за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Идентифициране и проверка на протеин на васкуларна целадхезия 1 като имуно-свързан хубген, свързан с тубулоинтерстициалното увреждане при диабетно бъбречно заболяване

Yan Jia и др

АБСТРАКТ

Диабетно бъбречно заболяване(DKD) е водещата причина захронично бъбречно заболяване(CKD) и краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD), но патогенезата не е напълно изяснена. Тубулоинтерстициалното увреждане играе критична роля в развитието и прогресията на DKD(диабетно бъбречно заболяване). Настоящото проучване има за цел да изследва профила на тубулоинтерстициалната имунна клетъчна инфилтрация и да разкрие основните механизми между увреждането на тубулните клетки и интерстициалното възпаление при DKD(диабетно бъбречно заболяване)използване на стратегии за биоинформатика. Първо, xCell анализът идентифицира имунни клетки, показващи значителни промени в DKD(диабетно бъбречно заболяване)тубулоинтерстициум, включително регулирани нагоре CD4 плюс Т клетки, Th2 клетки, CD8 плюс Т клетки, М1 макрофаги, активирани дендритни клетки (DCs) и конвенционални DCs, както и понижени Tregs. Второ, пироптозата е идентифицирана като основна форма на клетъчна смърт в сравнение с други форми на програмирана клетъчна смърт. Васкуларен клетъчен адхезивен протеин 1 (VCAM1) беше идентифициран като най-високо класирания хъб ген. Корелационният анализ показа, че VCAM1 е значително положително корелиран с пироптоза и инфилтрирани имунни клетки в тубулоинтерстициума. Повишаването на VCAM1 в тубулоинтерстициума на DKD беше потвърдено допълнително в кохортата на Европейската бъбречна кДНК банка и се наблюдаваше отрицателна корелация със скоростта на гломерулна филтрация (GFR). Нашето in vitro проучване потвърди повишената експресия на VCAM1 в HK-2 клетки при диабетни състояния, а инхибирането на пироптозата от дисулфирам намалява експресията на VCAM1, освобождаването на възпалителни цитокини и фиброзата. В заключение, нашето проучване идентифицира повишена експресия на VCAM1 в бъбречни тубулни клетки, които могат да взаимодействат с инфилтрирани имунни клетки, като по този начин насърчават фиброзата. Одобреното от FDA лекарство дисулфирам може да подобри фиброзата при DKD(диабетно бъбречно заболяване)чрез насочване към тубулна пироптоза и експресия на VCAM1.

КЛЮЧОВИ ДУМИ:DKD; тубулоинтерстициум; имунни клетки; пироптоза; VCAM1; дисулфирам

Cistanche може да лекуваДиабетно бъбречно заболяване

Кликнете върху Cistanche за бъбречно заболяване

Въведение

Диабетно бъбречно заболяване(DKD), едно от честите усложнения на диабета, е основната причина за хронично бъбречно заболяване (CKD) и краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD) в много развити и развиващи се страни [1,2]. Според доклад на Китайската мрежа за бъбречни заболявания (CK NET), DKD(диабетно бъбречно заболяване)представлява 26,70% от всички случаи на ХБН и налага голямо медицинско и икономическо бреме [2]. Патогенезата на DKD е сложна и включва множество различни пътища. Изясняването на патологичните характеристики и патогенезата на DKD ще помогне за подобряване на клиничното управление и идентифициране на нови терапевтични цели.

Въпреки че гломерулното увреждане е основната патологична характеристика на DKD(диабетно бъбречно заболяване), все повече доказателства наскоро разкриха, че тубулоинтерстициалната патология [3,4], като тубулна атрофия, интерстициална фиброза и интерстициални инфилтриращи имунни клетки, играе критична роля в развитието и прогресията на DKD(диабетно бъбречно заболяване)[5–7]. Биоинформационният анализ представлява ефективен метод за обработка на големи количества данни за изключително кратко време и предоставя ценна информация за заболяването. Въпреки това, биоинформатичните изследвания, изследващи тубулоинтерстициалната генна експресия и имунната клетъчна инфилтрация при DKD, са относително редки.

