Експеримент 3 Ефект на Cistanche Deserticola Phenylethanol Glycoside върху модел в перименопауза на плъх Ⅲ

Експеримент 3 Ефект на Cistanche deserticola фенилетанол гликозид върху модел на плъхове в перименопауза

1 Експериментални материали

1.1 Опитни животни

Плъхове Wistar, клас SPF, женски, предоставени от Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., номер на сертификата за плъхове за тази партида: 0017216; лабораторен сертификат номер SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Експериментални лекарства

Cistanche deserticola фенилетанол гликозидсе получава съгласно метода от експеримент 1 и съдържанието достига 66,47%. Gengnian'an Capsule, съставки: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, кора от божур, Poria cocos, седеф, curculigo, Schisandra chinensis, магнетит, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, плаваща пшеница, polygonum multiflorum . Функции и показания:Подхранвайте ин и покорявайте ян, облекчаване на проблемитеи успокойте ума. Използва се при менопаузални горещи вълни и изпотяване, световъртеж, шум в ушите, раздразнителност и безсъние. Спецификации: 0.3g на капсула. Употреба и дозировка: Перорално по 3 капсули наведнъж 3 пъти на ден. Производител: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Производствен партиден номер: 121104. Номер на одобрението: Национално одобрение за лекарства № Z14021848.

Соеви изофлавони и витамин Е меки капсули, списък на съставките: соеви изофлавони на прах, витамин Е, слънчогледово масло, желатин, глицерин, вода, тартразин, титанов диоксид. Емблематични съставки и съдържание: Всеки 100 g съдържа 55,2 mg соеви изофлавони (изчислени като генистеин) и 608,5 mg витамин Е. Здравословни функции: Увеличава плътността на костите. Начин на употреба и дозировка: Приемайте по 1 капсула 2 пъти дневно с топла вода. Спецификации: 500mg×100 капсули. Производител: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Номер на производствената партида: 13070302. Номер на одобрението: National Food Health G20080032.

КОЛКО ВРЕМЕ НЕОБХОДИМО НА CISTANCHE ЗА РАБОТА?

1.3 Експериментални реактиви

Натриева карбоксиметилцелулоза, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., партиден номер: 20120418; пеницилин натрий за инжектиране, North China Pharmaceutical Co., Ltd., спецификация: 4 милиона единици, производствен партиден номер: c1206807;

Разтвор на формалдехид (аналитично чист), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., производствен партиден номер: 20130902; 0,9% натриев хлорид за инжектиране, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; спецификация: 250ml, производствен номер на партида: 13082405B;

Хлорал хидрат, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, партиден номер 20120827; Комплект за откриване на плъх E2 ELISA, R&D Company, партиден номер: 20140101A; Комплект за откриване на плъх T ELISA, R&D Company, партиден номер: 20140101A; Комплект за откриване на плъх LH ELISA, R&D Company, партиден номер: 20140101A; Комплект за откриване на плъх FSH ELISA, R&D Company, партиден номер: 20140101A;

2 Експериментални методи

2.1 Моделиране и прилагане на лекарства

Метод на моделиране: Вземете 100 женски плъхове Wistar с телесно тегло 210~230g, изберете на случаен принцип 12 плъха като празна група и се подложете на фиктивна операция, а останалите плъхове ще бъдат използвани за създаване на менопауза модели. След като плъховете бяха претеглени, плъховете бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на 10% хлоралхидрат (0.3 ml/100 g) и коремната позиция беше фиксирана. След това плъховете бяха подрязани от под последното ребро на гърба си в пресечната точка на средната аксиларна линия и на около 2 см от страничната страна на гръбначния стълб и след това дезинфекцирани. Кожата и мускулите на гърба се разрязват около 1 см, като в зрителното поле на разреза се вижда млечнобяла лъскава мастна маса, в която е вграден яйчникът. Използвайте малки пинсети, за да хванете внимателно мастната маса и да я издърпате от разреза, отделете мастната маса и ще видите група тънки, неправилни, жълто-червени яйчници. Когато режете, първо лигирайте фалопиевата тръба (включително мазнината) под яйчника с тънък конец, отстранете напълно левия яйчник и отстранете 80% от десния яйчник. След операцията маточните рога бяха върнати обратно в коремната кухина, мускулите и кожата бяха зашити и двата яйчника бяха отстранени по същия начин. След операцията, животните бяха внимателно отгледани и интрамускулно инжектирани с 200,000 u/kg пеницилин (0,1 ml всяко) за предотвратяване на инфекция, веднъж на ден в продължение на 3 последователни дни. 5 дни след операцията започва вагинално изследване на плъхове един по един, веднъж дневно в продължение на 5 последователни дни. Плъхове с реакции на еструса в цитонамазката бяха изхвърлени. Бяха избрани 72 напълно кастрирани плъха и разделени на случаен принцип в 6 групи. За експериментални цели те са моделната група, групата Gengnianan, групата на соевите изофлавони и групата на големи, средни и малки дози Cistanche deserticola фенилетанол гликозид.

