Как да предотвратим и намалим образуването на камъни в бъбреците?

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Част Ⅰ Ⅱ: Еверсия на фосфатидилсерин, регулирана от фосфолипид скрамблаза, активирана от TGF‑ 1/Smad сигнализиране в ранния стадий на образуване на камъни в бъбреците

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Въведение

Уролитиазата е едно от най-честите заболявания, засягащи хората и е свързано с множество урологични усложнения [1]. Съобщава се, че калциевият оксалат (CaOx) уврежда култивираните бъбречни тубулни клетки, след което фосфатидилсеринът (PS) на клетъчната мембрана се преобръща от вътрешния към външния слой in vitro, за да играе важна роля вкамък в бъбрекаобразуване [2]. Подобни констатации са докладвани от различни проучвания [3-6], проведени на клетъчно ниво. Въпреки това, механизмът, който е в основата на екстернализацията на PS в клетките на бъбречните тубули, причинени от CaOx-медиирано увреждане, остава неясен. Предишни проучвания показват, че висока концентрация на калциев оксалат води до свръхпроизводство на реактивни кислородни видове (ROS) [7], което впоследствие допринася за екстернализиране на PS в клетките на бъбречните тубули, което води до нуклеация и растеж на CaOx кристали [8]. ROS и липидната пероксидация силно активират фосфолипидната скрамблаза (PLSCR) [9], докато излагането на ROS акцептори, като глутатион, коензим Q10 или идебенон (синтетичен коензим Q10 хомолог), намалява активирането на PLSCR при поликистоза на бъбреците [10] . PLSCR, който е закотвен към клетъчната мембрана [11], функционира като един от трите фосфолипид-преобръщащи ензима, способни да катализират бързото двупосочно движение на PS от двете страни на мембраната по протежение на концентрационен градиент [12]. При физиологични условия клетъчната мембрана е в асиметрично състояние и PLSCR няма ефект върху мембраната [13]. Въпреки това, след увреждането на еукариотните клетки, PLSCR се активира и премества PS от вътрешния към външния слой [14,15]. Освен това, свръхекспресията на PLSCR в К1 клетки от яйчник на китайски хамстер, според съобщенията, стимулира екстернализацията на PS, засилвайки движението на PS навън към клетъчната повърхност по време на апоптоза [16]. Следователно, ние предположихме, че PLSCR също участва в екстернализацията на PS в клетъчната мембрана на бъбречните тубули чрез активиране на ROS.

Потенциален молекулярен механизъм на индуцирано от оксалат производство на ROS възниква чрез индуциране на TGF- 1/Smad сигнализиране, което може да играе роля в производството на ROS [17,18]. В действителност се съобщава, че сигнализирането на TGF- 1/Smad участва в безброй бъбречни заболявания, като гломерулонефрит, бъбречна интерстициална фиброза и нефролитиаза[19]. Нещо повече, мононуклеарните клетки, третирани с TGF- 1, проявяват PSекстернализация в клетъчната мембрана, като причиняват обръщане на PS от вътрешния към външния слой [20]. Въпреки това, доколкото ни е известно, връзката между TGF- 1/Smad сигнализиране и PSeversion в клетъчните мембрани на бъбречните тубули остава неизвестна. Ние предположихме, че TGF- 1 участва в PS еверсията в клетъчните мембрани на бъбречните тубули чрез активиране на PLSCR в ранния стадий на плъховекамък в бъбрекаобразуване, медиирано от ROS.

Затова проучихме дали TGF- 1/Smad сигнализирането стимулира екстернализацията на PS чрез активиране на ROS и дали TGF активира PLSCR в клетъчната мембрана на бъбречните тубули по време на ранния стадий накамък в бъбрекаразвитие in vitro и in vivo, като по този начин се поставя теоретична основа за етиологията накамък в бъбрекаобразуване.