Целта на изследването е да се опишат характеристиките на DKD(диабетно бъбречно заболяване)тубулоинтерстициална имунна клетъчна инфилтрация и за идентифициране на някои ключови имунни и възпалителни гени, за да се осигурят нови прозрения за патогенезата и терапията на DKD. Първо, набор от данни за тубулоинтерстициален микрочип на DKD(диабетно бъбречно заболяване)беше изтеглен от базата данни Gene Expression Omnibus (GEO). Използвайки xCell [8], уеб-базиран инструмент, който извършва анализ на обогатяване на клетъчен тип на данни за генна експресия за 64 имунни и стромални клетъчни типа, ние първо изследвахме разликите в имунната клетъчна инфилтрация между бъбречните тъкани от индивиди с DKD(диабетно бъбречно заболяване)и нормални контроли. Второ, беше скриниран списък от имуносвързани диференциално експресирани гени (DEGs), сред които най-високо класираният ген, васкуларен клетъчен адхезивен протеин 1 (VCAM1), беше идентифициран като ген на имунен център при DKD(диабетно бъбречно заболяване). След това, набори от гени, свързани с различни форми на клетъчна смърт, бяха получени от GeneCards и пироптозата беше оценена като основна форма на клетъчна смърт, използвайки анализи на вариация на набор от гени (GSVA) ​​и анализ на обогатяване на набор от гени (GSEA). Освен това, корелационен анализ показа, че VCAM1 е положително свързан с тубулоинтерстициална имунна клетъчна инфилтрация и пироптоза. Повишената експресия на VCAM1 в тубулоинтерстициума на DKD беше потвърдена допълнително в кохортата на Европейската бъбречна кДНК банка (ERCB) и беше наблюдавано, че корелира отрицателно с бъбречната функция при пациенти с DKD. Проучване in vitro потвърди повишената експресия на VCAM1 в HK-2 клетки, култивирани при диабетни условия, и инхибирането на пироптозата от одобреното от FDA лекарство дисулфирам намалява експресията на VCAM1, освобождаването на възпалителни цитокини и фиброзата. Следователно, тубулната пироптоза и повишената експресия на VCAM1 могат да бъдат цели за имунотерапия на DKD.

Методи

Микрочипове данни

Наборът от данни за експресия на човешки ген GSE30529 беше изтеглен от Националния център за биотехнологична информация (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO, база данни. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array ) се състоеше от 10 DKD(диабетно бъбречно заболяване)тубулни проби и 12 контролни проби

Обработка на данни

Необработените данни в набора от данни GSE30529 бяха изтеглени и обработени с помощта съответно на пакета Limma и пакета Oligo [9,10]. Обработката на данни включва корекция на фона, нормализиране и изчисляване на израза. Когато множество сонди бяха картографирани към един генен символ, средното ниво на експресия на сондите беше изчислено и се разглежда като ниво на генна експресия на този ген. Сондите, които не са картографирани към гени, бяха премахнати.

Cistanche може да лекуваДиабетно бъбречно заболяване

Анализи на имунни и стромални клетки

Приложихме нов метод, базиран на генни подписи, xCell [8], за да оценим резултата за обогатяване на клетъчния тип и да определим профила на инфилтриращи имунни клетки в тубулоинтерстициума на пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване). xCell е метод за анализ на обогатяване на клетъчен тип, използващ анализ на обогатяване на набор от гени с една проба (ssGSEA), който изчислява резултатите за обогатяване за 64 типа клетки, включително 34 вида имунни клетки, 30 вида стромални клетки и други клетки. Той превъзхожда други интензивни in silico анализи (включително CIBERSORT), като обхваща повече видове имунни клетки и използва техника за компенсиране на разпространението, за да намали зависимостите между тясно свързани типове клетки. 34-те типа имунни клетки бяха категоризирани в девет групи, включително субпопулации CD4 плюс Т клетки, субпопулации CD8 плюс Т клетки, гама делта Т клетки (T δ клетки), NK клетки, NKT клетки, В клетъчни субпопулации, субпопулации моноцити/макрофаги, субпопулации на дендритни клетки (DC) и субпопулации на гранулоцити.

