Въглеродният окис (CO) облекчава ефективно диабетната нефропатия (DN).
Mar 16, 2022
за повече информация:ali.ma@wecistanche.com
Част Ⅰ: Въглеродният окис облекчава стареенето при диабетна нефропатия чрез подобряване на автофагията
Гуибин Мейл; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & при ал.В
ВЪВЕДЕНИЕ
Диабетна нефропатия (DN) е едно от най-често срещаните и сериозни диабетни микроваскуларни усложнения. Статистически 20 процента -40 процента от пациентите с DN (Диабетна нефропатия) ще се развие в краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD) със скорост 14 пъти по-бърза от други бъбречни заболявания. Освен това повишеният сърдечно-съдов риск от DN (Диабетна нефропатия)пациенти до голяма степен допринася за високата смъртност.2Сложната патогенеза на ДН (Диабетна нефропатия)все още не е ясно с наличния ограничен подход на лечение. Следователно е спешно да се идентифицират патогенезата и терапевтичните средства за предотвратяване на прогресивната загуба на бъбречна функция на DN (Диабетна нефропатия).
Стареещите клетки, характеризиращи се с постоянно спиране на клетъчния цикъл, привлякоха голямо внимание като „зомби клетки“. Поради резистентност към апоптоза и продължаващо производство на секреторен фенотип, свързан със стареенето (SASP), стареещите клетки все повече се признават като решаваща причина за заболявания, свързани с възрастта. Бъбречна дисфункция, свързана със стареенето, често се наблюдава при DN (Диабетна нефропатия)пациенти и експериментални модели, като мишки, индуцирани от STZ (диабет тип 1 (T1D)) и db/db (диабет тип 2 (T2D)). Важно е, че изчистването на p16-позитивните клетки на възрастни мишки подобрява гломерулосклерозата. Освен това, нокаутирането на p21 или p27 при T1D мишки облекчава протеинурията и гломерулната дилатация. Тези резултати предполагат, че стареенето играе важна роля в патогенезата на DN (Диабетна нефропатия). Въпреки това, регулирането на стареенето в DN (Диабетна нефропатия)остава неясна.
Появяващите се доказателства показват, че аутофагията, механизъм за разграждане на вътреклетъчното съдържание, е валиден регулатор на стареенето." Въпреки че е докладвано, че аутофагията насърчава придобиването на стареещ фенотип, анти-стареещият ефект на аутофагията е по-широко приет. докладвано е, че автофагията удължава живота на стари мишки и стари мухи.10 По-нататъшни проучвания показват, че нокаутирането на Atg7 влошава стареенето на стволови клетки.11 По-важното е, че делецията на Atg5 влошава протеинурията и фиброзата, основните характеристики набъбрекстареене.12.13 По този начин лекарствата, насочени към автофагията за облекчаване на стареенето, може да са една от най-обещаващите стратегии за DN (Диабетна нефропатия)профилактика и лечение.
Въглероден окис (CO), генериран чрез катаболизма на хема от хем оксигеназните ензими, е ендогенна газообразна молекула. Редица публикации разкриват противовъзпалителните, антиапоптозните и други защитни свойства на CO (Въглероден окис), когато се прилагат в ниски дози.14 Въпреки че CO (Въглероден окис)е добре проучен за предоставяне на ренопротекция на исхемия-реперфузия илибъбректрансплантационни мишки,15 ефектът и механизмът на CO (Въглероден окис)на DN (Диабетна нефропатия)са неясни. Наскоро литературата показа, че CO (Въглероден окис)придаде цитопротективна роля като активатор на аутофагия в островчета, предизвикани от хипоксия,16 мишки със сепсис7 и възрастни плъхове със сърдечен арест.18 Освен това, прилагането на CO (Въглероден окис)облекчава стареенето на ендотелните клетки, причинено от лекарствена токсичност.1 Тези констатации очевидно насърчават потенциалното медииране на автофагията, насочена от CO (Въглероден окис)за подобряване на стареенето.
Следователно, ние предположихме, че натрупването на стареещи клетки вбъбрекна DN (Диабетна нефропатия)мишки могат да бъдат обърнати от CO (Въглероден окис)чрез активиране на автофагия, впоследствие подобрявайки бъбречната дисфункция. За да тестваме нашата хипотеза и да изследваме основните механизми, ние приложихме обработката на освобождаваща въглероден оксид молекула -2 (CORM-2) in vivo (експерименталната DN (Диабетна нефропатия)мишки) и in vitro (мезангиални клетки на плъх, човешки тубулни епителни клетки и човешки подоцит).
