Идентифициране на Sitogluside като потенциален агент за намаляване на пигментацията на кожата чрез мрежова фармакология

Контакт: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo, 1 Hongliang Zeng, 2 Chuhan Fu, 1 Jinhua Huang, 1 Jianyun Lu, 1 Yibo Hu, 1 Ying Zhou, 1 Liping Luo, 1 Yushan Zhang, 1 Lan Zhang, 1 Jing Chen, 1 и Qinghai Zeng 1

Много традиционни китайски лекарства (ТКМ) сизбелване на кожатасвойства са записани в предписанията Ben-Cao-Gang-Mu и infolk, а някои литературни източници потвърждават, че техните екстракти имат потенциала да инхибиратпигментация. Въпреки това, никакви систематични проучвания не са идентифицирали специфичните регулаторни механизми на потенциалните активни съставки. Целта на това проучване беше да се изследват съставките в ТКМ, които инхибират кожатапигментациячрез мрежова фармакологична система и за изследване на основните механизми. Идентифицирахме 148 потенциални активни съставки от 14 TCM и въз основа на средната "степен" на топологичните параметри, петте най-добри TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba), които са най-вероятно да причинятизбелване на кожатачрез противовъзпалителни процеси бяха избрани. Ситоглузид, най-честата съставка в първите пет TCM, инхибира меланогенезата в човешки меланомни клетки (MNT1) и миши меланомни клетки (B16F0) и намалява кожатапигментацияв риба зебра. Освен това, механистично изследване разкри, че ситоглузидът е способен да регулира надолутирозиназа(TYR) експресия чрез инхибиране на ERK и p38 пътищата и инхибиране на TYR активността. Тези резултати показват, че мрежовата фармакология е ефективен инструмент за откриване на естествени съединения със свойства за избелване на кожата и определяне на техните възможни механизми. Sitogluside е нова активна съставка за избелване на кожата с двоен регулаторен ефект, който инхибираTYRизразяване и дейност.

Кликнете, за даCistanche DHT екстракт за избелване на кожата

Въведение

Меланинът не само определя цвета на човешката кожа, очи и коса, но също така играе ключова роля в камуфлажа, мимикрията, социалната комуникация и защитата от ултравиолетовите лъчи. Въпреки това, когато меланинът е свръхпродуциран и необичайно разпределен в епидермиса, това причинява разнообразие на състояния, като лунички и мелазма, които могат да повлияят негативно на възприеманата от човека красота и социална увереност [1]. Меланинът е крайният продукт на L-тирозин след множество етапи на ензимни реакции и се синтезира в меланоцитни меланозоми [2]. В кожата меланоцитите са разположени в базалния слой на епидермиса и могат да произвеждат и прехвърлят зрели меланозоми към кератиноцитите, като по този начин причиняват кожнипигментация [3]. TYRе основният ограничаващ скоростта ензим в производството на меланин [4], а свързаният с микрофталмия транскрипционен фактор (MITF) е основният транскрипционен фактор, който регулира транскрипционната експресия на TYR [5].

Наскоро проучвания установиха, че възпалителните реакции играят важна роля в регулирането на меланогенезата [6]. Например IL-18, продуциран от Лангерхансови клетки, дендритни клетки и кератиноцити в епидермиса, може да повиши експресията на TRP{{2 }} (свързан с тирозиназа протеин 1) и TRP-2 (свързан с тирозиназа протеин 2) чрез активиране на пътищата p38/MAPK (митоген-активирана протеин киназа) и PKA (протеин киназа А), като по този начин се насърчава меланогенезата [7, 8] ]. TNF- регулира надолу производството на B16 меланин главно чрез активиране на NF-κB [9]. Доказано е, че PGe2 (простагландин е2), който се секретира от фибробласти и кератиноцити, стимулира диференциацията на дендритни клетки и инициира TYR активност в меланоцитите чрез cAMP (цикличен аденозин монофосфат) и Plc (фосфолипаза с) сигнални пътища [10]. PIH (постинфламаторна хиперпигментация) е вид реактивна меланизация на кожата [11]. Различни кожни заболявания, травми или козметични операции често водят допигментацияна засегнатата област, особено при цветнокожи [12]. Пациентите с PIH обикновено понасят огромен психологически стрес, който в тежки случаи се отразява негативно на качеството им на живот. Следователно някои лекарства, които регулират възпалението, се използват за лечение на PIH и други заболявания, които причиняват хиперпигментация. Например, ресвератролът, който намалява възпалителните увреждания в HaCaT клетките [13], е установено, че инхибира синтеза на меланин чрез извънклетъчно регулиране на сигнала на киназа 1/2 и сигнализиране на фосфоинозитид 3-киназа/Akt [14].