Метод на приготвяне: Метод на приготвяне: {{0}}.5% CMC Метод на приготвяне: Претеглете 4g натриева карбоксиметилцелулоза и я смесете с дестилирана вода, за да получите 800ml. Дозите на големи, средни и малки дози от Cistanche deserticola фенилетанол гликозидна група са съответно 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg и 33,33 mg/kg (обем на приложение 1 ml/100 g). Метод на приготвяне: Претеглете съответно 1333,3 mg, 666,7 mg и 333,3 mg общи малинови флавоноиди, разтворете ги с малко количество 0,5% CMC, след това регулирайте обема до 100 ml, разбъркайте добре и това е. Gengniangan капсули (450 mg/kg, смесени с дестилирана вода до 45 mg/ml, 1 ml/100 g, еквивалентни на 10 пъти клиничната доза); Метод на приготвяне: Вземете 15 капсули Gengnianan, първо ги разтворете с малко количество от 0,5% CMC, след това регулирайте обема до 100 ml и разбъркайте добре, което е дозата на суспензията на капсула Gengnianan (450 mg/kg). Соев изофлавон витамин Е меки капсули (166,67 mg/kg, използвайте дестилирана вода, за да направите 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, еквивалентно на 10 пъти клиничната доза); Метод на приготвяне: Вземете 4 соеви изофлавони витамин Е меки капсули, първо разтворете с малко количество от 0,5% CMC, след това регулирайте обема до 120 ml и разбъркайте добре, за да получите дозата соев изофлавон витамин Е мека капсулна суспензия (16,67 mg/kg ).

Метод на приложение: Животните във всяка група получават съответните лекарства на 10-ия ден след операцията. Празната група и моделната група бяха инжектирани със сонда с еднакъв обем от 0,5% разтвор на CMC (обемът на сондата беше 1 ml/100g), а групата Gengnianan беше инжектирана със суспензия на Gengnianan капсула (450 mg/kg, еквивалентно на 10 пъти клиничната доза ). ), групата на соевия изофлавон беше перорално приложена суспензия на мека капсула на соев изофлавон витамин Е (166,67 mg/kg, еквивалентно на 10 пъти клиничната доза) и голямата, средната и малката дозаCistanche deserticola фенилетанол гликозидгрупите се прилагат перорално според групата. Големи, средни и малки дози фенилетанол гликозид Cistanche deserticola (дозировките са съответно 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg и 33,33 mg/kg, обемът на дозата е 1 ml/100 g), прилагани веднъж дневно чрез интрагастрално приложение, непрекъснато . лекарство за 30 дни.

2.2 Обекти за наблюдение и методи за откриване

Резултатите за хоризонтално-вертикално движение на плъхове във всяка група бяха измерени 29 дни след приложението. 2 часа след последното стомашно приложение (на гладно в продължение на 15 часа), отстранете очните ябълки, за да вземете кръв, отделете серума иплазмаи измервайте съдържанието на E2, T, LH, FSH, GnRH и BGP в серума и съдържанието на -EP в плазмата; плъховете бяха разрязани. Отстранете тимуса, далака, матката и останалите 20% от тъканта на яйчника, претеглете техните влажни тегла и изчислете органния индекс на тимуса, далака и матката (органен индекс=мокро тегло на орган mg/тегло на плъх g) , и след това отстранете мозъка. За хипоталамуса и хипофизната жлеза тъканните хомогенати се приготвят от хипоталамуса, хипофизната жлеза и 1/2 от матката и съдържанието на естрогенни рецептори в хипоталамуса, хипофизната жлеза и маточните тъканни хомогенати и андроген определя се рецепторно съдържание в хомогенатите на хипоталамичната тъкан. Тимусът, далакът, матката и яйчниците бяха фиксирани в 10% разтвор на формалдехид, поставени в парафин, нарязани и оцветени с HE. Theхистоморфологични променивъв всяка група са наблюдавани под светлинен микроскоп.