Бъбречна функция: как въглеродният окис (CO) влияеДиабетна нефропатия (DN)
Кликнете върху Cistanches и продукти Cistanche за бъбречно заболяване
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
2.1|Експериментален дизайн с животни
Осемседмични мъжки мишки C57BL/6J (Charles River) бяха държани в стандартен цикъл светлина/тъмнина (12:12 часа) с нормална диета (ND) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (60 процента енергия от мазнини ) в продължение на 16 седмици.20 На седмица 17 от проучването мишките, хранени с HFD, получават интраперитонеални инжекции от STZ (50 mg/kg) в продължение на 7 дни, докато мишките с ND са инжектирани с носител (цитратен буфер, pH=4 .5). Една седмица след инжекциите нивата на кръвната захар на убождане на опашката бяха измерени два пъти на интервал от 24 часа. След това DN (Диабетна нефропатия)мишки с нива на глюкоза от 16,9 mmol/L или повече бяха разделени на три групи на случаен принцип, с 15 животни във всяка група (DN (Диабетна нефропатия), DN (Диабетна нефропатия)плюс CO и DN (Диабетна нефропатия)плюс iCO): група, наречена DN контрола и други групи, лекувани с интраперитонеални инжекции (два пъти седмично в продължение на 16 седмици) на CORM-2 (3 mg/kg) или невалиден CORM-2, който беше произведени чрез освобождаване на CO (Въглероден окис)от CORM-2 при стайна температура. В края на експерименталния период мишките бяха анестезирани, кръвни проби бяха събрани чрез енуклеация на очни ябълки и бъбреците бяха събрани за анализ. Всички животни бяха третирани в съответствие с Ръководните принципи за грижа и използване на лабораторни животни, публикувани от Националния институт по здравеопазване на САЩ, и всички процедури за животни бяха одобрени от Комитета за грижа за животните към Съвета на медицинския колеж Tongji.
2.2|Биохимичен и хистологичен анализ на плазмата
Събраната цяла кръв и серум се съхраняват при -80 градуса за анализ. Азотът на уреята в кръвта (BUN) се измерва с налични в търговската мрежа комплекти за анализ (Jiancheng Bioengineering Institute, Китай). След като бъбреците бяха отстранени и повърхността беше измита с физиологичен разтвор. Бъбречната тъкан се оцветява с хематоксилин-еозин и трихромно оцветяване на Masson и накрая се наблюдава с микроскоп.
2.3|Електронна микроскопия
Малки парчета от бъбречната кора бяха фиксирани в глутаралдехид (2,5 процента) и вградени в аралдит. Тъканта беше полимеризирана, нарязана на ултратънки срезове (80-100 nm) с помощта на ултрамикротом (Leica EM UC7). Тънките резени върху медната решетка се оцветяват и наблюдават под трансмисионен електронен микроскоп (Tecnai G220 TWIN).
2.4|Еластография със срязваща вълна
В края на експерименталния период, мишките бяха анестезирани и изпратени в ултразвуковата лаборатория (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China) за еластография със срязваща вълна, използвайки скорошен обхват (Supersonic Imagine). Средният модул на Young (Eman) се използва за измерване на твърдостта на бъбречния паренхим.
2,5|SA- -гал оцветяване
Замразенибъбрексрезове и клетки, посяти в 6-ямкова плака, бяха използвани за откриване на SA- -gal активност от търговски комплект (Beyotime Biotechnology) съгласно инструкциите на производителя. Синьото петно се счита за зона на натрупване на стареещи клетки.
2.6|Количествена PCR в реално време за експресия на иРНК
Съгласно инструкциите (TaKaRa BIO INC), РНК от бъбречна тъкан се екстрахира с помощта на реагента TRlzol. Експресията на mRNA беше количествено определена с TB green-базиран gRT-PCR комплект и специфични праймери (Таблица 1). Всяка генна експресия беше оценена със собствена стандартна крива и нивото на mRNA на Gapdh беше количествено определено като ендогенна контрола.
