на платика Wuchang в контролната група показва нормален вид с изобилие от еритроцити и левкоцити (Фигура 4А). След излагане на амоняк в продължение на 30 дни бяха отбелязани леки увеличения в броя на еритроцитите заедно с появата на мелано-макрофагални центрове в далака на риба, изложена на 5 mg/L общ амонячен азот (Фигура 4B, Таблица 1). Подобни, но по-сериозни промени са наблюдавани при риби, третирани с 10 до 30 mg/L общ амонячен азот, като увеличаване на броя и размера на меланомно-макрофагалните центрове, както и значително увеличен брой еритроцити (Фигура 4C,D). В допълнение, цитоплазмената вакуолизация също беше открита в далака на риба, изложена на 30 mg/L общ амонячен азот (Фигура 4E, Таблица 1).
Що се отнася до главата-бъбрек, Фигура 5А показва нормална структура на главата-бъбрек при контролна риба след експозиция. Не са отбелязани очевидни патологични признаци в бъбрека на главата на риба, изложена на по-нисък общ амонячен азот (5 mg/L) (Фигура 5B, Таблица 1). Леки увеличения в броя на меланомно-макрофагалните центрове се наблюдават при риби, изложени на 10 и 20 mg/L общ амонячен азот (Фигура 5C, D, Таблица 1). Размерът и броят на меланомно-макрофагалните центрове бяха увеличени в групата с 30 mg/L общ амонячен азот (Фигура 5E, Таблица 1).
2.5. Анализ на параметрите на тъканния имунитет
Нивата на вродени имунни параметри (TNF-, IL-1) и придобити имунни параметри (IgM) в далака и главния бъбрек намаляват заедно с увеличаването на нивата на експозиция на амоняк (Фигура 6, допълнителна таблица S1). В далака съдържанието и нивата на mRNA на TNF- и IgM бяха значително намалени във всички групи, лекувани с амоняк, в сравнение с контролите (p < 0.{{10}}5). Междувременно съдържанието на IL-1 в далака и нивата на експресия на иРНК бяха значително понижени при рибите, изложени на повече от 20 mg/L общ амонячен азот (p <0,05). Обратно, само съдържанието и нивото на иРНК на IL-1, както и нивото на експресия на tnf- в главния бъбрек са значително намалени в групите, лекувани с амоняк, спрямо контролите (р <0,05). Няма значителни разлики в нивата на IgM протеин и генната експресия, както и концентрацията на TNF- в главния бъбрек между групите, третирани с амоняк, и контролната група (р > 0,05).
Фигура 6. Относителни нива на mRNA на гени на TLR сигнален път, както и съдържанието на TNF-, IL- 1 и IgM в далака и главния бъбрек на M. amblycephala. Стойности, изразени като средни стойности ± SE от шест дубликата. igm: имуноглобулин M, il-1: интерлевкин 1, tnf-: фактор на туморна некроза, jnk1: c-Jun N терминална киназа1, erk1: извънклетъчно регулирана протеин киназа 1, p38: митоген активирана протеин киназа p38, nf-κb1 /2: свързване на ядрен фактор-κ-ген 1/2, pi3 k: фосфатидилинозитол 3-киназа, akt: протеин киназа B, myd88: фактор на миелоидна диференциация 88, traf6: фактор 6, свързан с рецептор на фактор на туморна некроза, tlr1 /2/3/4/5: подобен на такси рецептор 1/2/3/4/5. Стойностите на p < 0.05 и 0,01 са представени като "*" и "**" над колоната, което показва значителни разлики спрямо контролата, съответно
За да се изясни молекулярният механизъм на хроничната амонячна токсичност върху имунната система, бяха определени транскрипционни промени на ключови гени, участващи в сигналния път на TLR, заедно с нивата на TNF-, IL-1 и IgM. В далака нивата на мРНК на гени, подобни на рецептори (tlr2, tlr4), MyD88-независим път, свързан с ген traf6, NF-κB сигнален път, свързан с ген nf-κb2 и MAPK сигнален път, свързан с ген erk1, са значително понижени -регулирани в групите на лечение с амоняк в сравнение с контролата (p < 0.05), докато няма забележителни промени в експресията на tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 , nf-κb1, jnk1 и p38 a (p > 0.05). По подобен начин нивата на транскрипция на tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 и jnk1 са значително червени, няма значими разлики в експресията на tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 и p38 в главния бъбрек между групите, лекувани с амоняк, и контролната група (p > 0.05).
2.6. Корелационен анализ
Както е показано на фигура 7 и допълнителна таблица S2, концентрацията на експозиция на амоняк е значително отрицателно корелирана със съдържанието на TNF-, IL-1 и IgM, както и транскрипционните нива на tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 и jnk1 в далака. Междувременно, съдържанието и нивата на транскрипция на TNF-, IL-1 и IgM на далака показват значителни положителни корелации помежду си (p < 0.05). Концентрацията на IgM в далака показва значителна положителна корелация с tlr2 и nf-кb2, а TNF-, както и IL-1 показват значителни положителни корелации с tlr2, traf6 и nf-кb2 (p < 0.{{ 53}} 5). Въпреки това, в главния бъбрек нивата на експозиция на амоняк са само забележително отрицателно корелирани със съдържанието на IL-1 и експресията на гените tnf-, il-1, tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 и erk1 (p < 0.05). Главният бъбрек IL-1 корелира положително с IgM, igm, il-1, tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 и jnk1, докато IgM и TNF- показват положителна корелация с p38 a и tlr2, съответно (p <0.05).
Фигура 7. Коефициенти на корелация на Spearman ® между концентрацията на експозиция на амоняк и имунните параметри, включени в TLR сигналния път в далака и главния бъбрек на M. amblycephala след хронична експозиция на амоняк. Стойностите на p < 0.05 и 0,01 са представени като "*" и "**" над колоната, което показва значителни разлики спрямо контрола, респ.
2.7. Индекси на IBR
Стойностите на IBR бяха изчислени от стандартизираните данни на 22 биомаркера в далака и бъбрека на главата на платика Wuchang при различни нива на околния амоняк след 30-дневна експозиция (Таблица 2, Фигура 8). Тъй като концентрациите на експозиция на амоняк се увеличават, стойностите на IBR имат тенденция да се увеличават както в далака, така и в главния бъбрек. Стойностите на IBR са по-високи в далака
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