2.2.1 Тест по метода на открито

Експерименталното устройство представлява кубична отворена кутия с височина 40 cm и дължина и ширина 80 cm. Околните стени и дъното са черни. Долната част се състои от 25 блока с еднаква площ, разделени с бели линии. По време на експеримента плъхът беше поставен в квадрата в центъра на отворената кутия и резултатът от хоризонталната активност на броя блокове, които плъхът пресече на дъното в рамките на 5 минути (квадратите с четирите въведени лапи могат да бъдат преброени), и колко пъти задните крайници са били изправени (две предни лапи са били във въздуха). (или прилепване към стена) резултат за вертикална активност. Изпражненията трябва да бъдат напълно отстранени след всеки експеримент и всеки плъх се измерва веднъж 2 часа след приложението. Този експеримент беше проведен в тиха стая.

2.2.2 Метод за определяне на комплекта

Вземете серумни проби: Използвайте епруветки, които не съдържат пирогени и ендотоксини. Избягвайте каквато и да е клетъчна стимулация по време на операцията. След като вземете кръвта, центрофугирайте я при 3000 rpm за 10 минути, за да отделите бързо и внимателно серума и червените кръвни клетки. Вземете плазмени проби: антикоагулирани с хепарин антикоагулантни епруветки. Центрофугирайте при 3000 rpm за 30 минути и вземете супернатантата. Вземете проби от тъканен хомогенат: Добавете подходящо количество физиологичен разтвор към тъканта и я разтрийте. Центрофугирайте при 3000 rpm за 10 минути и вземете супернатантата.

Методът за определяне на комплекта ELISA на плъх (Rat) естрадиол (E2) е същият като в експеримент 2. Концентрациите на стандартите (S0-S5) са 0, 4, 8, 16, 32 и 64 pmol/L.

Методът за изследване на комплекта ELISA за тестостерон (T) на плъхове е същият като метода за изследване на комплекта ELISA за естрадиол. Концентрациите на стандартите (S{{0}}S5) са {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 и 320 pg /mL. Методът за определяне на комплекта за откриване на ELISA лутеинизиращ хормон (LH) при плъх е същият като метода за определяне на комплекта за откриване на естрадиол ELISA. Концентрациите на стандартите (S0-S5) са 0, 3, 6, 12, 24 и 48 ml/ml. Методът за изследване на комплект ELISA за плъх (Rat) фоликулостимулиращ хормон (FSH) е същият като метода за изследване на комплект ELISA за естрадиол. Концентрациите на стандартите (S0-S5) са 0, 0,75, 1,5, 3, 6 и 12 IU/L. Методът за определяне на комплекта за откриване ELISA на гонадотропин-освобождаващ хормон (GnRH) при плъх е същият като метода за определяне на комплекта за откриване на естрадиол ELISA. Концентрациите на стандартите (S0-S5) са 0, 5, 10, 20, 40 и 80 mlU/ml.

Методът за определяне на комплекта за откриване ELISA на плъх (Rat) osteocalcin (BGP/OCN) е същият като метода за определяне на комплекта за откриване на естрадиол ELISA. Концентрациите на стандартите (S{{0}}S5) са 0, 0.75, 1,5, 3, 6 и 12 ng/ml. Методът за определяне на комплекта за откриване ELISA на плъх (Rat) -ендорфин (-EP) е същият като метода за определяне на комплекта за откриване на естрадиол ELISA. Концентрациите на стандартите (S0-S5) са 0, 3, 6, 12, 24 и 48 pg/mL. Методът за определяне на комплекта за откриване ELISA на плъх (Rat) естрогенен рецептор (ER) е същият като метода за определяне на комплекта за откриване на естрадиол ELISA. Концентрациите на стандартите (S{{20}}S5) са 0, 4, 8, 16, 32 и 64 pg/mL. Методът за определяне на комплекта за откриване ELISA на плъх (Rat) андрогенен рецептор (AR) е същият като метода за определяне на комплекта за откриване на естрадиол ELISA. Концентрациите на стандартите (S0-S5) са 0, 25, 50, 100, 200 и 400 pg/mL.

2.3 Методи за статистическа обработка

За анализ на данни беше използван медицински статистически пакет SPSS17.0 за статистическа обработка на данни. Данните от измерването бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (-x±s). Еднопосочен анализ на дисперсията беше използван за сравнение между групите. Методът LSD беше използван за тестване на хомогенността на дисперсиите. , тестът Games-Howell беше използван за неравномерни отклонения, а тестът Ridit беше използван за данни за оценка.

Може да се види от Таблица 11 и Фигура 14, че в сравнение с празната група, индексът на тимуса, индексът на далака и индексът на матката на плъховете в моделната група са значително намалени (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Ефекти върху нивата на биохимичния индекс на кръвта при модел на плъхове в перименопауза

Серумното съдържание на E2, T, LH, FSH, GnRH и BGP и плазменото съдържание на -EP на плъхове във всяка група са показани в таблици 12~13 и фигури 15~17.