2.7|Уестърн блотинг и имунопреципитация
Бъбречната тъкан или клетка се хомогенизира и лизира, след което се определя количествено чрез комплект за анализ на BCA протеин (Beyotime Biotechnology). Протеинът се отделя и след това се прехвърля върху PVDF мембраните (Millipore). След като бъдат блокирани, мембраните се инкубират една нощ с първични антитела (Таблица 2). След промиване, мембраните се инкубират със съответното вторично антитяло. Плътността на всяка целева лента беше количествено определена от софтуера Image Pro-Plus 6.0 и нормализирана към GAPDH като оптична плътност. Всички размери на проби от животни или клетки са по-големи или равни на 3.
Лизат от бъбречна тъкан се центрофугира (14 000 g при 4 градуса C за 30 минути） и супернатантата се изчиства предварително с 20 μL протеин A/G агарозни зърна за 2 часа и се инкубира една нощ с Bcl{{6} } или мишо lgG антитяло. Имунопреципитатите се промиват, ресуспендират се, варят се и се анализират чрез Western blot, използвайки анти-Beclin-1 (технология за клетъчно сигнализиране) и анти-Bcl-2 (Proteintech), както е описано по-рано .21
ТАБЛИЦА 1 Количествени PCR праймерни последователности в реално време
2.8|Имунофлуоресценция
Бъбречната тъкан, вградена в OCT среда, беше нарязана на замразени срезове с дебелина 6-8 μm. След блокиране с 10 процента нормален кози серум, срезовете се инкубират една нощ с първични антитела. На следващия ден тъканта беше белязана с вторични антитела. След като се изплакнат с PBS, предметните стъкла се инкубират с DAPI и впоследствие се фотографират под флуоресцентен микроскоп (Olympus).
2.9|Клетъчна култура
HBZY-1 се поддържа в DMEM (Gibco), а HK-2 се поддържа в DMEM/F12 (Gibco), допълнен с 10 процента фетален телешки серум, 100 U mL-1 пеницилин/стрептомицин (Gibco ) при 37 градуса във влажна атмосфера, съдържаща 95 процента въздух и 5 процента CO (Въглероден окис). HPC, предоставен от професор Chun Zhang от Huazhong University of Science and Technology, се поддържа в RPMI 1640 (Gibco). HPC първо се размножава при 33 градуса и след това се прехвърля на 37 градуса за диференциация, преди да може да се използва в експерименти, както е описано по-рано.22
2.10|ELIS анализ
След като HPC се третира по различен начин и се култивира в продължение на 5 дни, половината от супернатантата се изважда за откриване (освободен VEGF). Клетките бяха разбити с помощта на ултразвукова клетъчна трошачка (SONICS), което позволява на протеините да бъдат освободени напълно в останалия супернатант (общ VEGF). След това концентрациите на VEGF бяха измерени с помощта на търговски комплект ELISA (MEIMIAN). Съотношението на освободения VEGF към общия VEGF е степента на изтичане на VEGF.
2.11|Заглушаване на ген
Нокдаун на Atg7 в HK-2 клетки беше постигнат чрез използване на процедура за обратна трансфекция на siRNA, извършена в плочи с шест ямки. Веднъж нараснали до 70 процента сливане, клетките бяха трансфектирани с siRNA или разбъркана siRNA (RiboBio), използвайки Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) съгласно протокола на производителя. След 48 часа трансфекция, ефективността на трансфекцията беше потвърдена чрез Western blot за валидиране на последователността (ACTCGAGTCTTTCAAGACT).
ТАБЛИЦА 2 Всички списъци с антитела
2.12|Наблюдавайте автофагичния поток
Плазмидите, съдържащи лентивирусен вектор RFP-GFP-LC3 (Genecopoeia), бяха конструирани и след това опаковани в клетки HEK293T съгласно инструкциите на производителя (GeneCopoeia). Вирусният супернатант се събира, за да се заразят HK-2 и HBZY-1 клетки, за да се наблюдава потокът на автофагия. Тази сонда може да различи автофагозоми (GFP*/RFPt, жълта точка) и автолизозоми (GFP-/RFPt, червена точка).