Анализи на обогатяване на набор от гени (GSEA) и анализи на вариация на набор от гени (GSVA)

Използвайки наборите от отличителни гени като набор от референтни гени, ние извършихме анализи на вариация на набор от гени (GSVA) ​​между DKD(диабетно бъбречно заболяване) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Бяха идентифицирани както пътищата на регулиране нагоре, така и надолу. GSEA беше извършена с настолното приложение GSEA [12] и процент на фалшиви открития (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Конструиране на генни комплекти, представящи различни форми на клетъчна смърт и анализ на обогатяване

Генни набори, представляващи различни форми на клетъчна смърт, бяха конструирани чрез търсене на ключови думи „пироптоза“, „некроза“, „некроптоза“, „апоптоза“, „фероптоза“ и „автофагия“ в базата данни на GeneCards (https://www.genecards .org/). Некодиращите протеини гени бяха премахнати. Генните набори са изброени в таблица S2. След това беше извършен набор от гени GSEA с помощта на настолното приложение GSEA за оценка на формата на клетъчна смърт в тубулоинтерстициума. Извършихме корелационни анализи на Pearson, за да изследваме връзката между основните пътища на клетъчна смърт и инфилтриращите имунни клетки в тубулоинтерстициума

Анализ на DEG и скрининг на гени на имунен център

DEG между пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)и здравите контроли бяха идентифицирани с помощта на пакета „Limma“ [13] в софтуера R. Коригирана P стойност<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(диабетно бъбречно заболяване). В настоящото проучване мрежите за взаимодействие протеин-протеин (PPI) на деветдесет и четири споделени гена бяха генерирани с помощта на базата данни STRING (https://string-db.org/) и визуализирани със софтуер Cytoscape (версия 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/). Резултат на взаимодействие, по-голям от 0.4 (средна степен на достоверност), се счита за статистически значим. CytoHubba, плъгин Cytoscape, беше използван за изследване на гени на мрежовия център на PPI [14]. Сред тях VCAM1 беше най-високо класираният ген. Анализите на обогатяване на тридесетте гена на имунния център, идентифицирани по-горе, бяха извършени с помощта на онлайн инструмента Metascape [15]. Освен това, доминиращите модули в PPI мрежата бяха идентифицирани с помощта на плъгина MCODE (версия 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) в софтуера Cytoscape.

Проверка на VCAM1 и корелационен анализ с бъбречната функция

Диференциалната експресия на VCAM1 в тубулоинтерстициума на пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)е валидиран в кохортата ERCB (31 здрави контроли и 17 пациенти с DKD). След това използвахме онлайн базата данни Nephroseq v5 (http://v5.nephroseq.org), интегрирана платформа за извличане на данни за набори от данни за генна експресия на бъбречни заболявания, за да потвърдим корелацията между експресията на VCAM1 и клиничните характеристики на пациенти с DKD, използвайки Корелационният анализ на Pearson в ERCB. p-стойност от<0.05 was="" considered="" statistically="">

Имунофлуоресцентно оцветяване за VCAM1

Парафинови бъбречни срезове от пациент с клинико-патологична диагноза DKD(диабетно бъбречно заболяване)бяха оцветени с VCAM1. Това беше одобрено от Комитета по изследователска етика на Първа болница на Пекинския университет (№ 20171280). Неспецифичното свързване беше блокирано с 3 процента BSA след фиксиране и термична обработка за извличане на антиген. Бъбречните срезове след това се инкубират с първично антитяло срещу VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) за една нощ при 4 градуса. Cy3-белязаното вторично антитяло е получено от Jackson ImmunoResearch. Бъбречна тъкан, съседна на тумор от проби от нефректомия, се използва като нормална контрола. Представителни изображения бяха заснети с помощта на камера Leica DFC 7000 T чрез софтуера Leica Application Suite V4.7.1.

Клетъчна култура

Клетки от човешки бъбрек 2 (HK-2), проксимална тубуларна епителна клетъчна линия на човешки бъбрек, бяха култивирани в DMEM (11885084, Gibco, САЩ), допълнен с 10 процента фетален говежди серум (10099141 C, Gibco, САЩ) и 1 процент пеницилин/стрептомицин (10378016, Gibco, САЩ) при 37 градуса с 5 процента CO2. Висока глюкоза (30 mM D-глюкоза, G8644, Sigma) [16] и TNF (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] се използва за индуциране на HK-2 клетъчно увреждане инвитро. Дисулфирам (DSL, 0,3 μM [18,19], NSC190940, Selleck), инхибитор на образуване на пори, беше добавен 3 часа преди индуцирането на HK-2 клетъчно увреждане.

