Дефицитът на митохондриален транскрипционен фактор А, насочен към бъбречния епител, води до прогресивно изчерпване на митохондриите, свързано с тежко кистозно заболяване
Mar 23, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Кен Ишии, Ханако Кобаяши, Кенсей Тагучи и др.
ВЪВЕДЕНИЕ
Митохондриалната (mt) дисфункция е добре разпозната патологична характеристика на често срещаните бъбречни заболявания и може да предизвика клетъчно увреждане, възпаление и фиброза. В бъбреците тубулните епителни клетки са силно зависими от аденозин трифосфат (ATP), генериран от окислително фосфорилиране (OXPHOS), тъй като те изпълняват множество енергоемки епителни транспортни функции. Следователно, поддържането на ефективно производство на mt ATP е от съществено значение за нормалната бъбречна функция и системната електролитна хомеостаза. В допълнение, скорошни доказателства показват, че митохондриите имат основна роля в генната регулация, клетъчното сигнализиране и клетъчната диференциация чрез генериране на междинни метаболити и реактивни кислородни видове (ROS).2 Въпреки този напредък, ролята на mt сигнализирането в патогенезата на често срещаните бъбречни заболявания не е добре разбран.
За да изследваме функцията на mt в бъбречната хомеостаза и патогенеза, ниенасочен митохондриален транскрипционен фактор А(TFAM). TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)е ядрено-кодиран фактор, важен за функцията на mt, поддържането на броя на копията на mt и структурната стабилност на mt ДНК, тъй като регулира репликацията и транскрипцията на mt генома чрез огъване на промоторна ДНК. протеинови субединици на комплекса на дихателната верига, 22 кодиращи трансферни РНК и 2 рибозомни РНК. По този начин,TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)участва пряко в регулирането на mt електронния транспорт и синтеза на АТФ чрез транскрипцията на гени като митохондриално кодиран цитохром b (MT-CYB), митохондриално кодирана субединица 1 на цитохром с оксидаза (MT-CO1) и митохондриално кодирана мембранна субединица на АТФ синтаза 6 (MT-ATP6).3 БезTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А), клетките губят способността си да произвеждат АТФ чрез OXPHOS, не могат да генерират значителни количества mt ROS и стават прогресивно изчерпани от митохондрии. - Генетичните изследвания показват, чеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)е от съществено значение за нормалната ембриогенеза, тъй като глобалната хомозиготнаTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)инактивирането е довело до вътрематочна смъртност до ембрионален ден 10,5, докато хетерозиготният дефицит, въпреки че намалява броя на mt копията с -40 процента и води до дефицит на дихателната верига, не води до ембрионална смъртност. По този начин генетичното насочване наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А) е полезна експериментална стратегия за изследване на ролята на прогресивната mt дисфункция в клетъчната диференциация и тъканната хомеостаза. Специфично за клетъчния тип условно инактивиране наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)предполагат, че генерирането на OXPHOS и/или mt ROS е критично за клетъчната диференциация, функция и нормална физиология.-1o
Първичните mt нарушения, дължащи се на ядрени или mt генни мутации, могат да се проявят с бъбречно заболяване, което най-често се проявява като тубулоинтерстициално увреждане или изолирана тубулна дисфункция.1,12 Въпреки че са замесени в патогенезата на някои човешки заболявания като невродегенеративни разстройства, специфичните мутации в TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)не са докладвани причиняващи бъбречно заболяване. Съвсем наскоро намаленоTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)изразяването е свързано с хронично бъбречно заболяване. Загуба на целостта на мт порадиTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)инактивирането причинява тубулоинтерстициално заболяване и бъбречна недостатъчност при мишки, което отчасти се дължи на активиране на mt ДНК стрес-индуцирана циклична GMP-AMP синтаза (cGAS)-стимулатор на интерферонови гени (STING)-зависими възпалителни отговори.