2.13|Анализ на данни
Данните бяха анализирани с помощта на Graph Pad Prism8 и показани като средна стойност ± SEM. Разликите между групите бяха определени чрез еднопосочен дисперсионен анализ. Значението беше определено като P<>
РЕЗУЛТАТИ
3.1|CO (Въглероден окис)атенюирана бъбречна дисфункция на DN (Диабетна нефропатия)мишки
За да проучи повторната защита на CO (Въглероден окис), DN (Диабетна нефропатия)моделът е индуциран от HFD и STZ (Фигура 1A). След 34 седмици експериментално хранене, кръвната захар, теглото,бъбрек-телесно съотношение, креатинин и BUN бяха измерени. В DN (Диабетна нефропатия)група,бъбрек-телесно съотношение, креатинин и BUN бяха повишени, докато лечението на CO (Въглероден окис)обърнати аномалии (Таблица 3). Последователно, бъбречната морфология на DN (Диабетна нефропатия)мишки е изключително разстроен с десквамация на епителни клетки, вакуолна дегенерация, разширяване на гломерулното пространство на Bowman и мезангиална експанзия (Фигура 1В). Освен това, ултраструктурата на гломерула показва удебеляване на базалната мембрана и изтриване на процеса на подоцитното краче (Фигура 1B). Напротив, CO (Въглероден окис)лечението се нормализира над отрицателните морфологични промени (Фигура 1B). В допълнение, фибриларният колаген, отложен в бъбречната кора (Фигура 1C), и бъбречната твърдост, измерена чрез еластография със срязваща вълна, бяха увеличени при DN (Диабетна нефропатия)мишки (Фигура 1D). Както се очаква, CO (Въглероден окис)значително подобрена бъбречна дисфункция на DN (Диабетна нефропатия)включително фиброза.
ФИГУРА 1 CO (Въглероден окис)атенюирана бъбречна дисфункция на DN (Диабетна нефропатия)мишки, индуцирани от HFD и STZ.
Схема на експериментален дизайн. B, Представителни изображения набъбректъкан, оцветена с H&E (скала: 50 μm), PAS (скала: 10 μm) и ултраструктурни промени в гломерулната морфология, оценени чрез трансмисионна електронна микроскопия (скала: 1 μm).
И статистическите данни за съотношението на PAS-позитивните към гломерулната област, дебелината на GBM, ширината на стъпалото и броя на израстъците на стъпалото на mm GBM (n=3).
C, Представителни изображения на бъбречната тъкан, оцветена с трихром на Masson и статистическите данни за положителна област (n=3). Скала: 25 μm.
D, Еластография на срязваща вълна, открита с ехографски обхват и количествено определяне на модула на Young като степен на бъбречна фиброза (n=7). *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>
ТАБЛИЦА 3 Метаболитни данни на мишки във всички групи
3.2|CO (Въглероден окис)облекчено стареене при DN (Диабетна нефропатия)мишки и бъбречни клетки, предизвикани от висока глюкоза
Стареенето все повече се смята за основната причина за бъбречна фиброза, отличителен белег на стареенето.23 Да се изследва анти-стареещият ефект на CO (Въглероден окис), направихме SA- -gal оцветяване на бъбрека. Повишените SA- -gal* и p16* клетки се натрупват в бъбречната кора в DN (Диабетна нефропатия)група, докато контролната и CO (Въглероден окис)-лекувани бъбреци показват от време на време положителни резултати (Фигура 2A, B). От анатомичната позиция на бъбрека положителната експресия на р16 се открива в мезангиални клетки (жълта стрелка), бъбречни тубулни епителни клетки (червена стрелка) и подоцити (черна стрелка). Стареене, настъпило в DN (Диабетна нефропатия)мишки беше допълнително подкрепено от очевидната регулация на класически протеини, свързани със стареенето, включително p53, p21 и p16 (Фигура 2C). Обратно, администрирането на CO (Въглероден окис)облекчи горното стареене.
секреторният фенотип, свързан със стареенето, отличителният секретом на стареещите клетки, се съобщава, че нарушава микросредата и улеснява прогресията на заболяването.2 Следователно, нивата на тРНК на някои представителни SASP са измерени, включително I-1, Il-6 , Tgf-, Tnf-a, Vegf, Icam-1 и Vcam-1. Резултатите показват, че необичайните увеличения на този SASP са били предотвратени от CO (Въглероден окис)интервенция (Фигура 2D).