Western blot

Общият протеин се екстрахира от HK{{0}} клетки с помощта на RIPA буфер (Sigma, R0278) и протеиновата концентрация се определя с помощта на комплект за анализ на протеин на Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23227). След това денатурираните протеини бяха разделени чрез електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и след това електрически прехвърлени към мембрани от поливинилиден дифлуорид (Millipore, IPVH00010). Мембраните бяха блокирани за 60 минути с 5 процента обезмаслено мляко, разтворено в Tris-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,1 процента Tween 20 (TBST). Блотовете се инкубират със следните релевантни първични антитела за една нощ при 4 градуса: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) и тубулин (ZSBio, TA-10, 1 :5000). Инкубирането с 1:1000 разреждане на HRP-конюгирано вторично антитяло се извършва в продължение на 1 час при стайна температура. След пет промивания с TBST, мембраните се инкубират с хемилуминесцентния субстрат (Millipore, WBKLS0100) в продължение на 5 минути и изображенията се заснемат с помощта на система Image Quant LAS 4000 Mini (GE Healthcare). Полуколичественият анализ беше проведен с помощта на софтуер ImageJ (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Изолиране на РНК и RT-PCR анализ

Общата РНК се екстрахира от HK-2 клетки с помощта на RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, DP419) съгласно инструкциите на производителя и се транскрибира обратно в cDNAs с помощта на FastKing RT Kit (Tiangen, KR116). Количественият PCR беше извършен с помощта на StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, САЩ) с двуетапни методи. Последователностите на използваните праймери са показани в таблица S4. Сравнителната генна експресия се изчислява с помощта на метода 2−ΔΔCt, както е описано по-горе.

Статистически анализ

Софтуерът GraphPad Prism 6.0 беше използван за статистически анализи и данните са представени като средни стойности ± SEM. Двустранен несдвоен t-тест беше приложен за сравнения между две групи. Разликите на ниво P < 0.05="" се="" считат="" за="" статистически="">

Cistanche може да лекуваДиабетно бъбречно заболяване

Резултати

Натрупаните доказателства наскоро разкриха, че тубулоинтерстициалната патология играе критична роля в развитието и прогресията на DKD(диабетно бъбречно заболяване). Целта на изследването е да се опишат характеристиките на DKD(диабетно бъбречно заболяване)тубулоинтерстициална имунна клетъчна инфилтрация и за идентифициране на някои ключови имунни и възпалителни гени, за да се осигурят нови прозрения за патогенезата и терапията на DKD. В това проучване ние изследвахме профила на тубулоинтерстициалната имунна клетъчна инфилтрация и идентифицирахме пироптозата като основна форма на програмирана клетъчна смърт при DKD(диабетно бъбречно заболяване)с помощта на биоинформационен анализ. VCAM1 беше идентифициран като най-високо класирания имуно-свързан хъб ген и беше положително корелиран с пироптоза и инфилтрирани имунни клетки. Освен това е потвърдено, че експресията на VCAM1 е повишена в бъбречни тубулни клетки, култивирани при диабетни условия. Одобреното от FDA лекарство дисулфирам инхибира пироптозата на бъбречните тубулни клетки и намалява експресията на VCAM1, нивата на възпалителни цитокини и фиброза in vitro.

1. Работни процеси за анализ на биоинформатика

Основните стъпки на работния процес са показани на Фигура 1. Първо оценихме инфилтрацията на имунни клетки в тубулоинтерстициални тъкани от пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване). След това пироптозата, основната форма на клетъчна смърт в тубулоинтерстициума, беше открита с помощта на GSEA и GSVA. След това прегледахме списък от гени, тясно свързани с инфилтрацията на имунните клетки, и идентифицирахме гени на центъра. Беше извършен корелационен анализ между инфилтрираните имунни клетки, пироптозата и VCAM1 на горния хъб ген. В допълнение бяха извършени клинично валидиране и валидиране на имунооцветяване на VCAM1. И накрая, ние допълнително проведохме in vitro проучване, за да потвърдим резултатите от биоинформационния анализ.