Тук съобщаваме, че мишките с условноTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А) инактивиране в свързаните със sine oculis хомеобокс 2(SIX2)-експресиращи нефронни прогениторни клетки развиват тежко кистозно заболяване и умират преждевременно от бъбречна недостатъчност като млади млади мишки.TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- мишките се характеризират с дефекти в узряването на нефрона, което е свързано с изчерпване на mt, намаляване на OXPHOS и метаболитно изместване към гликолиза вTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7-бъбречен епител. Предвид тежестта на кистозната болест приTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7-мишки, ние анализирахме 2 миши модела на поликистозна бъбречна болест (PKD), които са резултат от мутации в полицистин-1 (Pkd1) или цистин-1 (Cys1), както и човешки тъкани от пациенти с автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване (ADPKD). Това установявамеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)е нерегулиран в кисти както от миши, така и от човешки PKD тъкани. Взети заедно, нашите проучвания показват, че TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)дисрегулацията и изчерпването на mt са характерни черти на бъбречните кистозни заболявания и могат да имат допринасяща роля в тяхната патогенеза.
РЕЗУЛТАТИ
TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)инактивирането в клетки от SIX2 линия причинява тежко кистозно заболяване, водещо до бъбречна недостатъчност
За да изследваме функцията на mt в бъбречния епител, ние инактивирахмеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)в ШЕСТ2-експресиращи прогениторни клетки, които пораждат всички сегменти на нефрона, с изключение на събирателния канал (CD).15 За целта пресякохмеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)floxed алел с бактериални изкуствени хромозомни трансгенни мишки, които експресират подобрен зелен флуоресцентен протеин/Cre рекомбиназен слят протеин (eGFP/Cre) под транскрипционен контрол на Six2 промотора (Фигура la). "Мишки, хомозиготни заTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)floxed алел и хетерозиготни за eGFP/Cre транс-гена (Six2-eGFP/Cre plus ; T fam) от тук нататък се наричат Six2-Tfam-/- мутанти. Шест2-Tfam-/- мишки са родени при очакваните менделски съотношения и не са различими от контролите Cre-littermate чрез визуална проверка при раждането. Въпреки това, разликите в телесното тегло между Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А){{0}}мутанти и контроли на роднини от котило станаха очевидни на следродилния ден(P)14(5,7±0.3g за мутанти срещу 7,5±0,3g за контроли,n{{11} } всеки, P=0.004; Допълнителна таблица S1). Шест2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А) мутантните мишки се характеризират с увеличени бъбреци в сравнение с контролите (съотношение бъбрек/телесно тегло от 1,45 процента ± 0.19 процента за мутанти срещу.0.60 процента ±0,02 процента за контролата , n=4 всеки, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7- мутанти развиват значителна албуминурия (съотношение албумин/креатинин в урината=362.4 ± 75,18 mg/g при шест2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)--мутанти спрямо 43,58±3,39 mg/g в контролите съответно при P14, n=6 и 10; P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-'мутанти, мишки с хетерозиготниTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)дефицит в SIX2 прогениторни клетки, развити нормално, са били фертилни и не са развили явно бъбречно заболяване (допълнителна фигура S1).
Фигура 1|Инактивирането на Tfam в клетки от SIX2 линия води до тежко кистозно заболяване и бъбречна недостатъчност.( а ) Схема, илюстрираща експерименталния подход и местоположението на целевите последователности в рамките на Tfam floxed алел. Анализ на полимеразна верижна реакция на тотална геномна бъбречна ДНК, изолирана от контролни котила (Cre ) и шест{{0}}Tfammice на възраст постнатален ден (P) 7; нерекомбиниращият Tfam floxed алел се обозначава с 2-lox (2); рекомбинираният алел от 1-lox, дивият тип алел от wt; þ или - показват наличието или отсъствието на трансгена Six2-eGFP/Cre. (b) Леви панели, снимки на бъбреци от Cre контрола и Six2-Tfam мишки на възраст P20. Теглото на бъбреците (KW) се изразява като процент от телесното тегло (BW) (n=4–14). Десни панели, нива на уреен азот в кръвта (BUN) в Cre контрола на котило (co) и Six2-Tfam мишки на възраст P7 (n=7 и 6, съответно) и криви на оцеляване на Kaplan-Meier за Cre контрола и Six{ {16}}Tfam мишки в сравнение с log-rank тест (n=10–13). (c) Представителни изображения на фиксирани във формалин, вградени в парафин бъбречни срезове от Cre контрола и Six2-Tfam мишки на възраст P7 и P29, оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) и анализирани чрез имунохистохимия за a-гладкомускулен актин (ACTA2) и антиген на клъстерна диференциация (CD) 31. Цифровите знаци изобразяват кистозни структури, а звездичките изобразяват гломерули. Стълбчета ¼ 1 mm за напречни сечения на цял бъбрек, 100 mm за H&E изображения с висока мощност и 50 mm за IHC изображения. Данните са изразени като средна SEM и са анализирани чрез 2-опашния t-тест на Student. ***P <0,001. за="" да="" оптимизирате="" гледането="" на="" това="" изображение,="" моля,="" вижте="" онлайн="" версията="" на="" тази="" статия="" на="">www.kidney-international.org.