Като се има предвид потискащото стареене на CO (Въглероден окис)in vivo, ние допълнително изследваме неговия анти-стареене ефект in vitro модел на 3 типа бъбречни клетки, включително мезангиални клетки на плъх (HBZY-1), човешки тубуларни епителни клетки (HK-2) и човешки подоцит (HPC). След излагане на висока глюкоза (HG, 35 mmol/L), 3 вида клетки показват увеличаване на SA- -gal с по-голяма морфология на ден 7 (Фигура 2E), ден 5 и ден 14 (Фигура 2l) , съответно. По-специално, увеличаването на скоростта на изтичане на LDH на HBZY-1 показва, че HG-индуцираното клетъчно стареене и увреждане (Фигура 2F). За да се изследва подходящата доза CO (Въглероден окис), HBZY-1 е третиран с различни концентрации на CORM-2. Чрез измерване на скоростта на изтичане на LDH (Фигура 2F), EdU-положителни клетки (Фигура 2G) и SA- -gal (Фигура 2H), открихме, че концентрацията от 1 μmol/L има по-добър ефект на интервенция. Последователно CO (Въглероден окис)(1μmol/L）също намалява положителната експресия на SA- -gal в HK-2 и HPC (Фигура 2). Взети заедно, тези открития разкриват, че CO (Въглероден окис)играе забележителна роля срещу стареенето както in vivo, така и in vitro.
ФИГУРА 2 CO (Въглероден окис)облекчено стареене при DN (Диабетна нефропатия)мишки и бъбречни клетки, предизвикани от HG.
A, Представително изображение набъбректъкан, оцветена с SA- -gal и статистическите данни за положителната област (n=3). Гломерулът е обозначен с червения пунктиран кръг. Скала: 25 μm.
B, Положителната експресия на p16 вбъбреке показано чрез имунохистохимия (n=3). Жълтите стрелки показват мезангиални клетки, червените показват бъбречни тубулни епителни клетки, а черните стрелки показват подоцити. Скала: 25 μm.
C, Нивата на протеини на маркери за стареене, определени чрез имуноблоти и денситометричен анализ на p53, p21 и p16 (n=3).
D, Кратни промени в нивата на експресия на SASP иРНК (Il-1, Il-6, Tgf-, Tnf-, Vegf, Icam-1 и Vcam-1) (n По-голямо или равно на 4).
E, HBZY{{0}}, изложен на NG (5 mmol/L) или HG (35 mmol/L), се оцветява със SA- -gal от ден 0 до ден 7 и статистически данни за SA - -gal-положителни клетки на 5 и 7 d (n=3). Скала: 50 μm.
F, Скоростта на освобождаване на LDH на HBZY{{0}}, третиран с различни концентрации на CORM-2 (0,1, 1, 10 и 100 μmol/L) (n=6).
G, Делът на EdU-позитивните HBZY-1, третирани с различни концентрации на CORM-2 (n=3).
H, SA{0}}gal оцветяване в HBZY-1, третиран с различни концентрации на CORM-2 (n=3). Скала: 50 μm.
I, Представителни изображения на SA- -gal на HPC (ден 5) и HK-2 (ден 14) с прилагане на CORM-2 (1μmol/L) и статистически данни (n { {6}}). Скала: 50 μm. *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>
3.3|CO (Въглероден окис)активирана автофагия и подобрен поток на автофагия in vivo и in vitro
Все повече изследвания разкриват отрицателната регулация на автофагията до стареене и CO (Въглероден окис)се счита за активатор на автофагия. За изследване на ефектите от автофагията на COon в DN (Диабетна нефропатия)бяха измерени серия от протеини, свързани с автофагия. В сравнение с мишки с диабет, CO (Въглероден окис)лечението значително повишава експресията на белтъка за започване на аутофагия Beclin-1(Фигура 3A) и намалява субстрата на аутофагията p62 (Фигура 3B), но намалява съотношението на LC3Il към LC3l, маркера на автофагозома (Фигура 3C). Предишни доказателства предполагат, че това противоречие може да се дължи на блокиран поток на автофагия, причинен от дисфункцията на лизозомата. 25 Резултатите показват, че свързаните с лизозома протеини Катепсин B и LAMP2 са повишени в DN (Диабетна нефропатия)плюс COgroup в сравнение с DN (Диабетна нефропатия)група (Фигура 3D). Освен това, анализът на съвместната локализация на LC3 puncta и LAMP2 подкрепи, че CO (Въглероден окис)значително намалява натрупването на автофагозоми и увеличава броя на автолизозомите (Фигура 3E).