2. Анализи на деконволюция на имунни и стромални клетки

Използвахме xCell, който генерира резултати за обогатяване на клетъчен тип, използвайки масивни данни за генна експресия, за да определим типовете клетки, потенциално участващи в тубулоинтерстициално увреждане вдиабетно бъбречно заболяване. Резултатите за обогатяване на 64 типа клетки, включително 34 вида имунни клетки и 30 вида стромални и други клетки, бяха получени за всяка проба (Фигура 2 (а)). Топлинната карта на 34 резултата за обогатяване на имунни клетки беше илюстрирана, за да се идентифицира имунният пейзаж на DKD(диабетно бъбречно заболяване)тубулоинтерстициум (Фигура 2(b)). В сравнение с нормалните контроли, по-голямата част от резултатите за обогатяване на Т клетки са относително по-високи при пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване), с изключение на CD4 плюс Tcm, Tregs, Th1 клетки, CD8 плюс наивни Т клетки и NKT клетки. Резултатите за обогатяване на aDCs и cDCs са по-високи при пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)отколкото при контролите, докато резултатите за обогатяване на Pro-B клетки са по-ниски при пациенти с DKD. Резултатите за обогатяване на повечето подгрупи моноцити/макрофаги и гранулоцити не се различават значително между DKD(диабетно бъбречно заболяване)и нормални тъкани, с изключение на М1 макрофаги и неутрофили и еозинофили (Таблица 1).

Фигура 2. Анализ на имунната клетъчна инфилтрация от xCell в тубулоинтерстициума на DKD(диабетно бъбречно заболяване). ( а ) Сравнение на клетъчните резултати от 64 типа клетки в тубулоинтерстициума между DKD и контролната бъбречна тъкан в набора от данни GSE30529. ( b ) Клетъчният пейзаж на имунната микросреда в DKD(диабетно бъбречно заболяване). Топлинната карта представлява резултата за обогатяване на клетъчния тип на всеки тип имунна клетка за всички проби. DC, дендритна клетка; Tcm, Т клетка на централната памет; Tem, Т-клетка с ефективна памет; Т δ клетка, гама делта Т клетка.

3. GSVA и GSEA на набори от характерни гени

Проведохме GSVA и GSEA на набор от отличителен ген в набора от данни GSE30529, за да изследваме биологичните процеси в DKD(диабетно бъбречно заболяване)тубулоинтерстициум. Сигналните пътища на „интерферон-алфа отговор“, „интерферон-гама отговор“ и „комплемент“ са значително активирани в патогенезата на тубулоинтерстициалното увреждане при пациенти с DKD (Фигура 3(a)) и е показано обобщение на резултатите от GSVA в таблица S1. След това извършихме GSEA на трите набора гени и открихме, че те са положително обогатени в набора от данни. Нормализираните резултати за обогатяване (NES) бяха 1,89, 1,89 и 1,7{{10}}, с нормализирани p стойности (NOM p стойности) от 0.000, 0,002 и 0,019, съответно (Фигура 3(bd)). Всички значително обогатени пътища, идентифицирани с помощта на GSEA, са показани в таблица 2. Тези данни предполагат, че тубулоинтерстициалният имунен отговор играе важна роля в патогенезата на DKD(диабетно бъбречно заболяване).

4. GSEA и GSVA на набори от гени, свързани с различни форми на клетъчна смърт

Клетъчната смърт включва пироптоза, некроза, некроптоза, апоптоза, фероптоза и аутофагия, които имат различни патофизиологични механизми и сигнални пътища. Съобщава се, че различни форми на програмирана клетъчна смърт са свързани с възпалителни и имунни реакции. Конструирахме генни набори от няколко вида клетъчна смърт от GeneCards (Таблица S2) и след това извършихме както GSEA, така и GSVA, за да изследваме участието на клетъчната смърт в тубулоинтерстициалното възпаление при пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване). GSEA показа, че само комплектите гени за пироптоза са значително обогатени при пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)в сравнение с нормалните контроли (NES=1.65, FDR q стойност=0.023, FWER=0.013) (Фигура 3(e)). Междувременно резултатът на GSVA за пироптоза е най-високият сред всички анализирани различни видове клетъчна смърт (Таблица S3). Въз основа на този резултат, пироптозата може да играе роля в патогенезата на тубулоинтерстициалните увреждания при пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване).