cistanche мъжки ползи
Анализът на Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/-мишки, които също експресират ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre репортерен алел, тук означен като Six2-mT/mG;TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7 мишки, което показва, че по-голямата част от кистозните структури вTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/-бъбреци (допълнителна фигура S3). Тези констатации са в съответствие с повишените нива на фосфорилирана извънклетъчна сигнално-регулирана киназа (p-ERK) и -катенин в Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- бъбречна тъкан (допълнителна фигура S3). Взети заедно, нашите данни показват, че шест2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/ бъбреците показват молекулярни характеристики, които често се свързват с бъбречни кистозни заболявания.
Съзряването на нефрона е дефектно в Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/мишки Тъй като може да отнеме до няколко седмици преди мишки с тъканно-специфичниTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)инактивиране, развиване на патология, след това проучихме времевия ход на развитие на бъбречно заболяване при Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А){{0}}мишки. Събрахме бъбреци от контролни и мутантни мишки на възраст P0, P7 и P14 и използвахме хистологични методи, имунофлуоресцентно (IF) оцветяване и анализ на генната експресия в екстракти от цели бъбреци за оценка. IF оцветяването за SIX2 и E-cadherin на възраст P0 показва, че бъбреците от контролата и Sic2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/-са хистологично подобни. Образуването на структури на кортикална нефрогенна зона, като мезенхим SIX2 плюс cap, уретерни върхове, експресиращи Е-кадхерин, и зараждащи се нефронни структури, като бъбречни везикули и тела с форма на запетая и S, не е блокирано в Six{{7} }TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7- бъбреци (Фигура 2а). Тези хистологични находки са в съответствие с нивата на експресия на гени, кодиращи нефрогенни маркери. Шест2, сдвоена кутия 2 (Pax2), LIM хомеобокс протеин 1 (Lhx1) и нивата на тРНК на транскрипционен фактор 1 (Sall) на подобен на spalt не се различават значително между контролата и Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/мишки в общи бъбречни хомогенати от P0 бъбреци (Фигура 2b). Това предполагаше, чеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)инактивирането в SIX2 нефронови прогенитори не повлиява значително образуването на нефрогенни структури.
Фигура 2|Узряването на нефрона е дефектно при шест2-Tfam-7мишки.(a) Представителни изображения на фиксирани във формалин, вградени в парафин срезове от Cre~ контрола и шест2-Tfam-/бъбреци на възраст постнатален ден (P) 0. Бъбречните срезове се оцветяват с толуидиново синьо и се анализират чрез имунофлуоресценция за експресия на хомеобокс 2 (SIX2) и Е-кадхерин (ECAD), свързана със синус окулис. Уретерните дървета са очертани с пунктирани бели линии. Мезенхимът на капачката (CM), тялото с форма на запетая (CSB), S-образното тяло (SSB) и уретерният връх (UT) са анотирани. (b) Ляв панел, относителни нива на експресия на mRNA на маркери за развитие чрез количествена полимеразна верижна реакция в общи бъбречни хомогенати от шест2-Tfam-/мутанти на възраст PO в сравнение с контролите на Cre котило (n =6 всеки ). Десен панел, относителна гломерулна (glom) и специфична за сегмента на нефрон генна експресия в общи бъбречни хомогенати от шест2-Tfam7мутанти на възраст P7 в сравнение с контролите на Cre-cottmate (n =4 всеки). PT, проксимален тубул; mTAL, дебел възходящ крайник на Henle; DT, дистален тубул; CD, събирателен канал. (c) Оцветени с алциево синьо/периодна киселина-Шиф (AB-PAS) бъбречни срезове на възраст P0, P7 и P14. Стрелките показват PAS-позитивни тубули с граница на четката, звездичките изобразяват гломерули, а цифровите знаци изобразяват кистозни тубули, ленти=100 um за AB-PAS изображения и 50 um за оцветени с толуидин синьо изображения и IF изображения. Данните са изразени като средна стойност± SEM;2-опашен t-тест на Student;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
cistanche мнения
