Как азотният оксид синтаза влияе на бъбреците?

За контакт: Одри Хуaudrey.hu@wecistanche.com

Молекулярно изследване на токсичността на диазинон въз основа на експресия на индуцируема азотен оксид синтаза (iNOS) в хепатоцити и бъбречна хистопатология на плъхове (Rattus norvegicus)

Резюме

Диазинон е органофосфатен инсектицид, който се използва широко за унищожаване на вредители, но има по-висока токсичност от други инсектициди. Диазинон, който случайно се консумира през устата, има въздействие върху повишените реактивни кислородни видове (ROS) в тялото. Реактивните кислородни видове (ROS) ще активират провъзпалителен цитокин, който ще индуцира индуцируемотоСинтаза на азотен оксид(iNOS), при което iNOS (Синтаза на азотен оксид) ще произведеАзотен оксид(NO) като свободен радикал. Високо ниво на ROS ще причини увреждане на клетките. Това проучване имаше за цел да определи токсичния ефект на диазинон спрямо iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресия в черния дроб ибъбрекхистопатология на плъхове (Rattus norvegicus). Плъховете бяха разделени на 4 групи, състоящи се от отрицателна контролна група и три експериментални групи, на които беше даден диазинон 20 mg/kg BW (P1), 40 mg/kg BW (P2) и 60 mg/kg BW (P3). Параметрите, наблюдавани в това изследване, са експресията на iNOS (Синтаза на азотен оксид)в черния дроб, като се използва имунохистохимично оцветяване, след което се анализира с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от тест на Tukey (a=0,05), ибъбрекхистопатология, която беше наблюдавана с помощта на оцветяване с хематоксилин-еозин и анализирана качествено описателно. Резултатите показват, че пероралното приложение на диазинон значително повишава iNOS (Синтаза на азотен оксид)израз (стр<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">на бъбрецитекора, която се проявява чрез възпалителна клетъчна инфилтрация, некротична набъбректубулни клетки и кръвоизлив в междутубулното пространство.

Ключови думи:Диазинон, Органофосфат, iNOS (Синтаза на азотен оксид)израз,бъбрекхистопатология.

Цистанче подобрява функцията на бъбреците

1. Въведение

Смята се, че използването на пестициди увеличава производството, особено като превантивно средство срещу вредители и плевели (Kusriani, 2012). Честото използване на пестициди обаче може да доведе до това, че тези пестициди са токсични за потребителите, включително животни, както при вдишване, през устата, така и през кожата (Ameriana, 2006). Един пестицид, който често се използва, е диазинон. Диазинон е органофосфатен пестицид, който има механизъм за инхибиране на функцията на ензима холинестераза. Тези пестициди също имат по-малък ефект върху нецелевите организми и са по-токсични за гръбначните животни в сравнение с органохлорите (Luthfanto, 2014). Обикновено пестицидите ще бъдат неутрализирани в черния дроб от хепатоцитите чрез детоксикация, но тези съединения също са способни да образуват свободни радикали поради увреждане на клетките. Експозицията на органофосфат, която се появява непрекъснато, може да предизвика увреждане на черния дроб като орган, който играе роля в процеса на детоксикация (Ginting, 2014). Органофосфатите, които са били метаболизирани в черния дроб, имат силата да инхибират ензима AChE. Инхибирането на този ензим директно води до повишаване на нивата на ацетилхолин в нервната система и нервно-мускулната система. Увеличаването на AChE може да причини йони в клетките да станат нестабилни и да предизвикат образуването на реактивни кислородни видове (ROS) (Uchendu, 2012). Повишената ROS ще задейства производството на провъзпалителни цитокини. Naik и Vishva (2011) заявяват, че ROS засяга транскрипцията на провъзпалителни цитокини, където високите нива на ROS ще бъдат последвани от високи нива на провъзпалителни цитокини, както и ако производството на ROS се инхибира от инхибитори, ще повлияе на намаляването на производството на провъзпалителни цитокини като като IL-6 и TNF. Повишеното производство на провъзпалителни цитокини ще индуцира iNOS (Синтаза на азотен оксид)и образуват NO в прекомерни количества (Aktan, 2004).