Избелванесредства, като хидрохинон (HQ) и витамин С, традиционно се използват за лечение на пигментация [15]. HQ е хидроксифенол с мощен инхибиращ ефект върху меланогенезата. Въпреки това, поради различни странични ефекти като дразнещ или алергичен контактен дерматит, обезцветяване на ноктите и нарушено зарастване на рани, употребата на HQ е ограничена [16, 17]. Витамин С инхибираTYRчрез взаимодействие с медните йони в активните места на TYR, като по този начин намалява меланогенезата. Въпреки това, витамин С е нестабилен в готовите продукти. В допълнение, ако концентрацията на витамин С е по-висока от 20 процента, това може да причини дразнене на кожата [18]. Следователно естествените съставки от широка гама от източници, които са безопасни, ефективни, много стабилни и лесни за съхранение, са в голямо търсене.

Наскоро се установи, че повече съставки на TCM са ефективни при инхибиране на кожатапигментация, като апигенин и паеонифлорин [19–21]. TCM с избелваща активност, описани в Ben-Cao-Gang-Mu, се използват широко като тайни рецепти в Китай и днес е потвърдено, че имат ефект на инхибиране на пигментацията. Например, екстрактът от Hedysarum multijugum Maxim (коренището на Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) причинява избелване на кожата чрез инхибиране на ERK пътя [22]. Сухият екстракт от Typhonii Rhizoma (коренището на Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano и Hett.) може ефективно да инхибиратирозиназаактивност in vitro [23]. И основаната на доказателства медицина също потвърди, че екстрактът от SapindiMukorossi Semen (плодът на Sapindus mukorossi Gaertn.), който инхибира активността на тирозиназата, има потенциал да се използва като лекарство и козметична добавка [24]. Някои традиционни народни рецепти, макар и не събрани в компендиум, също са широко използвани. San-Bai-Tang (SBT) е типичен пример. Йе и др. демонстрира, че SBT може да намали производството на меланин чрез инхибиране на сигналния път на p38/MAPK и активността на TYR [25]. Други TCM, описани в някои предписания, също са показали, че иматизбелване на кожатаефекти. Екстрактът от Coicis Semen (семето на Coix AquaticaRoxb.) инхибира производството на меланин чрез понижаване на MITF, TYR, TRP-1 и TRP-2 [26]. Освен това, един целопроб наTYRпоказват, че Ampelopsis japonica (коренището на Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) инхибира активността на гъбата TYR с повече от 50 процента [27]. Избелващите ТКМ, записани в тези древни рецепти, са доказали своята ефективност чрез модерни експериментални техники, но повечето от тях са проверени под формата на екстракти и активните съставки, които работят, не са ясни. Това събуди интереса ни към активните съставки на ТКМ със записани избелващи ефекти в древните предписания.

Освен това ТКМ или предписанията имат сложни съставки, различни начини на действие и неизвестни активни съставки. В допълнение, несъответствието на фактори като качеството на суровините, методите на обработка, техниките за приготвяне, съвместимостта на съставките, използвани в състава, и дозираните форми има по-голямо влияние върху ефикасността на TCM [19, 28]. Следователно, използването на някои TCM сизбелване на кожатаефектите са ограничени. Ето защо е спешно да се идентифицират активни съставки с потенциални избелващи ефекти върху кожата чрез систематичен скрининг, за да се гарантира безопасността, ефикасността и стабилността на тези съставки.

През последните години приложението на системната биология в областта на TCM отбеляза голям напредък. Мрежовата фармакология на ТКМ е нова интердисциплина, която съчетава фармакологията на ТКМ с мрежова наука, системна биология, изчислителна наука и биоинформатика [29]. Той напълно разбира сложността между лекарства, болести и биологични системи от гледна точка на мрежата „комплекс-протеин/ген-болест“ [30]. Мрежовата фармакология е ефективен и систематичен инструмент за изучаване на фармакологичното действие, механизма, безопасността и други аспекти на билковата медицина, особено TCMs, и предоставя ценни прозрения за текущото откриване на лекарства [31, 32].

съставки за избелване на кожата

2. Материали и методи

2.1. Мрежов фармакологичен процес

2.1.1. Изграждане на база данни за химически съставки

Блок-схема на изследваната експериментална програма е изобразена на Фигура 1. TCMs с антипигментационни ефекти, описани в Ben-Cao-Gang-Mu и в народни предписания, бяха използвани за мрежов фармакологичен анализ. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Sapindi MukorossiSemen, описани в Ben-Cao-Gang-Mu, саизбелванеи свойства за намаляване на жълтото и може да премахне петна по лицето и бенки. Poria cocos (Schw.) Wolf (склероциумът на Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba и Atractylodes macrocephala Koidz (коренището на Atractylodes macrocephalaKoidz.), които са съставки на SBT, са известни с това, че подобряват текстурата на кожата и намаляват хлоазмата ипигментация. Други традиционно записани билки, като Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (коренището на Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (коренището на Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. и Hook.f. ex Franch. и Sav.), Atractylodes lancea (Thunb.) Dc. (коренището на Atractylodes lancea (Thunb.)DC.), Fructus Ligustri Lucidi и Coicis Semen също бяха включени в това изследване. Поради големия брой TCM, включени в това проучване, многобройните скринингови бази данни за китайска медицина ще доведат до объркване при обработката на данни. Използваме само базата данни на Фармакологичните системи на традиционната китайска медицина (TCMSP), по-често използвана база данни, за последващ скрининг. Химическите съставки на тези ТКМ са търсени в TCMSP (актуализиран на 24,2020 април) [33]. Сходството с лекарството (DL) и оралната бионаличност (OB) са често използвани параметри за скрининг. Локалните или системните лекарства са често срещано лечение на кожни пигментни заболявания; следователно ние използвахме само DL като скрининг критерий. Бяха избрани отлични комплекси с DL > 0:18, за да се увеличи честотата на попадение на кандидатите за лекарства.