Въпреки че образуването на зараждаща се структура на нефрон не е инхибирано, оцветяването с алциево синьо/периодна киселина-Шиф и лектин на лотосов тетрагонолобус показва дефектно узряване на крайния нефрон при Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А){{0}}мишки на възраст P0. Alcian blue/periodic acid-Schiff, който оцветява тубулните базални мембрани и границата на четката, и лектинът на лотос тетрагонолобус, който идентифицира специфични олигозахариди в границата на четката на проксималните тубулни клетки, са били намалени в мутантните бъбреци. Фигура 2c показва алциево синьо/периодна киселина-Шиф оцветяване в P0, P7 и P14 времеви точки. Хистохимията на лектин на Lotus tetragonolobus и IF оцветяване за протеин на тумор на Wilms 1 в P0, P7 и P14 времеви точки са показани на допълнителна фигура S4. На възраст PO относителната площ, която се оцветява положително с лектин на Lotus tetragonolobus, е 2,10 процента ±0.51 процента и 0.39 процента ± 0.1 процента при възраст P7 спрямо 6,25 процента ± 0,28 процента и 6,2 процента ± 1,1 процента съответно за контролите (n=3-4, P=0.0004 и 0,0007, съответно; Допълнителна фигура S4). В съответствие с тези хистологични находки е значителното намаляване на експресията на гени, кодиращи гломерулни и нефронови сегмент-специфични маркери подоцин, нефрин, аквапорин 1 (Agp1), натриево-фосфатен котранспортер 2a (NaPi2a), уромодулин, натриево-калиев хлорид котранспортер 2 (Nkcc2) и чувствителен към тиазид котранспортер на натриев хлорид (Ncc) в Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/ мишки (Фигура 2b). Взети заедно, тези данни предполагат, че Шест2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- бъбреците показват прогресивно намаляване на броя на зрелите проксимални нефронни сегменти и гломерули.
Тъй като дейността на Six2-eGFP/Cre води доTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-дефицитни сегменти на нефрона, произхождащи от мезенхим, прогнозирахме, че узряването на епителните клетки на CD, които произлизат от пъпките на уретера, няма да бъде засегнато при Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/ бъбреци. В съответствие с това схващане е, че оцветяването с аглутинин на Dolichos biflorus, който реагира с N-ацетил-D-галактоза в дисталния тубул и CD, показва относително свръхпредставяне на положителни за аглутинин структури на Dolichos biflorus в Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- бъбреци. На възраст P7 положително оцветените зони за аглутинин на Dolichos biflorus съставляват 13,91 процента ±0.9 процента от общата площ за мутанти срещу 1,93 процента ± 0.1 процента за контролата (n {{11} }, P=0.0002; Допълнителна фигура S4).mRNA експресията на епителна 1 алфа субединица на натриев канал (Scnnla) или аквапорин 2(Agp2), които и двете се експресират в епителните клетки на CD, не е значително намалена в сравнение с контролата (Фигура 2b). За разлика от Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/-бъбреци,TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)инактивиране в хомеобокс B7 (HOXB7) прогениторни клетки, които пораждат CD епителни клетки, което води до загуба на експресия на CD нефрон маркер и лека тубулна дилатация, но не и цистогенеза (допълнителна фигура S5). Взети заедно, нашите данни показват, че загубата наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)функцията в SIX2 прогениторни клетки не блокира развитието на зараждащи се нефронови структури, но инхибира крайното съзряване на нефрон.
TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- кистите са с дефицит на общи маркери на нефронния сегмент
За характеризиране на хистогенетичния произход наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7бъбречни кисти, за които направихме IF анализиTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um се характеризират с интралуминални отлагания на уромодулин, което предполага произход от сегменти на нефрон, дистални от проксималния тубул и низходящата бримка на Henle (Фигура 3b).
Фигура 3ITfam-/цистите не експресират общи маркери, специфични за нефронния сегмент.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) Представителни изображения на фиксирани във формалин, вградени в парафин бъбречни срезове от Six2-mT/mG; Tfam-7мишки на възраст P14, оцветени за eGFP и уромодулин от IF. Звездичките изобразяват кисти с интралуминален уромодулин. Наличието на интралуминален уромодулин беше изследвано в кисти с максимален диаметър 50-100 um или в кисти с максимален диаметър над 100 um. Решетки =(a,b)100 um. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www kidney-international.org.