Theбъбреке основният орган, който поддържа баланса на допълнителната клетъчна течност (ECF), като изпълнява функциите си по отделяне и метаболизъм (Curthoys, 2014). Екскрецията или елиминирането на ксенобиотичния метаболизъм води добъбрек. Theбъбрекувреждането може да намали нивото на отделяне на химикали, без да повишава токсичността на токсичните вещества (Gupta, 2012). Състоянието на оксидативен стрес ще инициира процеса на липидна пероксидация чрез отнемане на водородни йони от връзката на полиненаситените мастни киселини (PUFA) за образуване на по-стабилна молекула. Процесът на разкъсване на връзката върху PUFA може да причини клетъчна или тъканна некроза (Sharma et al..2003).

Това проучване е проведено за определяне на токсичния ефект на диазинон срещу iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресия в черния дроб и бъбречната хистопатология на плъхове.

Азотният оксид синтаза засяга бъбречната функция

2. Материали и методи

2.1. Животински модели и експериментален дизайн

Двадесет плъха (Rattus norvegicus) бяха разделени на 4 групи: отрицателна контролна група (здрави плъхове). Групите P1, P2 и P3 бяха администрирани с диазинон в продължение на 8 седмици перорално, като се използваше сонда за хранене с дози съответно 20 mg/kg BW, 40 mg/kg BW и 60 mg/kg BW. Diazonium 600EC се смесва с дестилирана вода, докато съдържа 5 mg диазоний в 1 ml (Baconi et al., 2013).

Плъховете се аклиматизират за една седмица преди да бъдат лекувани. Всички условия и боравене с животни бяха проведени с протокола, одобрен от Комитета за етични разрешения на университета Brawijaya (№: 732-KEP-UB).

2.2. Подготовка и наблюдение на бъбречна хистопатология

Изготвяне набъбрекхистопатологията се състои от следните етапи: фиксиране, дехидратация, изчистване, вграждане, разделяне, залепване към стъклени предмети според Muntiha (2001). Наблюдения набъбрекхистопатологията се извършва с помощта на бинокулярен светлинен микроскоп с микроскопско увеличение 100x, последвано до 400x. Наблюдението е извършено върху бъбречен гломерул и бъбречни тубули.

2.3. Анализ на експресията на iNOS (азотна оксидна синтаза) в черния дроб

iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресията върху черния дроб се анализира с имунохистохимични методи, използвайки анти iNOS (Синтаза на азотен оксид) като първично антитяло и анти-заешки IgG биотин, белязан като вторично антитяло. Измерването на iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресията върху черния дроб се провежда с помощта на софтуера Imunoratio. Резултатите от процентната площ на експресията на iNOS бяха анализирани количествено с помощта на еднопосочен тест за дисперсионен анализ (ANOVA) и последвани от теста на Tukey.

3. Резултати и дискусии

3.1. Анализ на експресията на iNOS (азотна оксидна синтаза) върху черния дроб

Да се ​​анализира експресията на iNOS (Синтаза на азотен оксид)върху чернодробни клетки се извършва с помощта на имунохистохимичен метод. Изразът на iNOS (Синтаза на азотен оксид)може да се покаже като кафяво оцветяване на хепатоцитите, което може да се види на фигура 1.

Фигура 1. iNOS (Синтаза на азотен оксид)изражение върху черния дроб.

(1) Отрицателна контролна група (K-). (2) P1 (индуциран с диазинон 20 mg/kg телесно тегло. (3) P2 (индуциран с диазинон 40 mg/kg телесно тегло).

(4) P3 (индуциран с диазинон 60 mg/kg телесно тегло. Белият кръг показва площта на iNOS (Синтаза на азотен оксид)изразяване.

Имунохистохимичният резултат беше анализиран качествено и показа, че има увеличение на интензитета на кафявия цвят (Фигура 1). Този резултат показва, че има увеличение на iNOS (Синтаза на азотен оксид)нива на експресия в групата на лечение в сравнение с контролната група.