2.1.2. Пресечна точка между целевите гени на TCMs и гените, свързани с пигментацията.

Генният набор, свързан спигментациябеше избран въз основа на базата данни GeneCards (актуализирана на 24 април 2020 г.), от която бяха избрани цели с резултат за агенна болест > 1. В крайна сметка бяха идентифицирани 6180 цели, свързани с пигментацията. Пресечната точка между целевите гени на TCMs и гените, свързани с пигментацията, беше илюстрирана с помощта на диаграма на Venn [34].

2.1.3. Изграждане на мрежа активно съединение-мишена-път.

Активните съставки и регулираните целеви гени бяха скринирани според резултатите от диаграмата на Вен. Мрежата е конструирана с помощта на софтуера Cytoscape [35] и е използвана за обозначаване на връзката между активните съединения на TCM и целевите гени напигментацияВсеки целеви ген, регулиран от активна съставка в aTCM, се счита за една „градус“. Средните топологични параметри на "степен" на всеки TCM бяха използвани за оценка на важността на избраните TCM. Съединенията бяха класирани и петте най-добри TCM бяха избрани за ключови анализи. Освен това беше анализирана подробна информация за потенциалните активни съставки, за които се съобщава, че регулират пигментацията.

2.1.4. Енциклопедия на Киото за гени и геном (KEGG) Анализ на обогатяване на целеви гени, регулирани от потенциално ефективни TCM.

Целевите гени, регулирани от първите пет TCM, бяха избрани, за да се определят целевите пътища на KEGG и да се изследват възможните механизми на потенциално ефективни съставки в тези TCM срещупигментация.DAVID биоинформационните ресурси 6.8 бяха използвани за анализиране на обогатяването на целевите пътища на KEGG. Генните символи на потенциалните мишени на ефективните активни съставки бяха качени. След това получените генни идентификатори бяха изтеглени и въведени в KOBAS3. Беше избран генът, който коригира стойности на p под 0.05.

2.1.5. Молекулярна докинг симулация.

2D структурите на ситоглузид, арбутин, никотинамид, HQ, коджикова киселина и аскорбинова киселина са получени от базата данни PubChem. Механичните структури на малките молекули бяха оптимизирани с помощта на ChemBio3D Ultra 14.0. 3D кристалната структура на гъбатаTYR(PDB ID: 2Y9X, координати за докинг: X =−8:87, Y=−30:74 и Z=−41:52) е получен от Protein Data Bank ( PDB) база данни [36]. Триизмерните кристални структури на шест мембранни рецептора (опиоиден u рецептор, PDB ID: 4DKI; меланокортин 1 рецептор, PDB ID: 2L1J; ендотелин В рецептор, PDB ID: 5GLI; адренергичен рецептор, PDB ID: 4GBR; простагландинов рецептор, PDB ID: 6D26 ; рецептор на фактор на стволови клетки, PDB ID: 2EC8) са получени от базата данни на PDB. Протеиновите структури бяха подготвени с помощта на AutoDock Tools чрез премахване на водни молекули, добавяне на водороди и създаване на връзки от нулев порядък към метали и дисулфидни връзки. И накрая, симулациите на молекулярно докинг бяха извършени с помощта на AutoDock Vina 1.1.2 [37] и резултатите бяха анализирани с помощта на PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Експериментално валидиране

2.2.1. Химикали и антитела.

Ситоглузид (чистота по-голяма или равна на 98 процента) е закупен от ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Диметилсулфоксид (DMSO) е закупен от Sigma-Aldrich. Неутрален параформалдехид (4 процента) е закупен от Biosharp (Хефей, Китай). Kojic киселина, Fontana-Masson Stain Kit, натриев деоксихолат и L DOPA бяха закупени от Solarbio (Пекин, Китай). Модифицираната среда на Eagle на Dulbecco (DMEM) е закупена от Gibco (#C11995500BT, Gibco). Фетален говежди серум (FBS) и комплект за броене на клетки -8 (CCK8) бяха закупени от BI (Kibbutz Beit-Haemek, Израел). PMA (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат, ERK/MAPK активаторът) беше закупен от APExBIO (#N2060, APExBIO). Анизомицин (р38/МАРК активаторът) е закупен от MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Първични антитела срещу ras-свързан протеин Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), извънклетъчна сигнал-регулирана киназа (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-терминална киназа JNK(#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), cAMP отговор елемент-свързващ протеинCREB ( #9107, CST) и p-CREB (#9198, CST) са закупени от Cell Signaling Technology. Първични антитела срещу TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058,Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory),TYR(BS1484, Bioworld) и GAPDH (#AP0066, Bioworld) бяха закупени съответно от Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory и Bioworld.