Прогресивни аномалии във функцията и морфологията на мтTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7-епителни клетки
За да се характеризира времевият ход на метаболитните последици отTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)делеция, първо изследвахме нивата на иРНК наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)иTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-регулирани mt-Col, mt-Cyb и mt-Atp6 вTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/-бъбреци на възраст PO, P7 и P14. Както се очаква,TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)нивата на mRNA, mt-Col, mt-Cyb и nt-Atp6 бяха значително намалени (Фигура 4а). T fam-7- епителни клетки, маркирани с eGFP (Six2-mT/mG; Tfam{-7мишки) показват значително намаляване на експресията на MT-CO1 протеин (допълнителна фигура S7). Броят на копията на mt ДНК е намален с 63 процента, което е в съответствие с изчерпването на mt, отличителен белег наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)дефицит (Фигура 4а). За разлика от това, експресията на ядрени гени, кодиращи никотинамид аденин динуклеотид: убихинон оксидоредуктазна основна субединица 3 (Ndufs3) и сукцинат дехидрогеназен комплекс флавопротеинова субединица А (Sdha) не е засегната на възраст P0, но е намалена на възраст P7 и P14 (Фигура 4а). Тези констатации от анализа на mt гена и протеина са в съответствие с прогресивната загуба на броя на mt копията в Tfam-/-епител.
След това изследвахме метаболитните ефекти наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)инактивиране в първични проксимални тубулни епителни клетки (PTECs), изолирани на възраст P7.TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7 PTEC показват значителни намаления в базалните нива на потребление на кислород (40,77 ± 4,10 за мутанти спрямо 61,75 ± 5,18 pmol/min/10 клетки за контролите, n=3 всяка, P= 0.034 ), ATP-свързано дишане (33,11 ± 3,91 за мутанти срещу 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* клетки за контроли, n=3 всяка, P=0.093), максимално дишане (116,8 ± ± 14,19 за мутанти срещу 225,5 ± 13,55 pmol/min/10* клетки за контроли, n= 3 всяка, P=0.005) и резервен респираторен капацитет (76,05 ± 10,18 за мутанти срещу 163,7 ± ± 8,61 pmol/min/10* клетки за контроли, n=3 всяка, P= 0.003; Фигура 4b).
cistanche reddit
За да характеризираме допълнително степента на изчерпване и увреждане на mt, ние изследвахмеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- бъбреци чрез трансмисионна електронна микроскопия и 3-размерна структурирана осветителна микроскопия (3D SIM). На възраст P7 митохондриите показват неправилни форми и балонизиране, което е в съответствие с предишни открития вTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)нокаут мишки. Трансмисионният електронен микроскопски анализ показва, че структурни аномалии на митохондриите, като увеличен размер и анормални кристи, прогресират постнатално, тъй като морфологичните разлики между мутанти и контролата са по-малко очевидни на възраст P0 и стават по-тежки с възрастта (Фигура 4c ).3D SIM беше използван за изследване на mt обем и размер на мрежата в Six2-mT/mG;TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/ мутанти в сравнение с шест2-mT/mG контролни мишки на възраст P7; mt обемът се измерва в напречни сечения от 5 до 8 тубула на секция, като се изследват 25 до 40 eGFP-положителни кортикални епителни клетки, оцветени за волтаж-зависим анион-селективен канал 1 чрез IF оцветяване. Установихме, че общият mt обем на eGFP-положителна клетка е значително намален (62,66 ± 16,46 um/клетка за мутанти спрямо 177,4±30.17 μm'/клетка за контролите, n=3 всяка , P= 0.0289) и се свързва с промяна в съотношението на общия mt обем спрямо общия клетъчен обем от 0.230 ±0.01 в контролите до 0.089 ± 0.016 в шест 2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7 мутанти (n= 3 всеки, P=0.0017; Фигура 4c). Максималният размер на mt мрежата, който измерва най-голямата mt мрежа, срещана във всички изследвани eGFP-положителни клетки, беше намален в шест2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/ бъбреци（143,2 ± 23,2 μm² за мутанти срещу 318,3 ± 49,45 um² за контроли, n= 3 всеки, P= 0.0327）. Взети заедно, ултраструктурните и SIM констатациите и констатациите от mt генен и протеинов анализ са в съответствие с прогресивната загуба на броя на mt копията вTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-7-епител.