За измерване на нивото на iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресия върху хепатоцити, използвана софтуерна имунореакция. Резултатите от количествения анализ на iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресията в черния дроб на плъхове може да се види в таблица 1 и може да се заключи, че има значителна разлика (p<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Синтаза на азотен оксид)Секспресията беше 1,340 ±0,092 процента. В група на лечение 1 (P1), това беше групата, индуцирана от диазинон органофосфат в доза от 20 mg/kg телесно тегло, средната процентна площ на iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресията е 4,184±1,041 процента. Лекувана група 2(P2) е група, индуцирана от диазинон органофосфат в доза от 40 mg/kg телесно тегло и средната стойност на iNOS (Синтаза на азотен оксид)експресията беше 7.496±0.997 процента. Лекувана група 3(P3) е група, индуцирана от диазинон органофосфат в доза от 60 mg/kg телесно тегло и средната стойност на iNOS (Синтаза на азотен оксид)изразът беше 11,604 ± 0.864.

При отрицателна контролна група показа iNOS (Синтаза на азотен оксид)изразяване с нисък интензитет (1,340 ± 0,092 процента). McNaughton et al. (2002) установиха, че iNOS (Синтаза на азотен оксид)се изразява в нормални чернодробни ацини. Разпространението на iNOS (Синтаза на азотен оксид)в нормален черен дроб показва зоната около портала с най-силна експресия и интензитетът намалява по чернодробните ацини. Според Kubes (2000), iNOS (Синтаза на азотен оксид)може да осигури терапевтични ефекти, ако се регулира в правилното количество и на правилното място, iNOS има положителна роля, включително заздравяването на кожата и чревната лигавица, борбата с определени бактерии, потенциал за регулиране на Т-клетъчната пролиферация и диференциация и регулиране на набирането на левкоцити .

Лекуваната група показва значително увеличение на процентната площ на iNOS (Синтаза на азотен оксид) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

Увеличаването на ROS ще предизвика производството на провъзпалителни цитокини. Реактивните кислородни видове влияят върху транскрипцията на провъзпалителни цитокини, където високите нива на ROS ще бъдат последвани от високи нива на провъзпалителни цитокини, по същия начин, ако производството на ROS се инхибира с инхибитори, това също ще повлияе на намаляването на производството на провъзпалителни цитокини като IL{{0 }} и TNF (Naik и Vishva, 2012). Dunlop et al. (2014) и Pahan et al. (2000) заявяват, че TNF- и IL-1 играят роля в увеличаването на експресията на iNOS (Синтаза на азотен оксид)в тъканите чрез активиране на Nappar Kappa B(NF-kB), при което NF-kB навлиза в ядрото и се свързва с промоторната област на iNOS (Синтаза на азотен оксид). Повишеното производство на провъзпалителни цитокини ще индуцира iNOS (Синтаза на азотен оксид)и образуват прекомерни количества отАзотен оксид(НЕ) (Актан, 2004).

3.2. Анализ на бъбречна хистопатология

Резултатите от това изследване за ефекта на токсичността на диазинон върхубъбрекхистопатологичните характеристики, използващи оцветяването с хематоксилин-еозин (HE), са представени на Фигура 2. Хистологичната картина на бъбречната кора на плъх в групата с отрицателна контрола (K-) показва нормално състояние и не е открита аномалия. Това се доказва от появата на бъбречното тяло, проксималните и дисталните конвулсивни тубули със слой от кубовидни епителни клетки (Фигура 2(1)).

Хистопатологичната картина на бъбречната кора на плъхове в P1 групата показва аномалии, които се характеризират с наличието на клетки, подложени на кариолиза и хипертрофия. Клетките на кариолиза се характеризират с изчезването на клетъчното ядро, докато епителните клетки, подложени на хипертрофия, имат характеристики на увеличен размер на клетките, така че структурата на бъбречните тубули изглежда неправилна. Еритроцитите в междутубулното пространство могат да се видят на тази снимка, което показва наличието на кръвоизлив (Фигура 2(2). Хистопатологичната картина в група P2 показва аномалиите като подобни на група P1. Аномалии, които могат да се наблюдават в кората на бъбреците на P2 плъхове включват появата на клетки, подложени на кариолиза, клетъчна хипертрофия и кръвоизлив.В допълнение, структурата набъбректубулите изглеждат неправилни в сравнение с K-групата (Фигура 2(3)). Хистопатологичната картина на бъбречната кора на плъхове в групата P3 показва аномалии, както се вижда в хистопатологичната картина на бъбречната кора при Pl и P2 плъхове, характеризиращи се с появата на клетъчна хипертрофия, кариолиза и еритроцити в междутубулното пространство (кръвоизлив ). Може също да се наблюдава наличието на възпалителна клетъчна инфилтрация в тъканите (Фигура 2(4)).