2.2.2. Клетъчна култура и лечение.

MNT1 и B16F0, които са богати на меланозоми, се използват широко за изследване на меланогенезата [38]. Следователно, тези две клетъчни линии бяха избрани за последващи експерименти. MNT1 и B16F0 клетки бяха култивирани в 20 процента или 10 процента фетален говежди серум (BiologicalIndustries, Израел) и 1 процент пеницилин-стрептомицин (Gibco) в DMEM. Всички клетки бяха култивирани в мокър инкубатор при 37 градуса и 5 процента CO2. Ситоглузидът беше разтворен в DMSO и крайната концентрация на DMSO беше<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Култивиране и лечение на зебра.

Ембрионите и хранителната среда на зебра са закупени от EzeRinka Biotech (Nanjing, Китай). Експерименталният протокол беше одобрен от Комитета по етика на трета болница Xiangya на Централния южен университет (№ 2021-S137). На първия ден след излюпването, рибките зебра бяха отгледани в 12-плака с ямки (10 perwell), защитени от светлина и култивирани при 37 градуса. Рибките зебра бяха третирани с различни концентрации на ситоглузид и бяха направени снимки с помощта на обърнат микроскоп на интервали от 24 часа, за да се запишат промените в меланина в опашките на рибките зебра. След като бяха направени снимките, разтворите на ситоглузид с различни концентрации бяха разчетени и записани непрекъснато в продължение на една седмица.

2.2.4. Клетъчна жизнеспособност.

Жизнеспособността на клетките беше оценена с помощта на CCK8.MNT1 и B16F0 клетки бяха поставени в 96-плаки с ямки при плътност от 2000 клетки/ямка или 500 клетки/ямка. Клетките бяха третирани с различни концентрации на ситоглузид (25, 50, 100, 200, 400, 600 и 800 μM). След 24 h или 48 h, към всяка ямка се добавят 10 μL от CCK8 реагент и клетките се инкубират при 37 градуса за 1 h. Когато цветът на средата стане оранжев, културата се прекратява и се използва четец на микроплаки (PerkinElmer EnVision Xcite, UK) за измерване на абсорбцията при 490 nm.

2.2.5. Оцветяване с меланин по Фонтана-Масон.

Клетките се култивират в 6-плака с ямки и се третират с различни концентрации на ситоглузид в продължение на 2 дни и коджикова киселина като положителна контрола се добавя при 200 μM. След това клетките се поставят в 4 процента параформалдехид за 15 минути. След изплакване с вода, клетките се инкубират с разтвор на амоняк-сребро на Fontana за 24 часа в тъмна камера, изплакват се с вода и след това се поставят в хипосулфит за още 5 минути. Използван е обърнат микроскоп за наблюдение на меланина.

2.2.6. Експеримент за възстановяване на функцията.

PMA, като признат активатор на ERK/MAPK [39, 40], беше тестван за цитотоксичност чрез CCK8 експеримент при различни концентрации (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 и 800 ng/mL) за 24 часа. И след като клетките MNT1 и B16F0 бяха третирани с различни концентрации (25, 50 и 100 ng/mL) PMA за 2 часа, нивото на фосфорилиране на ERK беше открито чрез Westernblotting експеримент. При избраната концентрация, клетките бяха третирани с 0, 1, 2, 4, 6 и 8 часа, за да се открие ефективното време на активиране. След като клетките бяха третирани със ситоглузид (200 μM) и PMA (25 ng/mL) в продължение на 48 часа (повторно третиране на всеки 8 часа), протеиновите нива наTYRи p-ERK бяха открити. Оцветяването с меланин по Fontana-Masson открива съдържанието на меланин. Анизомицин [41] е активаторът на p38/MAPK, чиято изследователска концентрация е 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 nM, а другите експериментални методи са същите като PMA.

2.2.7. Измервания на активността на TYR.

Клетките бяха третирани с различни концентрации на ситоглузид в продължение на 2 дни. След смилане и центрофугиране, клетките се преброяват и ресуспендират два пъти във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). След това към всяка проба се добавят 500 μL 0,5 процента разтвор на натриев деоксихолат. Пробите се инкубират при 4 градуса за 10 минути и след това при 37 градуса за 15 минути. Добавя се 1 mL от 1 процентен разтвор на L-DOPA, след което 200 μL незабавно се пипетират в 96-плака с ямки. Впоследствие се използва многомодов четец на платки за измерване на стойностите на абсорбция (А0) при 475 nm и измерването се повтаря след 30 минути (А30).TYRактивността се изчислява като (A{{0}}A0)/брой клетка.

2.2.8. Сонда за активност на TYR.

Близка инфрачервена флуоресцентна сонда заTYRактивност, базирана на резоруфин, се използва за визуализиране на активността в живи клетки, както е описано по-рано [42]. Накратко, клетките MNT1 и B16F0 се култивират в 6-плочка с ямки и се третират с различни концентрации на ситоглузид в продължение на 2 дни . Добавя се 10 цМ флуоресцентна проба и след 4 часа клетките се заменят с PBS. След като червената светлина беше вълнуваща, незабавно беше използван флуоресцентен обърнат микроскоп за правене на снимки.