Последователно, дисфункцията на аутофагията и лизозомата беше открита in vitro, както се вижда от нивата на протеини и лизозомни проби (Фигура 3F, G). Освен това, HK-2 и HBZY-1 бяха трансфектирани с лентивирус RFP-GFP-LC3 за наблюдение на потока на автофагия. При условие на HG, точките на автофагозомите бяха увеличени и автолизозомите бяха намалени в HBZY-1 и HK-2, което не беше допълнително променено с лечение с хлорохин (CQ). CO (Въглероден окис)увеличава броя на автолизозомите и намалява автофагозомите, което се инхибира от добавянето на CQ (Фигура 3H, I). В обобщение, тези резултати показват, че CO (Въглероден окис)активирана автофагия и подобрен поток на автофагия in vivo и in vitro.
3.4|CO (Въглероден окис)облекчено стареене чрез подобряване на автофагията in vitro
За по-нататъшно изследване на ролята на аутофагията в механизма против стареене на CO (Въглероден окис), комбинация от CORM-2 и инхибитори на аутофагията е използвана в бъбречни клетки, изложени на HG. Два вида инхибитори, wortmannin (WORT) за блокиране на инициирането на аутофагия и CQ за възобновяване на потока на аутофагия, ефективно обърнаха намаляването на SA- -gal от CO (Въглероден окис)в 3 вида бъбречни клетки (Фигура 4А). Последователно CO (Въглероден окис)значително увеличи дела на EdU клетките, който беше инхибиран от два инхибитора в HBZY-1(Фигура 4B) и HK-2(Фигура 4C). При HBZY-1 ефектът на облекчаване на стареенето на CO (Въглероден окис), показано чрез намалената експресия на p53, p21 и p16, отсъства след добавянето на инхибитори на автофагията (Фигура 4D). По подобен начин имунофлуоресцентният анализ показа, че инхибиторите на аутофагията блокират намаляването на p53- и p16-позитивните клетки от CO (Въглероден окис)в HK-2 （Фигура 4印） и HPC (Фигура 4F). Освен това, мълчанието на Atg7 (Фигура 4G) блокира защитните ефекти на CO (Въглероден окис), показано чрез увеличени SA- -galt клетки и намалени EdU*клетки в HK-2(Фигура 4H). Гореспоменатите резултати предполагат, че CO (Въглероден окис)потиска стареенето чрез подобряване на автофагията.
3.5|Активираната аутофагия може да влоши SASP в DN (Диабетна нефропатия)мишки
Допълнително проучихме специфичната връзка между автофагията и стареенето. Изследванията показват, че автофагията облекчава стареенето чрез селективно разграждане на GATA4, който положително регулира NF-KB за освобождаване на SASP.26 В съответствие с това голямо количество SASP е разработено в DN (Диабетна нефропатия)група (Фигура 2D), а експресията и ядрената транслокация на р65 бяха увеличени (Фигура 5А). Въпреки това нивото на протеин на GATA4 остава непроменено, което предполага, че GATA4 може да не медиира генерирането на SASP в състояние с висока глюкоза (Фигура 5B). Освен това проучванията разкриха, че отделението за пространствено свързване на TOR-аутофагия (TASCC), образувано от комбинацията от mTOR, късна автофагозома и лизозома, ускорява стареенето чрез увеличаване на секрецията на SASP. 27 Въпреки това резултатите от имунофлуоресценцията показват, че няма тройна колокализация на mTOR, LC3 и LAMP2, което показва неуспешно образуване на TASCC в бъбреците (Фигура 5C).
