KLRG1 маркира тумор-инфилтриращи CD4 Т клетъчни подмножества, свързани с туморна прогресия и имунотерапевтичен отговор

Резюме

Настоящите методи за откриване на биомаркери и идентифициране на мишени в имуноонкологията разчитат на статични моментни снимки на туморен имунитет. За цялостно характеризиране на времевия характер на противотуморните имунни отговори, ние разработихме 34-параметричен панел за спектрална поточна цитометрия и извършихме високопроизводителни анализи в критични контексти.

Ние използвахме два различни предклинични модела, които рекапитулират съответно имуноредактиране на рак (NPKC1) и реакция на блокада на имунна контролна точка (ICB) (MC38), и профилирахме множество релевантни тъкани при и около ключови инфлексни точки на имунно наблюдение и бягство и/или ICB отговор.

Мишените се отнасят до важни биомолекули в клетките, като протеини, ензими и рецептори. Разпознаването на целта е използването на химични и биологични методи за идентифициране на специфичните свойства и функции на тези биомолекули за приложение при лечение на заболявания и разработване на лекарства.

Имунитетът се отнася до способността на тялото да устои на инвазията на чужди патогени и растежа на ендогенни анормални клетки. Ядрото на имунната система са имунните клетки и молекули, които имат тесни връзки и взаимодействия със своите мишени.

При лечението на заболявания и разработването на лекарства връзката между идентифицирането на целта и имунитета е много важна. Например, механизмът на действие на много лекарства е чрез разпознаване на мишени, насочване към специфични протеини, ензими, рецептори и други молекули, засягане на техните функции и регулиране на сигналната трансдукция, за постигане на терапевтични ефекти. Клетки и молекули в имунната система също могат да бъдат мишени на лекарства. Например, противораковите лекарства постигат терапевтични ефекти чрез повлияване на имунния отговор на раковите клетки и регулиране на клетъчната апоптоза и пролиферация.

Следователно, при разработването на лекарства и клиничното лечение, цялостното разглеждане на факторите за идентифициране на целта и имунитета може да доведе до по-ефективно разработване на лекарства и подобрен терапевтичен ефект. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета. Cistanche може да повиши имунитета. Cistanche е богат на различни антиоксидантни вещества, като витамин С, витамин С, каротеноиди и др. Тези съставки могат да поглъщат свободните радикали, да намалят оксидативния стрес и да подобрят имунитета. системно съпротивление.

Щракнете върху прах от екстракт от Cistanche tubulosa

Анализът на данни, управляван от машинно обучение, разкри модел на експресия на KLRG1, който уникално идентифицира интратуморни ефекторни CD4 Т клетъчни популации, които конститутивно се свързват с туморното бреме в туморните модели и се губят в тумори, подложени на регресия в отговор на ICB. По подобен начин Helios-KLRG1 плюс подгрупа от тумор-инфилтриращи регулаторни Т-клетки (Tregs) се свързва с прогресия на тумора от имунно равновесие до бягство и също се губи в тумори, отговарящи на ICB.

Проучванията за валидиране потвърждават сигнатури на KLRG1 в човешки тумор-инфилтриращи CD4 Т клетки, свързани с прогресия на заболяването при рак на бъбреците. Тези констатации номинират KLRG1 плюс CD4 Т клетъчни популации като подгрупи за по-нататъшно изследване на имунитета срещу рак и демонстрират полезността на профилирането на надлъжния спектрален поток като двигател на динамичен биомаркер и/или откриване на цел.

Въведение

Имунотерапията сега е стълб на лечението на рака. Въпреки това отговорите към повечето имунотерапевтични средства остават редки, ограничени до ограничен брой видове тумори и трудни за прогнозиране (1). Подобряването на нивата на отговор и разработването на биомаркери, предсказващи отговора, са централни цели на областта на туморната имунология, но това остава предизвикателство.

Множество сложни многоклетъчни взаимодействия могат да управляват резултата от антитуморен имунен отговор при всеки отделен пациент. Поради това е обичайно единичните биомаркери – или терапевтичната модулация на единични пътища – да имат полза при някои, но не и при повечето пациенти с рак.

Например, има три имуносвързани биомаркера, които понастоящем са широко разпространени в клиничната практика; (i) туморна мутационна тежест (TMB), измерена директно или изведена чрез наличието на инвалидизиращи мутации в механизмите за възстановяване на ДНК (2-4), (ii) експресия на PD-L1 чрез имунохистохимия (IHC) (5) и (iii) съществуващ имунитет, измерен чрез наличието на CD8 Т клетки в и околните тумори, наречен Immunoscore (6).

Въпреки че всеки от тях е значително свързан с отговора на имунотерапията в определени контексти, чувствителността и специфичността на тези предиктори остават неоптимални (7). Тези унимодални подходи вероятно не успяват да уловят напълно сложните механизми, лежащи в основата на антитуморния имунитет, включително динамичния характер на такива реакции, възникващи в тъканите и с течение на времето.