Фигура 4| Tfam-/бъбречният епител се характеризира с прогресивно изчерпване на митохондриите.(a) Експресия на митохондриален (mt) ген чрез количествена полимеразна верижна реакция на възраст постнатален ден (P) {{0}}, P7 и P14 (кратна промяна спрямо контрола, n =6 всеки) и Съдържание на mt ДНК (P7) в общи бъбречни хомогенати от контрола Cre~ от едно котило (co) и Six2-Tfam-/мишки. (b) Степен на потребление на кислород (OCR) в първични проксимални тубулни епителни клетки (PTECs), изолирани от контрола на родно котило Cre и шест2-7фамилни бъбрека на възраст P7 на платформа Seahorse XFe24. Представителни OCR измервания в контролни и Tfam-7PTECs, третирани с олигомицин А (олиго А, инхибиране на аденозин трифосфат [АТР] синтаза), карбонил цианид-р-трифлуоро метоксифенил хидразон (FCCP, разединител) и инхибитори на окислителното фосфорилиране ротенон и антимицин А(АА). Показани са също така изчислените базално и максимално дишане, ATP-свързано дишане и резервен респираторен капацитет (n =3 всеки). (c) Ултраструктурен анализ на митохондриите чрез трансмисионна електронна микроскопия. Представителни трансмисионни електронномикроскопични изображения на бъбречни участъци от Cre-control и шест2-Tfam-7мишки на възраст P0 и P7, Червените стрелки изобразяват митохондриите. Бар=500 nm. (d) Триизмерни структурирани осветени микроскопски изображения на бъбречни срезове от Six2-mT/mG (co) и Six2-mT/mG; Tfam-/-мишки на възраст P7. Подобрен зелен флуоресцентен протеин (eGFP), субединица 4 на цитохром с оксидаза (COXⅣ) и волтаж-зависим анион-селективен канал 1 (VDAC) бяха открити чрез имунофлуоресценция. 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAP ) се използва за ядрено оцветяване (синя флуоресценция). Белите пунктирани линии очертават бъбречния тубул в контролата и лумена на кистата в мутантния бъбрек, а цифровите знаци изобразяват тубуларен лумен в контролата или лумена на кистата в мутантния бъбрек. Площта на mt се определя количествено с Imaris софтуер (Oxford Instruments, Abingdon, UK; n =3 всеки). Общ (tot) mt обем (vol) на eGFP-положителна клетка (25-40 клетки/анализирана проба), съотношението на общия mt обем за общ обем на клетката и максималния (максимален) размер на mt мрежата на клетка. Размерът на mt мрежата се определя в тръбно напречно сечение с 5 клетки на напречно сечение. Ленти =4 um. Данните са представени като средно ± SEM и бяха анализирани чрез t-тест на Student<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)дефицитът измества метаболизма на бъбречния епител към гликолиза
PTEC в бъбреците използват окисление на мастни киселини и OXPHOS за генериране на АТФ и са глюконеогенетични.' степен За да получим допълнителна представа за метаболитните промени, свързани с инактивирането на Tam, извършихме анализ на РНК секвениране на бъбреците от Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- и Cre~ контролни мишки от едно котило на възраст P7. Открихме, че ключови регулаторни гени, участващи в гликолизата, като хексокиназа 2 (Hk2) и енолаза 2 (Eno2), са регулирани нагоре. Обратно, експресията на повечето гени, участващи в цикъла на трикарбоксилната киселина, е намалена (напр. изоцитрат дехидрогеназа 1 [Idh1), както и експресията на гени, участващи в окислението на мастни киселини, като ацетил коензим А ацилтрансфераза 1B (Acaalb), средноверижна ацил-коензим А дехидрогеназа (Acadm) (Фигура 5a и b, допълнителна фигура S8). В съответствие с намалената експресия на гени, участващи в контрола на цикъла на трикарбоксилната киселина и мутантни бъбреци на възраст P7, използвайки платформа Seahorse XFe24 (Agilent, Санта Клара, Калифорния). Мутантните PTEC се характеризират със значително увеличение на базалната гликолиза (скорост на изтичане на протон=117.4 ± 12.07 pmol/min за мутанти и 73.34 ± 6.33 pmol/min за контрола, n{{25 }}, P=0.{{30}}032) и намаление на съотношението на mt скоростта на консумация на кислород спрямо скоростта на гликолитичен протонен ефлукс от 0,73 ± 0,08 в контролата до 0,34 ± 0,02 в мутантни PTEC (n=3, P=0.0074). Взети заедно, тези данни показват товаTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/- епителните клетки са претърпели метаболитно изместване от OXPHOS и окисление на мастни киселини към гликолиза (Фигура 5d).