Както знаем, автофагията функционира при разграждането на цитозолните съставки, което се извършва главно от автолизозома, образувана от сливането на автофагозома и лизозома. Съобщава се, че аутофагията намалява секрецията на IL-1 чрез разграждане на про-IL-1 в LPS-стимулирани макрофаги.28 Интересното е, че открихме, че IL-1 (зелен) е локализиран заедно с LC3 puncta (червен) и LAMP2 (розов) в CON и DN (Диабетна нефропатия)плюс CO (Въглероден окис)групи (Фигура 5D, червената стрелка), показваща пресечната точка между SASP и разграждането на автофагията. По същия начин, в сравнение с DN (Диабетна нефропатия)група, други цитокини на SASP, включително IL-6, TGF- и VEGF, също имат умерена, но очевидна съвместна локализация с LC3 puncta и LAMP2 в CON и DN плюс CO (Въглероден окис)групи (Фигура 5E-G, червената стрелка), сред които най-очевидно VEGF, ко-локализиран с автолизозоми (Фигура 5G). Въпреки това, припокриващото се жълто оцветяване в DN (Диабетна нефропатия)група показа, че SASP е разположен само съвместно с LC3 puncta (Фигура 5D-G, бялата стрелка). Освен това, нивото на протеин на VEGF се измерва в HPC след добавяне на агонисти на автофагия (ABT737 и рапамицин) или CORM-2. Въпреки че няма значителна разлика в нивото на общия протеин на VEGF (Фигура 5H), присъствието както на агонисти на автофагия, така и на CO (Въглероден окис)значително намалява освобождаването на VEGF в HPC, индуцирано от HG (Фигура 5I, J). Взети заедно, тези резултати показват, че някои SASP се разграждат чрез автофагия.
ФИГУРА 4 CO (Въглероден окис)облекчено стареене чрез подобряване на автофагията in vitro. HBZY-1, HPC и HK-2 бяха третирани с HG, CORM-2 и инхибитори на автофагията (WORT: 200nM и CQ: 5 μmol/L).
A, Оцветяването и положителните клетки на SA- -gal в 3 вида бъбречни клетки (n=3). Скала: 25 μm.
B, C, Клетъчна пролиферация, оценена чрез EdU оцветяване в HBZY-1 и HK-2 и количествено определяне на дела на положителните клетки (n=3). Скала: 50 μm.
D, Експресия на протеин, свързан със стареенето (p53, p16 и p21) в HBZY-1 (n=5).
E, F, Представителни имунофлуоресцентни изображения на p53 и p16 и количествено определяне на дела на положителните клетки в HK-2 и HPC (n=3). Скала: 50 μm.
G, Нивата на протеинова експресия на Atg7 в HK-2, заглушени с siRNA (три последователности).
H, Представителни изображения на SA- -gal (Мащабна лента: 50 μm) и EdU оцветяване (Мащабна лента: 25 μm) и количествено определяне на дела на положителните клетки в HK-2 (n {{4 }}). *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>
3.6|CO (Въглероден окис)активирана аутофагия частично чрез дисоцииране на Beclin-1-Bcl-2 комплекс
Съобщава се, че дисоциацията на комплекса Beclin-1-Bcl-2 подобрява аутофагията, както и предотвратява преждевременното стареене, включително свързаните с възрастта бъбречни промени.21 Освен това CO (Въглероден окис)активирана аутофагия чрез Beclin-1 в мишки със сепсис.1/Следователно проучихме дали дисоциирането на комплекса медиира активирането на аутофагията от CO (Въглероден окис). Резултатите от съвместната имунопреципитация показват, че CO (Въглероден окис)намалено свързване на Beclin-1-Bcl-2 в DN (Диабетна нефропатия) мишки (Фигура 6А). Освен това, в сравнение с лечението на HG и CO (Въглероден окис), комбинираното използване на HG, CO (Въглероден окис), и агентът за дисоциация на комплекса Beclin-1-Bcl-2 ABT737 допълнително активира аутофагията на HBZY-1, както се вижда от непроменен LAMP2, намален p62 и повишено съотношение LC3ll/LC3l (Фигура 6B). Освен това резултатите показват, че комбинираното използване на CO (Въглероден окис)и ABT737 допълнително регулират надолу експресията на p53, p21 и p16 в HBZY-1 (Фигура 6C) и намаляват SA- -galt клетката в HBZY-1, HK{{9} } и HPC (Фигура 6D), което показва, че ABT737 засилва анти-стареещия ефект на CO (Въглероден окис). Тези наблюдения предполагат, че CO (Въглероден окис)може да активира аутофагията чрез дисоцииране на комплекса Beclin-1-Bcl-2 за облекчаване на стареенето.