Щракнете върху Cistanche DHT за бъбречно заболяване

Материали и методи

Плъх модел на образуване на CaOx камъни в бъбреците в ранен стадий

Шестдесет чисти 3-месечни мъжки плъхове Wistar с тегло 200±20 g бяха осигурени от Центъра за експериментални животни към Медицинския университет в Харбин и настанени при стайна температура (22 градуса ±2 градуса) и 50-70 процента влажност. След 3 дни адаптивно размножаване, те бяха разделени на случаен принцип в три групи (20 плъха/група) - контролна,камък в бъбрека, икамък в бъбрекаплюс SB431542 (инхибитор на TGF- 1/Smad сигнален път).

Камък в бъбрекаобразуването започва като ранна патологична промяна след увреждане на бъбречните тубулни клетки [21,22]. За изследване на този процес на нараняване, модел на плъх в ранен стадийкамък в бъбрекае установена формация, тъй като все още не е докладван стандартизиран подход. За да наблюдаваме ранните промени след увреждане на бъбречните тубулни клетки, ние приложихме метода, докладван от Liet al. [23]. Накратко, на плъховете в контролната група са прилагани 2 mL дестилирана вода дневно чрез орална сонда, докато на плъховете вкамък в бъбрекана групата са прилагани 2 mL 1% разтвор на етиленгликол и 1% разтвор на NHCl дневно чрез орална сонда. Плъховете вкамък в бъбрекаплюс група SB431542 бяха инжектирани интраперитонеално с ко-разтворител SB431542 (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Шанхай, Китай) на всеки 7 дни [24]. Храна и вода бяха осигурени ad libitum. На 14-ия ден плъховете бяха евтаназирани чрез предозиране на анестетик (пентобарбитал натрий, 200 mg/kg, чрез интраперитонеална инжекция) и техните бъбреци бяха изрязани. Левите бъбреци се съхраняват незабавно в течен азот за последващо откриване на протеин. Десните бъбреци бяха фиксирани и след това дехидратирани и поставени в парафинов восък. Всички проучвания върху животни са проведени в съответствие с ръководството на Националния здравен институт за грижа и използване на лабораторни животни. Експерименталните процедури бяха одобрени от Комитета по етика при използване на експерименти с животни на Първата свързана болница на Медицинския университет в Харбин (номер на одобрение: 2020005, Харбин, Китай).

Образуване на кристали в бъбречната тъкан

Тъканните проби бяха оцветени с помощта на метода Pizzolato [23] и кристали CaOx бяха наблюдавани под оптичен микроскоп с поляризирана светлина (Sinico Optical Instrument Co., Шенжен, Китай). Пицолато-позитивните региони бяха измерени и изразени като пермилни възрасти на общата тъканна площ на напречните сечения с помощта на ImageJ 1.49v (Национални здравни институти, САЩ).

Откриване на PS в клетъчната мембрана на бъбречните тубули in vivo чрез поточна цитометрия

Експозицията на PS на бъбречните епителни клетки беше оценена с помощта на тест за оцветяване с анексин V, маркиран с флуоресцеин изотиоцианат (FITC), както е описано по-горе [2]. Клетките се наблюдават (във всяка група) под конфокален лазерен микроскоп (Olympus, Токио, Япония). Количеството на PS екстернализация се определя като процент на Анексин V-положителни клетки. Флуоресценцията на Анексин V на пробите се измерва с помощта на поточен цитометър (488 nm възбуждане/530 nm излъчване; Beckman Coulter, Brea, СА, САЩ).

Измерване на нивата на TGF- 1 и Smad7 в клетъчната мембрана на бъбречните тубули чрез Western blotting