2.2.9. Екстракция на протеин и Western blotting.

След като клетките бяха третирани с различни концентрации на ситоглузид в продължение на 2 дни, общият клетъчен протеин беше екстрахиран с помощта на RIPA лизисен буфер (Thermo Fisher) и коктейли от протеазен инхибитор и фосфатазен инхибитор (Roche). Концентрацията на протеин се определя с помощта на BCA протеинов тестов комплект (KeyGEN Biotec). След блокиране с 1 процент BSA, първичните антитела срещуTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 и p-p38 бяха инкубирани с мембраните за една нощ при 4 градуса при 1: 1000 и GAPDH при 1: 3000 Мембраните се промиват с TBS-T и се инкубират с козе анти-заешко вторично антитяло при 1:3000 за 1 час. Свързващото антитяло се открива чрез електрохемилуминесценция (ECL).

2.2.10. Статистически анализ.

Софтуерът SPSS22.0 беше използван за статистически анализ, а t-тестът на Student или еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) беше използван за множество групови сравнения. U тестът на Ман-Уитни беше използван за непараметрични данни. p < 0:05="" във="" всички="" случаи="" се="" счита="" за="" статистически="" значимо.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" и="" ∗p=""><>

3. Резултати

3.1. Композитни съставки на TCM.

Изследвани са четиринадесет TCMs, записани в Ben-Cao-Gang-Mu и в народни рецепти, с антипигментационни ефекти. Общо 372 съставки на китайската медицина от 14-те TCM бяха извлечени от базата данни на TCMSP (допълнителна таблица S1).

3.2. Целеви гени, регулирани от TCM и свързани пигментационни гени.

Според целевата система за прогнозиране в базата данни на TCMSP са получени общо 834 целеви гена от 14-те TCM. Общо 9431 гена, свързани спигментациябяха извлечени от базата данни GeneCards, от които бяха избрани 6180 и имаха резултат за релевантност > 1.

3.3. Класиране на 14 TCMs и Disease-Compound-TargetNetwork.

Използвайки софтуера Cytoscape, ние взехме пресечната точка на регулаторните гени на всеки TCM и свързаните с пигментацията гени и получихме потенциалните активни съставки и общите целеви гени. След това, целевата мрежа на съединението на заболяването между TCM ипигментацияе построена. Въз основа на това, ние получихме средната "степен" на всяка активна съставка и класирахме TCM според техните резултати. Според резултатите от ранга, първите 5 билки са Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba (Фигура 2(a)). Чрез KEGG анализ на 220 целеви гена от топ 5 TCM, 19,3 процента от гените са богати на сигналния път PI3K-Akt, 13,6 процента от гените са свързани с TNF сигналния път и около 12,3 процента от гените са свързани с IL{{ 12}}. В допълнение, 37 гена бяха включени в MAPK пътя и 28 гена бяха включени в HIF-1 пътя. Тези пътища са тясно свързани с регулирането на метаболизма на меланина и фотостареенето на кожата. Сред първите 20 обогатени сигнални пътища, пътищата, свързани с възпалението, представляват една четвърт от тях (Фигура 2 (c)). Фигури 2(d)–2(h) изобразяват мрежата от съединение-мишена на заболяването между Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba и съответно пигментацията. Според диаграмата на Venn на съставките в петте най-добри TCM открихме, че четири TCM съдържат ситоглузид и бета-ситостерол (Фигура 2 (b), допълнителна таблица S2).

3.4. Потенциални активни съставки за инхибиране на пигментацията.

Според целевата мрежа за болестно съединение, 148 съставки, свързани спигментацияса получени от 14TCMs. Чрез търсене в литературата се съобщава, че 25 от 148 съставки инхибират меланогенезата. Четири активни съставки са докладвани като растителни екстракти, които инхибират меланогенезата. Изследвани са четиринадесет активни съставки и се съобщава, че техните производни регулират пигментацията. Интересно е, че четири съставки са показали, че насърчават меланогенезата, докато механизмът на шест съставки за регулиране на меланогенезата все още е неясен. Останалите 95 потенциални китайски лекарствени съставки все още не са проучени за регулиране на пигментацията. Подробна информация за тези съставки е предоставена в допълнителна таблица S3.