Фигура 5] Дефицитът на бъбречен епителен митохондриален транскрипционен фактор А (TFAM) е свързан с повишена гликолиза и анормален метаболизъм на мастни киселини.(a) Анализ на метаболитната генна експресия чрез РНК секвениране на цял бъбречен кортекс, изолиран от Six2-Tfam-/- и Cre-littermate контролни (co) мишки на възраст постнатален ден (P) 7 (n {{6 }} всеки). Показани са диференциално регулирани метаболитни гени, участващи в гликолизата и цикъла на трикарбоксилната киселина. Гените със статистически значимо увеличение на експресията на mRNA са показани в червено, а гените с намалена експресия са показани в зелено. (b) нива на експресия на mRNA на избрани диференциално регулирани гени чрез количествена полимеразна верижна реакция (n=4-6). (c) Променен метаболизъм на мастни киселини при шест2-7Tfam-7мутантни мишки. Представителни изображения на оцветени с маслено червено О бъбречни срезове от Six2-Tfam-7и Cre-littermate контролни мишки на възраст P14. Стрелките сочат масленочервени О-позитивни клетки, а числото sian изобразява цената. Лента=10 um.(d) Анализ на гликолитичния поток на първични проксимални тубулни епителни клетки (PTECs), изолирани от контрола на родно котило Cre и шест2-Tfam-/бъбрека на възраст P7 (n=4 всеки ) на платформа Seahorse XFe24. Показани са представителни измервания на скоростта на гликолитичен протонен ефлукс (glyco PER) в контрола и Tfam-7PTECs, третирани с 2-дезоксиглюкоза (2-DG) и инхибитори на окислителното фосфорилиране ротенон и антимицин A(AA) . Също така са показани средната стойност на глико PER на изходно ниво и съотношението на митохондриалната (mt) скорост на потребление на кислород (OCR) спрямо глико PER. Данните са представени като средно ± SEM и са анализирани с помощта на t-теста на Student. (Продължение)
НамаленаTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)експресията в миши и човешки PKD тъкани е свързана с изчерпване на mt
Защото Шест2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/ бъбреците имаха голяма прилика с PKD бъбреците, след това преценихме далиTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)е нарушена регулация в тъканите на PKD. Първо прегледахмеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)и TFAM-регулирана генна експресия в 2 добре установени генетични PKD миши модела.TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)Нивата на тРНК бяха значително намалени в хомогенати на цял бъбрек от Pkd1-/- и Cyspk/pk мишки, които носят мутации в Pkd1 или Cys1. Това се свързва с намаляване на експресията на митохондриално и ядрено кодирани mt гени, както и с нерегулирана експресия на гликолитичен ген. Подобно на Six2-TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)-/бъбреци, Pkd1-7 и CysPkpk бъбреците се характеризират с повишени нива на Eno2 и Hk2 и значително понижени нива на фосфоглицерат киназа (Pkg)1, пируват дехидрогеназа киназа (Pdk)1 и Pdk4 транскрипти (Фигура 6а).TFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)протеиновата експресия, оценена чрез IF оцветяване, е намалена в епителните клетки, облицоващи кисти, в сравнение с епителните клетки от съседни некистични тубули (Фигура 6b). Това беше свързано с намалена експресия на mt-Co1 и mt-Atp6 чрез РНК флуоресценция in situ хибридизация (Фигура 6b, Допълнителна фигура S9); mt обем, определен от 3D SIM, е намален с 55 процента в сравнение или с епителни клетки от съседни, некистични тубули, или с PTEC от нормални контролни бъбреци. Разлики в mt обема между нормалните контролни PTECs и PTECs от некистични тубули не бяха открити (Фигура 6c).