Диазинон органофосфатът, който е даден на плъховете през устата, ще бъде усвоен от храносмилателния тракт, който след това ще бъде абсорбиран от червата, особено от дванадесетопръстника. Метаболизмът на органофосфатите се извършва главно в черния дроб, но в по-малка степен метаболизмът се извършва и в дланта и червата. Органофосфатът ще претърпи фаза 1 на метаболизма, който е процес на окисление, при който органофосфатът ще се разгради на оксон-органофосфатни метаболити и свободни серни йони с помощта на цитохромни (CYP) ензими (Gupta, 2009; Elersek и Metka 2011). След това оксон-органофосфатният метаболит навлиза в кръвния поток и отива в черния дроб за по-нататъшен метаболизъм. В черния дроб оксон-органофосфатните метаболити ще бъдат хидролизирани с помощта на ензимите карбоксилестераза (CE) и параоксоназа (PON), разделени на диалкил фосфат и напускане на групата. След това диалкилфосфатазата ще бъде катализирана от ензими във фаза 2 на метаболизма, които ще произведат молекули, които са хидрофилни и могат да бъдат екскретирани в урината, докато напускат групи (под формата на диетил), които могат да предизвикат оксидативен стрес в тялото. Диетилът е много реактивна молекула и може да реагира с хидроксилни радикални групи (-OH), за да образува нови свободни радикали (Elersek and Metka, 2011). Големият брой свободни радикали в тялото не може да бъде неутрализиран от ендогенни антиоксиданти, което води до дисбаланс между свободните радикали и антиоксидантите, което причинява оксидативно увреждане (Caramori и Papi, 2004). Това окислително увреждане възниква, защото диетил-хидроксилът като свободен радикал от органофосфатния диазинон е в състояние да произведе големи количества ROS (Uchendu et al., 2012). Увеличаването на ROS след това ще причини състояния на оксидативен стрес и ще инициира процеса на липидна пероксидация чрез вземане на водородни йони от полиненаситени мастни киселини (PUFA) за образуване на по-стабилни молекули. Процесът на разрушаване на връзката на PUFA може да причини клетъчна или тъканна некроза (Sharma et al., 2003).

Аномалиите са възникнали вбъбректубуларен епител поради директния контакт на епитела с токсичното вещество диазинон и вбъбректубул, има процес на реабсорбция и увеличаване в процеса на образуване на урина (Mescher, 2010). Токсичното вещество на диазинон, което все още е в кръвоносните съдове, ще бъде в пряк контакт с ендотела, като по този начин ще доведе до нарушаване на пропускливостта на васкуларната мембрана. Кръвоизливът в междутубулното пространство е причинен от нарушаване на пропускливостта на мембраната на кръвоносните съдове (перитубуларни капиляри), така че еритроцитите да могат да навлязат в тъканта (Djumadi et al., 2008). Увреждането на ендотелните клетки инициира възпалителни реакции, водещи до натрупване на макрофаги и тромбоцити извън и вътре в артериите. Появата на възпалителна клетъчна инфилтрация в увредената тъкан показва, че метаболитите от диазинон причиняват токсичност забъбрек(Khudair et al., 2017).

Въз основа на резултатите от хистопатологичния външен вид, бъбречната кора в групата на лечение е имала аномалии в сравнение с K-групата. Известно е, че P1 групата с най-ниската доза от 20 mg/Kg телесно тегло е показала увреждане набъбректубулни клетки в сравнение с К-групата.

Cistanche подобрява бъбречната функция

4. Заключение

Доказано е, че прилагането на диазинон с най-ниската доза от 20 mg/kg телесно тегло има токсичен ефект при плъхове, както е показано от значително увеличение на iNOS (Синтаза на азотен оксид)израз (стр<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

5. Препратки

[1] Aktan, F 2004 iNOS (Синтаза на азотен оксид)-Медиирано производство на азотен оксид и неговото регулиране. Науки за живота, 75:639-653.