Фигура 3. Анализи на обогатяване на набор от гени (GSEA) и анализи на вариация на набор от гени (GSVA). ( а ) Барплота на резултатите от GSVA на 50 набора от отличителни гени. (b)-(d) GSEA резултати за „Hallmark_ интерферон-алфа отговор“, „Hallmark_ интерферон-гама отговор“ и „Hallmark комплемент“. (д) GSEA резултат от пироптоза.

5. Корелация между резултатите за обогатяване на пироптозата и инфилтрацията на имунните клетки

Резултатите за обогатяване на GSVA за пироптоза са корелирани с дела на имунната клетъчна инфилтрация чрез извършване на корелационен анализ на Pearson за оценка на корелацията между пироптоза и инфилтрация на имунни клетки. Наблюдавахме значителна корелация между 15 вида имунни клетки и пироптозата (Фигура 4), което предполага тясно взаимодействие между имунните клетки и пироптозата.

6. Откриване на основни гени

Извършен е диференциален експресионен анализ за по-нататъшно изследване на връзката между бъбречните тубулни клетки и интерстициалните имунни клетки. Четиристотин и осем DEG бяха идентифицирани между DKD(диабетно бъбречно заболяване)групата и контролната група, сред които 65 са регулирани надолу и 343 регулирани нагоре (Фигура 5). Списък с имуно-свързани гени беше изтеглен, за да се идентифицират имуно-свързани DEGs, и деветдесет и четири имунни гена на центъра бяха получени от два набора от данни (DEGs и имуно-свързаният генен списък) чрез диаграма на Venn (Фигура 6(a)). PPI анализът на тези деветдесет и четири централни имунни гена разкри 97 възли и 694 взаимодействия (Фигура S1). Първите 30 възли, изчислени от алгоритъма MCC, бяха идентифицирани като гени на хъб (Фигура 6 (b) и Таблица 3). След това беше извършен анализ на обогатяване на хъб гени. „Отхвърляне на алографта“, „интерферон-гама отговор“, „възпалителен отговор“, „интерферон-алфа отговор“, „епителен-мезенхимален преход“ и „комплемент“ бяха най-обогатените елементи в анализа на отличителните белези. „Ревматоиден артрит“, „взаимодействие с цитокинов рецептор“, „Toll-подобен рецепторен сигнален път“, „коклюш“ и „NF-kappa B сигнален път“ бяха най-обогатените термини на KEGG. „Клетъчен отговор на интерферон гама“, „хемокинова активност“, „левкоцитна клетъчна адхезия“ и „регулиране на производството на цитокини“ бяха най-обогатените GO термини (Фигура 6 (c)). Освен това системата за оценяване на MCODE идентифицира два клъстера с резултат, по-голям или равен на 5. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 и CXCL6 бяха хъб възли с по-високи степени на възел в модул 1 (Фигура 6(d)) и CD1C, EGF, FCER1G, CD3D и CD48 бяха централни възли в модул 2 (Фигура 6 (e)).

7. Корелация между експресията на VCAM1 и инфилтриращите имунни клетки

Сред идентифицираните хъб гени, най-високо класираният ген, VCAM1, беше идентифициран като имунен хъб ген при DKD(диабетно бъбречно заболяване). Експресията на VCAM1 е значително повишена при пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)(Фигура 7 (а)). Корелационният анализ разкрива, че експресията на VCAM1 е положително корелирана с CD4 плюс Т клетки (r=0.6877, P=0.0004), CD4 плюс Т клетки на паметта (r=0.7102, P=0.0002), Th2 клетки (r=0.7358, P <0,0001), cd8="" плюс="" tcm="" (r="" {{18="" }}.6026,="" p="0.0030)," t="" δ="" клетки="" (r="0.5864," p="0.0041)," nk="" клетки="" (r="0.5692," p="0.0057)," макрофаги="" (r="0.5068," p="0.0161)," m1="" макрофаги="" (r="0.4441," p="0" .0384),="" adcs="" (r="0.4814," p="0.0233)" и="" cdcs="" (r="0.6562," p="0.0009)," но="" отрицателно="" корелирани="" с="" наивен="" cd8="" плюс="" т="" клетки="" (r="−0,4909," p="0.0204)" и="" nkt="" клетки="" (r="−0,5548," p="0.0074)" (фигура="" 7(b)="">