Фигура 6| Експресията на митохондриален транскрипционен фактор А (TFAM) е намалена в Pkd1-7-и CysPkepk бъбречни кисти.(a) Относителни нива на експресия на иРНК (кратна промяна спрямо контрола на роднини от Cre) на митохондриално и ядрено кодирани митохондриални и гликолитични гени в Pkd1-7и Cyskiddys (n=3-5). (b) Представителни изображения на бъбрек срезове от Pkd1-7и контролни мишки от котило, анализирани на възраст постнатален ден (P)22. Показани са имунофлуоресцентно (IF) оцветяване за TFAM и РНК флуоресцентна in situ хибридизация (RNA-FISH) за транскрипти на митохондриално кодирана цитохром c оксидаза 1 (mt-Co1) и митохондриално кодирана ATP синтаза мембранна субединица 6 (mt-Atp6). Белите стрелки идентифицират епителните клетки, покриващи кистата, със силно намалена експресия на TFAM, mt-Co1 или mt-Atp6. Гломерулите са маркирани с gl. TFAM-експресиращите тубулни структури се идентифицират чрез червена флуоресценция. Звездичките изобразяват тубулни епителни клетки с откриваеми mt-Co1 и mt-Atp6 транскрипти. 4',6-диамидино-2-фениндол (DAPI) се използва за ядрено оцветяване (синя флуоресценция). Ленти=25 um за IF изображения и 10 μm за RNA-FISH изображения. （c） Триизмерна структурирана осветителна микроскопия. Показани са изображения на бъбречни срезове от Pkd1-7-бъбреци, анализирани чрез хистохимия с лотосов тетрагонолобус лектин (LTL) и IF за субединица 4 на цитохром с оксидаза (COXIV) и експресия на волтаж-зависим анион-селективен канал 1 (VDAC). Митохондриалният (mt) обем се определя количествено със софтуер Imaris въз основа на оцветяване с COXIV. Стрелките изобразяват епителните клетки, покриващи кистата, цифровите знаци изобразяват лумина на кистата, а звездичките изобразяват некистозни тубули. Епителните клетки, покриващи кистата, са очертани с пунктирани линии. Ленти=10 μm за левия панел и 3 μum за десния панел. Данните са представени като средна стойност ± SEM и са анализирани с помощта на t-теста на Student *P<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
За да се провери дали загубата наTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)експресията е обща молекулярна характеристика на човешкия PKD, ние анализирахме проби от нефректомия от 5 ADPKD пациенти чрез имунохистохимия, IF оцветяване, РНК флуоресценция in situ хибридизация и 3D SIM. НамаленаTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)експресията се наблюдава при 75,2 процента ± 7,5 процента от бъбречните кисти, анализирани чрез имунохистохимия. Това беше свързано с намалена експресия на MT-CO1 и MT-ATP6 чрез РНК флуоресценция in situ хибридизация (Фигура 7а, допълнителна фигура S10); Обемът на mt в епителните клетки, покриващи кистите, е намален с приблизително 70 процента, както е оценено чрез 3D SIM (Фигура 7b). Взети заедно, анализът на 2 PKD миши модела и човешки ADPKD тъкани предполага, чеTFAM(насочен митохондриален транскрипционен фактор А)дефицитът и изчерпването на mt са често срещани находки в тъканите на PKD и е вероятно да повлияят на патогенезата на бъбречно кистозна болест.
Фигура 7| Експресията на митохондриален транскрипционен фактор А (TFAM) в бъбречни кисти от пациенти с поликистоза на бъбреците е намалена.(a) Представителни изображения на фиксирани във формалин парафинови срезове от нормални човешки бъбреци и бъбреци от пациенти с поликистозна бъбречна болест (PKD), анализирани чрез имунохистохимия за експресия на TFAM, чрез имунофлуоресценция (IF) за волтаж-зависим анион-селективен канал 1 (VDAC ) експресия и чрез РНК флуоресцентна in situ хибридизация за митохондриално кодирана цитохром с оксидаза 1(MT-CO1) и митохондриално кодирана ATP синтазна мембранна субединица 6(MT-ATP6) mRNA експресия, Стрелките идентифицират епителните клетки, покриващи кистата, цифровите знаци изобразяват лумината на кистата , а звездичките изобразяват гломерули. Лента=100 μm за изображения с ниско увеличение и 10 um за изображения с голямо увеличение (b) Представителни 3-размерни структурирани осветени микроскопични изображения на човешки PKD бъбречни срезове, анализирани с IF за VDAC експресия.4',{ {17}}диамидино-2-фенилиндол (DAPl) се използва за ядрено оцветяване (синя флуоресценция). Прекъснатите линии маркират тубулите, а цифровите знаци изобразяват тубуларен или цистообразен лумин. Митохондриалният (mt) обем се определя количествено с помощта на софтуер Imaris (n=5). Лента =4 μm. Данните са представени като средна стойност ± SEM и са анализирани с помощта на t теста на Student.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