3.5. In vitro и in vivo ефекти на ситоглузид върху меланогенезата.

След горния процес на скрининг установихме, че четири TCM в най-горните TCM съдържат ситоглузид и -ситостерол. Съобщава се, че -ситостеролът инхибира алфа-меланоцит-стимулиращия хормон (-MSH), стимулиращ меланогенезата чрез р38 сигналния път в B16F10 меланомни клетки [43]. Въпреки това не са докладвани антипигментационните ефекти на ситоглузид и неговият специфичен механизъм. Затова избрахме ситоглузид като кандидат за лекарство за тези проучвания. Анализът CCK8 беше извършен, за да се изследват потенциалните токсични концентрации на ситоглузид в MNT1 и B16F0 клетки. Резултатите показват, че sitogluside няма очевиден ефект върху пролиферацията на клетките (Фигури 3(a) и 3(b)) при концентрации под 400 μM. Оцветяването с меланин, проведено с използване на 25, 50, 100 и 200 μM sitogluside, показва, че sitogluside може да намали съдържание на меланин в MNT1 и B16F0 клетки по дозозависим начин (Фигура 3(c)). Освен това лечението със ситоглузид значително инхибира кожатапигментацияпри рибки зебра по начин, зависим от времето и дозата (Фигура 3(d)). Тези резултати предполагат, че ситоглузидът инхибира меланогенезата in vitro и in vivo.

3.6. Ефекти на Sitogluside върху експресията на TYR.

От предишните резултати, sitogluside може ефективно да намали съдържанието на меланин, но как той регулира този процес все още е неизвестен и следователно представлява интерес. Беше извършен Western blotting за откриване на експресията на гени, свързани с меланогенезата (TYR,MITF, TRP1, TRP2 и RAB27A) на протеиново ниво. Резултатите от анализите показват, че експресията на TYR е значително понижена, а MITF и TRP1 експресиите са умерено понижени след лечение със ситоглузид (Фигура 4(а)). Тъй като MAPK и PKA са ключовите сигнални пътища нагоре, регулиращи TYR, ние проучихме допълнително промените в ключовите протеини в тези два пътя. След като MNT1 и B16F0 клетките бяха третирани със ситоглузид в продължение на 2 дни, нивата на фосфорилиране на ERK и P38 бяха значително понижени , докато няма значителни промени в общите нива на CREB, ERK, JNK и p38 протеини или нивата на фосфорилиране на JNK и CREB (Фигура 4 (b), Фигура S1A). Според резултатите от експеримента CCK8 открихме, че PMA под 100 ng/mL не е токсичен и за двете клетки (Фигура S1B), а 25 ng/mL PMA може очевидно да повиши нивото на фосфорилиране на ERK. Нивото на фосфорилиране на ERK постепенно намалява след 4 часа (Фигура S1C-D). Чрез оцветяването с меланин по Fontana-Masson открихме, че PMA може значително да повиши съдържанието на меланин в клетките MNT1 и B16F0. Резултатите от Westernblotting също предполагат, че PMA може да повиши нивото на фосфорилиране на ERK, а sitogluside може да намали нивото на фосфорилиране на ERK, регулирано нагоре от PMA. Чрез инхибиране на нивото на фосфорилиране на ERK и намаляване на протеиновото ниво наTYR, ситоглузидът намалява съдържанието на меланин, увеличено от PMA (Фигури 4(c) и 4(e), Фигура S2A). В същото време открихме, че анизомицинът има подобни резултати. Анизомицин под 8 nM не е токсичен и за двете клетки, а 2 nM анизомицин може значително да повиши нивото на фосфорилиране на р38. На 8 часа нивото на фосфорилиране на p38 е все още високо (Фигура S1B, Фигура S1E-F). Резултатите от меланооцветяването по Fontana-Masson и Western blotting също предполагат, че ситоглузидът може да инхибира нивото на фосфорилиране на р38, регулирано нагоре от анизомицин, намалявайки съдържанието на TYR протеин и инхибирайкипигментация(Фигури 4(d) и 4(f), Фигура S2B). Следователно ситоглузидът може да намали експресията на TYR чрез инхибиране на пътищата ERK/MAPK и p38/MAPK. Въпреки това, механизмът, чрез който ситоглузидът инхибира тези сигнални пътища, остава неясен. Ние проследихме мембранните рецептори нагоре по веригата на тези сигнални пътища и използвахме молекулярно докинг, за да изследваме механизма на регулиране на пътищата надолу по веригата. Свързващите енергии между sitogluside и шестте мембранни рецептори, а именно опиоид u, меланокортин 1, фактор на стволови клетки, ендотелинB, адренергични и простагландинови рецептори бяха -7.8,-5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 и 0 кал/мол, съответно. Чрез молекулярен докинг открихме, че сред шестте мембранни рецептора ситоглузидът има много висок афинитет към опиоида u, меланокортин 1 и рецепторите на фактора на растеж на стволови клетки (Фигура 4(g)). Спекулираме, че ситоглузидът може да инхибира ERK/MAPK и p38/MAPK пътищата чрез свързване към гореспоменатите мембранни рецептори, като по този начин намалява експресията на TYR.

3.7. Ефект на Sitogluside върху активността на TYR.