След възстановяване на замразените тъканни проби, протеинът се екстрахира с помощта на комплекта за екстракция на естествен мембранен протеин ProteoExtract(M-PEK) (MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA) и концентрацията на протеин се определя с помощта на Bio-Rad протеинов анализ комплект (Херкулес, Калифорния, САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя. Впоследствие 40ug протеин се зареждат върху 8 процента SDS-полиакриламиден гел (подреждащ гел 100 V, разделящ гел 200 V) в продължение на 1 час при електроден постоянен ток от 300 mA. Протеините в гела се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана (Kexing Co., Пекин, Китай), блокират се за 1 час при 37 градуса в 5 процента обезмаслено мляко на прах и се инкубират за една нощ при 4 градуса С с овчи анти-плъх TGF 1 ( ab208466; Abcam, Cambridge, UK) и Smad7 (66 478; Proteintech, Wuhan, Китай) антитела [25]. Беше добавено белязано с пероксидаза от хрян заешко анти-овче вторично антитяло (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Пекин, Китай) и се инкубира при 37 градуса за 1 час. Сигналът беше открит с помощта на подобрения хемилуминесцентен реагент (Abcam). Положителните ленти бяха анализирани с помощта на софтуер за анализ на оптична плътност на гела Gel-Pro 4.0 и беше измерена кумулативната оптична плътност (IOD стойност), като R-стойността представлява относителното протеиново съдържание, както следва: R=референтна IOD стойност на PLSCR(таргет)/референтна IOD стойност на GAPDH (референтен протеин).

Клетъчна култура и РНК интерференция

Бъбречна епителна клетъчна линия (MDCK клетки, CCL34, пасажи 53-90; ATCC, Манасас, Вирджиния, САЩ) се отглежда в модифицирана среда на Dulbecco Eagle, допълнена с антибиотици (10{{1{{14} }}} U/mL пеницилин, 100 mg/mL стрептомицин; Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и 10 процента фетален говежди серум (Life Technologies Co.) при 37 градуса в 5 процента CO, атмосфера и субкултивиран с 0,25 процента трипсин и 1 тМ етилендиаминтетраоцетна киселина (Life Technologies Co., Калифорния, САЩ). Клетките бяха третирани с CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в продължение на 2 часа и с 0,5 mM CaOx и 100 ug/mL неутрализиращо анти-TGF- 1 антитяло (R&D Systems, Минеаполис , MN, САЩ) за 2 часа. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра.

За да се определи ролята на PLSCR в PS eversion, бъбречните тубулни епителни клетки бяха трансфектирани с PLSCR siRNA [26]. siRNA е проектирана и синтезирана от Anhui General Biological System (Anhui, Китай; виж Таблица 1). LipofectamineTM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) е използван за трансфекция съгласно инструкциите на производителя . След 24 часа трансфекция, клетките се усвояват с трипсин, центрофугират се при 1000 × g за 5 минути, промиват се два пъти с PBS и се центрофугират отново. Супернатантата се изхвърля и пелетата се суспендира в PBS, за да се образува едноклетъчна суспензия с плътност 1 × 10 градуса клетки/mL. Положителната скорост на експресия на FAM (карбоксифлуоресцеин) е 93 процента ±5 процента, както е определено чрез поточна цитометрия. За по-нататъшна оценка на връзката между TGF 1 и PLSCR, клетките бяха третирани с 0,5 mM CaOx или 10 ng/mL TGF- 1 за 2 часа и впоследствие трансфектирани с PLSCR siRNA.

Измерване на нивото на PLSCR в мембраните на бъбречните тубулни клетки чрез Western blotting

Протеинът се екстрахира с помощта на комплект за екстракция на естествен мембранен протеин ProteoExtract (Chemical Book Co., Пекин, Китай), а концентрацията на протеин се определя с помощта на комплект за анализ на протеин Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Пекин, Китай). Впоследствие 4 0 ug протеин се зареждат върху 8 процента SDS-полиакриламиден гел (подреждащ гел 100 V, разделящ гел 200 V) за 1 час при постоянен ток от 300 mA. Протеините в гела се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана (Kexing Co., Shenzhen, Китай) и се блокират с 5 процента обезмаслено мляко за 1 час при 37°C и се инкубират една нощ при 4 градуса с овче анти-плъхово PLSCR моноклонално антитяло (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Гуанджоу, Китай). След това се добавя заешко анти-овче вторично антитяло, белязано с пероксидаза от хрян (1:400) и сместа се инкубира при 37 градуса С за 1 час. След промиване на мембраната, сигналът беше открит с подобрен хемилуминесцентен реагент (Abcam, Guang-zhou, Китай). Положителните ленти бяха анализирани с помощта на софтуер за анализ на оптична плътност Gel-Pro 4.0gel и беше измерена IOD стойността, като R-стойността представлява относителното протеиново съдържание, както е описано по-горе.