Може да се види от Таблици 12~13 и Фигури 15~18, че в сравнение с празната група, серумните Е2 и Т нива на плъхове в моделната група са значително намалени (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Таблица 14 Ефект на Cistanche deserticola фенилетанол гликозид върху серумните нива на GnRH и плазмените -EP при модел на плъхове в перименопауза (-x±s)

Може да се види от таблица 14 и фигури 19-20, че в сравнение с празната група, серумното ниво на GnRH на плъхове в моделната група е значително повишено и плазменото ниво на -EP е значително понижено (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Ефекти върху съдържанието на ER и AR в тъканите на моделни плъхове в перименопауза

Съдържанието на ER и AR в съответните тъкани на плъхове във всяка група е показано в таблици 16~17 и фигури 22~23.

Може да се види от Таблица 17 и Фигура 23, че в сравнение с празната група, нивото на AR в хипоталамуса на моделната група е значително по-ниско (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Ефекти върху морфологията на органната тъкан при модел на плъхове в перименопауза

Резултатите от патологично и хистологично наблюдение на матката, тимуса и далака на плъхове във всяка експериментална група са както следва. Патологичните снимки са показани в Приложение 1 за патологичните снимки на моделни плъхове в перименопауза.

5.1 Ефект върху морфологията на маточната тъкан при модел на плъхове в перименопауза

Според различната степен на промени в ендометриума, жлезите и миометриума на плъховете във всяка експериментална група бяха използвани полуколичествени стандарти за разделяне на патологичната тъканна морфология на четири нива и матките на плъховете във всяка експериментална група бяха измерено. Резултатите от наблюдението са показани в Таблица 18.

"-" Ендометриалните епителни клетки, жлезите, миометриума и серозата са нормални; "+" ендометриалните епителни клетки и жлези са атрофирали, а миометриумът и серозата са нормални; "++" ендометриалният епител Клетките и жлезите са частично атрофирали, мускулният слой е леко атрофирал и серозата е нормална; "+++" ендометриалните епителни клетки и жлези са значително атрофирали и серозата е нормална.

След тест Ridit може да се види от Таблица 18, че в сравнение с празната група, матката на плъхове в моделната група показва значителни патологични тъканни лезии (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Ефект върху морфологията на яйчниковата тъкан при модел на плъхове в перименопауза

Според различната степен на промени във фоликулите, жълтото тяло, гранулозните клетки и кръвоносните съдове в яйчниците на плъхове във всяка група експерименти бяха използвани полуколичествени стандарти за разделяне на патологичната тъканна морфология на четири нива. Яйчниците на плъхове във всяка група от експерименти бяха измерени и наблюдавани. Резултатите са показани в Таблица 19.

Таблица 19 Ефект на Cistanche deserticola фенилетанол гликозид върху патологични промени на яйчниците при модел на плъхове в перименопауза Единица: само

"-" може да показва нарастващи фоликули, зрели фоликули и жълто тяло на всички нива. Жълтото тяло е добре развито, с много слоеве гранулозни клетки, богата фоликуларна течност и богати кръвоносни съдове; „+“ може да показва нарастващи фоликули, зрели фоликули и жълто тяло, но броят на зрелите фоликули и жълтото тяло е малък. , фоликулите са по-малки, а гранулозните клетки са по-малко наслоени; „++“ може да показва зрели фоликули и жълтото тяло, с повече жълто тяло, по-малко гранулозни клетки и по-малко кръвоносни съдове; "+++" няма фоликули, има повече жълто тяло и яйчникът е атрофичен, аваскуларен.

След тест Ridit, може да се види от таблица 19, че в сравнение с празната група, яйчниците на моделната група плъхове показват значителни патологични тъканни лезии (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Ефекти върху морфологията на тъканите на тимуса и далака при модел на плъхове в перименопауза

С помощта на микрометър измерете дебелината на най-дебелите и най-тесните части на кората на тимуса на всеки плъх във всяка експериментална група, за да получите средната стойност; Използвайте базовата линия на микрометъра, за да попаднете върху възлите на далака, измерете дебелината на възлите на далака от двете страни с централната артерия като център и изчислете средната стойност. Измерените резултати са показани в таблица 20 и фигура 24.

Може да се види от таблица 20 и фигура 24, че в сравнение с празната група, дебелината на кората на тимуса и обемът на възлите на далака в моделната група са значително намалени (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).