ОтTYRе ключовият ензим в синтеза на меланин, той е най-важната цел за инхибиране на меланогенезата. Повечето налични в търговската мрежа козметика или средства за изсветляване на кожата, като HQ, арбутин и коджикова киселина, са инхибитори на TYR. Използвахме ситоглузид и някои клинично използваниизбелване на кожатаагенти (арбутин, никотинамид, коджикова киселина, HQ и аскорбинова киселина) за провеждане на молекулярно свързване с TYR. Подробните взаимодействия между sitogluside и гореспоменатите агенти сTYRса показани на фигура 5(a). Енергиите на свързване на тези шест съединения бяха -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4 и {{ 11}}.4 kcal/mol, съответно. Обикновено се смята, че когато енергията на афинитета е -4, това показва сила на свързване, а когато е по-голяма или равна на -7.0, това показва силна сила на свързване. Страната на Ситоглу се класира на второ място по афинитет, малко по-слаба от арбутина, проявявайки относително изключителна способност за комбиниране.

В същото време беше използван експеримент за преобразуване на L-DOPA за откриване на активността на TYR, като се използва коджикова киселина като положителна контрола. Резултатите показват, че ситоглузид инхибира активността на TYR в MNT1 и B16F0 клетки по начин, зависим от концентрацията, и групата с висока концентрация (200 μM) показва еквивалентен инхибиторен ефект на този, показан от 200 μM kojic киселина (Фигури 5(b) и 5(c)). В допълнение, резултатите от експеримента с TYR сонда показват, че с увеличаването на концентрацията на ситоглузид интензитетът на флуоресценция постепенно намалява в клетките и интензитетът на флуоресценция на групата с висока концентрация е близък до този на 200 μM коджикова киселина в MNT1 и B16F0 клетки (Фигура 5 (d), Фигура S2C). Тези резултати показват, че ситоглузидът може ефективно да инхибираTYRактивност в MNT1 и B16F0 клетки. Освен това, ние спекулираме, че ситоглузидът, като естествено стеролно съединение, може директно да проникне през клетъчната мембрана и да се свърже с TYR и да инхибира неговата активност, като по този начин инхибира меланогенезата.

4. Обсъждане

В това проучване използвахме мрежова фармакология, за да изследваме потенциалните механизмиизбелване на кожатасъставки, открити в 14 TCMs, документирани в Ben-Cao-Gang-Mu и народни предписания, за инхибиранепигментация. Проучването също така предлага иновативен метод, който използва средния топологичен параметър "градус" на всяка активна съставка, за да оцени потенциалната ефективност на билките. Съгласно средната "степен" бяха избрани Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba и чрез анализа на обогатяване на KEGG на гените, регулирани от тези пет TCM, беше неочаквано, че 25 процента от обогатените сигналните пътища са свързани с възпаление, включително IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt и MAPK сигнални пътища.

Наскоро беше показано, че различни възпалителни медиатори активират или инхибират свързаните с меланогенезата сигнални пътища, които насърчават или инхибират кожатапигментация[6]. Инкултивирани B16F10 меланомни клетки, TNF- намаляват експресията наTYRи TRP1 и TYR активност по дозозависим начин [44]. IL-17 и TNF- могат да намалят експресията на гени, свързани с меланогенезата в меланоцитите, а IL-17 може значително да подобри инхибиторния ефект на TNF- върху меланогенезата. След лечение с етанерцепт (анти-TNF), свързаните с меланогенезата гени са значително повишени в кожните лезии на пациенти с псориазис [45]. Съобщава се, че HIF-1, мощен транскрипционен фактор, регулиращ възпалителния отговор, участва в регулирането на фактори като IL-17 и TNF- [46–48]. Поради това е вероятно HIF{16}} да участва в регулирането на меланогенезата чрез повлияване на възпалението. Други цитокини като IL-18, IL-33, GM-CSF и IL-1 може да стимулира меланогенезата чрез активиране на PKA, MAPK или други сигнални пътища, докато IFN-, IL-1, IL-4 и IL-6 намаляват меланогенезата чрез инхибиране на STAT1, NF-κB, и JAK2-STAT6 сигнални пътища [6]. Нашите констатации предполагат, че първите пет TCM (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и Paeoniae Radix Alba) могат да упражнят антипигментационен ефект главно чрез противовъзпалителни пътища. Предишна литература също спомена, че тези пет най-добри TCM имат мощни противовъзпалителни и антистареещи ефекти [49, 50]. Това също подкрепя нашето предположение, че TCM могат да играят незначителна роля в поствъзпалителната пигментация.

Докато преглеждахме литературата за 148 съставки, открити в 14 TCM, открихме също, че сред 35 от докладваните съставки, почти 70 процента от тях са потвърдени, че или намаляват съдържанието на меланин, или инхибират активността на TYR. Това не само потвърждава, че записите на предписания за избелване на кожата в древни книги са до голяма степен надеждни, но също така показва, че позоваването на древна литература е надежден метод за получаване на знания за TCM. Все още има 95 съединения, които остават неизследвани и имат потенциал да устоятпигментация. Чрез анализ на диаграмите на Venn на първите пет TCM бяха получени 13 често срещани съставки. Сред тях, in vitro експерименти потвърдиха, че даидзеин, рутин и (плюс) -катехин могат да намалят съдържанието на меланин [51-53]. Захарозата нарушава правилното узряване на меланозомите чрез индуциране на осмотичен стрес и инхибиране на PI3 киназния път, като по този начин пречи на меланогенезата [54]. Кверцетинът намалява индуцираната от оксидативен стрес меланогенеза [55]. В допълнение, химични и физични методи като спектроскопски и структурно-активни анализи потвърждават, че лупео и кемпферол могат да инхибиратTYRи намаляват меланогенезата [56, 57]. Това показва, че мрежовата фармакология може би е възможен метод за разкриванеизбелванесъставки. Четири TCM в първите пет TCM съдържат ситоглузид и няма доклади дали ситоглузидът регулира пигментацията или свързания с нея механизъм. Затова избрахме ситоглузид за тези проучвания.