Таблица 1 siRNA последователности за PLSCR

Измерване на разпределението на мембранния фосфатидилсерин

Количеството изкривяване на PS на клетъчната мембрана се определя с помощта на метода за охлаждане на флуоресценцията, описан от Kim et al [27]. и нашия изследователски екип [2], с нитробензен-2-окса-1,3-диазол (NBD, Шанхай, Китай) като флуоресцентна сонда. След маркиране на PS във външния слой на клетъчната мембрана с NBD, клетките се култивират в PBS, съдържащ 5 mM диизопропилфлуорофосфат. След това се добавя PBS, съдържащ калциев оксалат (1.0 mM) и клетките се инкубират при 37 градуса. Равно количество клетъчна суспензия се изхвърля на всеки 10 минути и интензитетът на флуоресценция се записва с помощта на RF -5000 спектрофлуорометър (Shimadzu, Kyoto, Japan). Настройките на спектрофлуорометъра бяха както следва: 10 nm ширина на процепа за дължина на вълната на излъчване от 530 nm; и 5 nm ширина на процепа за дължина на вълната на възбуждане от 470 nm. След това средната стойност на флуоресценция (FT) беше записана през 50-те години. Средният намален интензитет на флуоресценция (FD) също се записва след използване на разтвор на дитионит за потушаване на флуоресценцията на NBD от външния слой на клетката. След това беше добавен 1 процент (w/v) Triton X-100 за пропускливост на клетъчната мембрана. След това флуоресценцията на NBD от вътрешния слой на клетъчната мембрана се потушава и интензитетът на флуоресценция (FO) се записва. Процентът на NBD-PS във вътрешните лобули по-късно беше изчислен с помощта на следното уравнение: процентна възраст на интернализирания NBD-PS=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Процентът на екстернализация на PS се определя съгласно принципа, използван за измерване на интернализацията на NBD-PS. Процентът на NBD-PS във външните лобули също беше изчислен с помощта на следното уравнение: процент на NBD-PS във външните лобули=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Статистически анализ

Непрекъснатите променливи се изразяват като средно ± стандартно отклонение. Използвани са непараметричен сдвоен тест за ранг-сума, t-тест и хи-квадрат тест. Всички анализи бяха извършени с помощта на софтуер SPSS 19.0(SPSS, Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ). Резултати с P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Резултати

TGF- 1/Smad сигнализирането стимулира екстернализиране на PS in vivo

Образуване на кристали в бъбречна тъкан на модел на плъх

За установяване на плъх модел на ранен етапкамък в бъбрекаобразуване, етилен гликол и амониев хлорид се прилагат в стомаха на плъхове в продължение на 2 седмици и след това всеки бъбречен участък се изследва с цифров микроскоп. В пробите от контролната група се наблюдават нормални бъбречни тубулни структури без образуване на кристали на 14-ия ден (Фигура 1А). Когато бъбречната тъкан откамък в бъбрекагрупата е наблюдавана чрез микроскопия, бъбречните тубули изглеждат разширени с видими микрокристали; случайно натрупване на CaOx кристали се наблюдава в някои бъбречни тубули, което показва успешното установяване на плъх модел на ранен стадийкамък в бъбрекаобразуване и генериране на увреждане на клетките на бъбречните тубули.