[2] Ameriana, M. 2006. Perilaku Petani Sayuran dalam Menggunakan Pestisida Kimia.J. Hort.18(1):95-106,2008.

[3] Arthur,CG и EHJohn.1997.Fisiologi Kedokteran.EGC.Edisi9.1997.

[4] Aulanni'am, A. Rosdiana и NL Rahmah.2012. Ефикасността на Sargassum дублира екстрактите от Bory върху терапията на възпалителни заболявания на чревни екстракти при Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6: 144-154.

[5] Карамори, Г. и А. Папи. 2004. Антиоксиданти при отравяне с органофосфорни съединения. IntJ Pharm Bio Sci, 59 (2): 170-173.

[6] Cox, C.2000.Diazinon: Toxicology.Journal of Pesticide Reform/ Summer 20(2).

[7] Curthoys, NP и WM Orson.2014. Функция на проксималните тубули и отговор на ацидоза. Американското дружество по нефрология. Клиничен вестник на Американското дружество по нефрология 9:1627-1638

[8] Джумади, Х., и Х. Сугионо. 2008 г. Pengaruh Pemberian Insektisida Diazinon и Kurkumin Kunyit (Curcuma domestica) Per-Oral terhadap Perubahan Struktur Histologis Duodenum Mencit (Mus musculus).Jurnal Penelitian Sains & Teknologi,Vol.9(1):62-83.

[9] Dunlop, K., G.Kiranjot, K. Crystal, I.Julijana, D.Rupinder, D.Jean-Francois, ACKim, J. Amish, PJ McNamara и PJ Robert. 2014. Терапевтичната хиперкапния предотвратява инхалираната от инхалиран азотен оксид систолна дисфункция на дясната камера при млади плъхове. Elsevier Inc. Биология и медицина на свободните радикали 9: 35-49.

[10] Елерсек, Т. и Ф. Метка. 2011. Пестициди: Въздействието на излагането на пестициди. InTech Europe. Риека.

[11] Фрейзър, SK, CSJohn, CHGordon, B.Graham, B.Roger, N.Shinji, N.Akiyoshi, D.Beate и B.Axel.2012. Пролиферативни и непролиферативни лезии на пикочната система на плъхове и мишки. Токсикологична патология, 40:14S-86S

[12] Георгиевски, В.1., Б.Н.Аненков и В.Ц.Самохин. 2013. Материално хранене на животните: Изследвания в областта на селското стопанство и хранителните науки. Butterworths & Co. (Publishers) Ltd. Лондон. 160-161.

[13] Gupta, RC2012. Ветеринарна токсикология, второ издание. Elsevier inc. Waltham. САЩ.

[14] Hubrecht, R. и J. Kirkwood. 2010. UFAW: Наръчник за грижа и управление на лабораторни и други изследователски животни. Университетска федерация за хуманно отношение към животните. Обединеното кралство.

[15] Khudair, ZW, ASHanan и KE Manal. 2017 г. Хистопатологични промени, предизвикани във вътрешните органи на бял плъх след излагане на Diazinon.Bas..Vet.Res. 1 (2)

[16] Kubes, P.2000. Индуцируема синтаза на азотен оксид: Малко добро във всички нас. http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.1.6 [24 юли 2019 г.].

[17] McNaughton, L., P.Lakshmi, AMMaria, K. Norm, M. Irvin, M. Redwan, H. Outayba и WR Marek.2002. Разпределение на азотен оксид синтаза в нормален и циротичен човешки черен дроб. Сборник на Националната академия на науките Vol.99, No.26 17161-17166.

[18] Мешер, AL2010. Основна хистология на Джункейра: Издание на текст и атлас 12. Компаниите McGraw-Hill, Inc. Съединените американски щати.

[19] Mishra, BP 2013. Антиоксидантен статус и оксидативен стрес при отравяне с органофосфатни пестициди.IOSR.Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS)e-ISSN:2279-0853, p-ISSN:2279-0861 .Том 7, брой 6 (май.-юни 2013 г.), PP 20-24