Съобщава се, че ситоглузид, стеролов гликозид, който е широко присъстващ в растенията, проявява антитуморни, антиоксидантни и невропротективни ефекти [58–60]. В това проучване открихме, че ситоглузид ефективно намалява съдържанието на меланин in vitro и in vivo. Последвалите експерименти доказаха, че може значително да намали експресията на TYR. Kojic киселина се използва като положителна контрола и може също така да инхибира нивата на протеини на гени, свързани с меланогенезата, като TYR, MITF и TYRP1 при -MSH стимулация, което беше докладвано от Jeon et al. [61]. Като се има предвид липсата на екзогенна стимулация, 200 μM коджикова киселина има само умерен инхибиторен ефект върху генната експресия в нашето изследване, но тъй като коджиковата киселина има голяма инхибиторна активност на тирозиназата, ние все още я използваме като положителна контрола в това изследване. Съобщава се, че експресията на TYR е пряко или косвено регулирана съответно от MAPK или PKA пътищата. Потвърдено е, че все по-голям брой съставки имат избелващ ефект върху кожата чрез инхибиране на MAPK сигналния път. Например, fargesin намалява експресията наTYRчрез инхибиране на пътя P38/MAPK [62]. Полизахаридите на Ganoderma lucidum могат да устоят на индуцираната от UVB лъчи меланогенеза чрез понижаване на MAPK пътя [63]. Нашето проучване установи, че ситоглузид, в концентрация от 200 μM, има потенциала да намали експресията на TYR чрез инхибиране на ERK/-MAPK и P38/MAPK сигналните пътища. Това се съобщава чрез молекулярно свързване между мембранните рецептори нагоре по веригата на MAPK пътищата [64] и ситоглузид. Ние открихме, че ситоглузидът се свързва силно с опиоида u, меланокортин 1 и рецепторите на растежния фактор на стволовите клетки. Следователно, ние спекулираме, че ситоглузидът може да взаимодейства с тези мембранни рецептори, да инхибира ERK/MAPK и P38/MAPK сигналните пътища и да намали експресията на TYR.

Тъй като TYR е ключовият ензим в синтеза на меланинови частици в меланоцитите, инхибирането на активността на каталитичното място на TYR е от съществено значение за намаляване на кожатапигментация[65]. Много агенти за изсветляване на кожата на пазара са инхибитори на TYRactivity, като HQ, арбутин и коджикова киселина. В това проучване използвахме молекулярно докинг, за да изследваме свързващите ефекти на ситоглузид и пет често срещаниизбелване на кожатаактивни съставки (арбутин, никотинамид, коджикова киселина, HQ и аскорбинова киселина) [66] сTYR. Резултатите показват, че ситоглузидът има силен афинитет на свързване с TYR, по-слаб от арбутин, но по-силен от коджикова киселина, никотинамид, HQ и аскорбинова киселина. Арбутинът е пролекарство на HQ и естествен продукт, който може да намали или инхибира синтеза на меланин чрез инхибиране на TYR. Въпреки това, естествената форма на арбутин е химически нестабилна и може да се превърне в HQ, който се катализира и метаболизира в бензенови метаболити с потенциална токсичност за костния мозък [67]. Употребата на коджикова киселина в козметиката е ограничена поради нейната канцерогенност и нестабилност по време на съхранение [68]. Следователно ситоглузидът, естествено стеролово съединение, получено от различни растения, се очаква да действа като мощен агент за изсветляване на кожата. Въпреки това, разтворимостта на ситоглузид в DMSO е ниска, което също е недостатък на тази естествена съставка. Последващата експериментална проверка разкри, че ситоглузидът е безопасен в клетъчните линии MNT1 и B16F0 и групата с ниска концентрация има добър инхибиторен ефект върху активността на TYR, докато групата с висока концентрация има същия ефект като същата концентрация на коджикова киселина. Следователно, sitogluside може да се използва терапевтично като регулатор за избелване на кожата, който не само намалява експресията на TYR, но също така инхибира неговата активност (Фигура 6).

5. Изводи

Мрежовата фармакология може би е ефективен инструмент за откриването на естествени активни съставки за намаляване на пигментацията на кожата и техните възможни механизми. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones и PaeoniaeRadix Alba имат потенциализбелване на кожатасвойства и може да инхибирапигментациячрез регулиране на възпалението. Sitogluside е романизбелване на кожатаактивна съставка с двоен регулаторен ефект, т.е. инхибиранеTYRизразяване и дейност.

цистанче таблетки