Наличие на PS в клетъчната мембрана на бъбречните тубули

Анексин V-FITC, флуоресцентна молекула, която се свързва с PS на клетъчната повърхност, се използва широко за откриване на преразпределение на PS. В нашето изследване, MDCK клетки в нормалната контрола,камък в бъбрека, икамък в бъбрекаплюс SB431542 групи се наблюдават под конфокален лазерен микроскоп (Фигура 1В). Скоростта на PS-версия се увеличи презкамък в бъбрекагрупа в сравнение с тази в контролната група (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">камък в бъбрекаплюс групата SB431542 показа по-ниско базално ниво на екстернализация на PS от тези вбъбреккамъкгрупа (П<0.05, fig.="" 1c,="">

Измерване на нивата на TGF- 1 и Smad7

Нивото на TGF- 1 вкамък в бъбрекагрупата се определя количествено чрез Western blotting. Типичен уестърн блот е показан на Фигура 2А заедно с денситометричния анализ на нивото на TGF- 1. Стойностите се нормализират към тези на контролата и се изразяват като съотношение на TGF- 1 към тубулин. Добавянето на етилен гликол и NH Cl значително повишава нивото на TGF- 1 и намалява нивото на Smad7 в сравнение с тези в контролните клетки (Фигура 2A); обаче, лечението с SB431542 плюс етиленгликол и NH води до значително понижено ниво на TGF- 1 и повишено ниво на Smad7 в сравнение с тези в клетки, третирани с етиленгликол и NH, Cl.

TGF активира активността на PLSCR в клетъчната мембрана на бъбречните тубули in vitro

PLSCR

Нивото на PLSCR се оценява чрез Western blotting. Клетките се третират с CaOx в продължение на 2 часа. Нивото на PLSCR е незначително в контролните клетки, но значително се повишава в групата на CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Нарушено движение на NBD-PS навътре

Ние определихме навътре и навън движенията на PS в бъбречната тубулна епителна клетъчна мембрана, за да оценим активността на PLSCR. За да преценим дали PLSCR влияе върху движението на PS от външната листовка към вътрешната листовка на плазмената мембрана, ние интегрирахме флуоресцентно белязан PS (NBD-PS) във външната листовка на плазмената мембрана и наблюдавахме нейната интернализация (фиг.3). Количеството NBD-PS, интернализирано от MDCK клетки в контролната и CaOx групите, е съответно приблизително 46,2 процента и 17,8 процента. Следователно, скоростта на интернализация на PS в клетките на CaOx групата е значително по-ниска от тази в клетките на контролната група (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Фигура 1. Образуването на кристали и екстернализацията на PS са наблюдавани в групите контрола, камъни в бъбреците и камъни в бъбреците плюс SB431542.

(A) Образуване на кристали в бъбречната тъкан на 14-ия ден; стрелката показва микрокристални структури. (B) MDCK клетки се наблюдават чрез конфокална лазерна микроскопия.

(C) Поточни цитометрични графики на скоростта на еверсия. (D) Степен на отклонение (проценти). Триъгълникът обозначава P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">камък в бъбрекагрупа

Подобрено NBD‑PS движение навън

За да се определи дали транспортът на PS навън се влияе от оксалат, MDCK клетките бяха вътреклетъчно белязани с NBD-PS и беше определена степента на неговото движение към листовката с примерен микрофон. Инкубационната среда съдържа говежди серумен албумин (1 процент w/v), който бързо екстрахира повърхностно експресирания NBD-PS. Приблизително 34,5 процента от NBD-PS мигрира към външната листовка в контролните клетки, докато скоростта на изходящ трансфер на PS в клетките от CaOx групата е увеличена до 75,3 процента в сравнение с тази на общия вътрешен белязан NBD-PS, която е значително по-висока от че в клетките на контролната група (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Фиг.2 Експресия на TGF- 1/Smad в контролата, камъни в бъбреците и камъни в бъбреците плюс SB431542 групи и експресия на PLSCR в клетъчната мембрана на бъбречните тубули.

(A)TGF- 1/Smad израз. (B) Относителни нива на фосфолипид скрамблаза (PLSCR) и представителен блот с експресия, нормализирана към тази на GAPDH.P<>

Триъгълникът обозначава P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА ЧАСТ Ⅱ