8. Корелация между експресията на VCAM1 и пироптозата

Корелационният анализ на Pearson е извършен, за да се изследва дали повишената експресия на VCAM1 в тубулоинтерстициума на пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)е свързано с пироптозата. Експресията на VCAM1 е тясно свързана с пироптозата (r=0.6118, P=0.0025) (Фигура 7(c)), което показва, че пироптозата може да индуцира експресия на VCAM1.

9. Проверка, клинична значимост и имунофлуоресцентно валидиране на експресията на VCAM1

Направихме съответен анализ на пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)от ERCB за валидиране на промяната в израза VCAM1 в DKD(диабетно бъбречно заболяване)тубулоинтерстициум. Последователно нивата на VCAM1 mRNA са значително по-високи при пациенти с DKD(диабетно бъбречно заболяване)(Фигура 8(а)). Експресията на VCAM1 е отрицателно корелирана със скоростта на гломерулна филтрация (GFR) (r=−0.5920, P=0.0123) (Фигура 8(b)) и положително корелира със серума нива на креатинин (r=0.5189, P=0.0328) (Фигура 8(c)). Освен това извършихме имунофлуоресцентно оцветяване за VCAM1 в бъбречната тъкан на пациент с DKD(диабетно бъбречно заболяване)и установява, че експресията на VCAM1 в бъбречните тубули е значително повишена в сравнение с тази в нормалните бъбреци (Фигура 8 (d)).

10. DSL инхибира индуцираната от HG HK{2}} клетъчна пироптоза, VCAM1 експресия и възпаление

Изложихме култивирани HK{0}} клетки на висока глюкоза (HG) и TNF- в продължение на 48 часа, за да определим допълнително връзката между пироптозата на тубулните клетки, експресията на VCAM1 и тубулоинтерстициалния имунен отговор при индивиди с DKD(диабетно бъбречно заболяване). Тъй като сърцевината на клетъчната пироптоза е образуването на мембранни пори, индуцирано от разцепен GSDMD, ние открихме нивата на GSDMD N-терминалния домен (GSDMD-NT) и VCAM1, използвайки Western blotting. Както HG, така и TNF-индуцират значително повишаване на нивото на GSDMD-NT, което показва появата на GSDMD-медиирана пироптоза (Фигура 9 (а)). Експресията на VCAM1 се повишава статистически значимо в HG и TNF-групите (Фигура 9(b)). Дисулфирам (DSL) е ефективен инхибитор на образуването на пори на GSDMD [18]. Предварителната обработка с DSL облекчи повишаването на нивата на GSDMD-NT, което показва, че клетъчната пироптоза е потисната. Междувременно, експресията на VCAM1 беше намалена в предварително третирани с DSL HG и TNF-групи (Фигура 9(ab)). След това възпалителният цитокинов профил се определя с помощта на qPCR. Резултатите показват, че повишените нива на MCP-1, IL-1 и IL-18 мРНК, индуцирани от HG, са значително намалени след DSL предварителна обработка. В групата с TNF, нивото на IL-1 намалява значително в групата, лекувана предварително с DSL, а нивата на MCP-1 и IL-18 не се променят значително. Не са открити значителни промени в нивата на IL-6 и IL-8 тРНК в нито една група. Важно е, че нивата на иРНК на TGF- 1 също бяха намалени в групите, предварително третирани с DSL. По този начин, пироптотичните тубулни клетки повишават експресията на VCAM1 при диабетни състояния и лечение, премахващо пироптозата, инхибира експресията на VCAM1, възпалението и фиброзата в HK-2 клетки.

Cistanche може да лекуваДиабетно бъбречно заболяване

Щракнете тук за част II

От: „Идентифициране и проверка на васкуларен клетъчен адхезивен протеин 1 като имуно-свързан хъб ген, свързан с тубулоинтерстициалното увреждане при диабетно бъбречно заболяване“ от Yan Jia, et al

---БИОИНЖЕНЕРСТВО 2021, ТОМ. 12, БР. 1, 6655–6673