Като такова, прилагането на силно мултиплексирани едноклетъчни подходи за имунно профилиране за откриване на биомаркери и откриване на мишени по тъканен, надлъжен начин може да осигури нюансирани имунни фенотипове с по-голяма предсказваща и транслационна полезност.

За тази цел разработихме панел за 34-параметрична спектрална поточна цитометрия и тръбопровод за анализ на данни с големи размери, за да разпитаме имунни фенотипове на ниво протеин, свързани с различни фази на цикъла на имуноредактиране на рака, включително имунно бягство и туморен растеж и имунна контролна точка отговор на блокада (ICB) в предклиничните модели.

Ние профилирахме третираните с NPK-C1 и ICB MC38 модели, анализирайки множество тъкани (тумор, дрениращи спрямо недрениращи лимфни възли и кръв) над и около ключови инфлексни точки в прогресията на тумора. Това улесни дълбокото характеризиране на динамиката, лежаща в основата на естествената и индуцирана от ICB регресия на тумора, преход към имунно равновесие и последващ преход от равновесие към неконтролирано бягство на тумора. Проучванията за валидиране на човешки едноклетъчни набори от данни за рак на бъбреците потвърдиха транслационното значение на тези открития.

Материали и методи

мишки. Мъжки и женски мишки C57BL/6J (на възраст 5-6 седмици) бяха закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME). Мишките са били на възраст 6-8 седмици по време на употреба. Всички животни бяха настанени в строго съответствие с разпоредбите на NIH и Американската асоциация за грижа за лабораторни животни. Всички експерименти и процедури за това проучване бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните към Медицинския център на Колумбийския университет (IACUC).

Клетъчни линии. Клетъчната линия NPK-C1 (първоначално LM7304) е предоставена от д-р Кори АбатеШен от Колумбийския университет. Вижте предишни препратки за повече подробности (8,9). NPK-C1 клетките се поддържат в R10, състояща се от RPMI среда (Corning; Corning, NY), допълнена с 10 процента FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U/mL пеницилин и 100 mg/mL стрептомицин (Gibco; Gaithersburg, MD). MC38 клетки от карцином на дебелото черво бяха закупени от Kerafast и култивирани в D10, състоящ се от DMEM (Corning; Corning, NY), допълнен с 10 процента FBS, 100 U/mL пеницилин и 100 mg/mL стрептомицин (Gibco; Gaithersburg, MD).

Инжекции за лечение на тумори и терапия. NPK-C1 клетки при 70-90 процента сливане или MC38 клетки с 50-75 процента сливане бяха събрани с 0.05 процента трипсин (Gibco, Gaithersburg, MD), промити с PBS, преброени и ресуспендирани при 10x106 клетки/mL в ледено студен PBS. На ден 0, мишки на възраст 6-8 седмица бяха имплантирани на десния хълбок с 1x106 NPK-C1 или MC38 клетки. Измерванията на тумора се записват в размери X, Y и Z (съответно най-голям диаметър, най-малък диаметър и най-голяма височина) на всеки 2-3 дни с дигитален дебеломер и обемът на тумора се изчислява чрез умножаване на X*Y*Z. Анти-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) или изотипно антитяло на плъх IgG2a (Bio X Cell; Ливан, NH) се разрежда в стерилен PBS и се прилага чрез интраперитонеална (IP) инжекция при 200 ug/ mL на мишка на дни 3, 6, 9 и 12 след имплантиране на MC38.

Събиране на тъкани. След евтаназия на мишка, ~200 ul кръв се изолира чрез сърдечна пункция с помощта на 0,2% хепарин (StemCell Technologies; Vancouver, BC) покрита игла за спринцовка и се поставя върху лед в епруветки, съдържащи 10 ul 0,5M EDTA (Corning; Corning, NY). Дрениращите тумори и недрениращите ингвинални лимфни възли бяха дисектирани и поставени в 48-плаки с ямки, съдържащи 150 ul R10 среда върху лед.

Туморите бяха събрани, масирани и до 50 mg тумор бяха нарязани на кубчета и поставени в среда X-Vivo 15 (Lonza; Базел, Швейцария) в 5mL Eppendorf епруветки върху лед. DNase (40 ul от 20 mg/mL разтвор; Roche; Basel, Швейцария) и Collagenase D (125 ul от 40 mg/mL разтвор; Roche; Basel, Швейцария) бяха добавени към туморни проби преди инкубиране в шейкър при 37o C за 30 минути. Реакциите на смилане бяха потушени чрез завихряне (30 секунди) и добавяне на 5mL R10 среда. Туморните усвоявания се филтруват през 70 μm филтри (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) и се пелетират. Кръвните проби бяха лизирани с червени кръвни клетки с две последователни 2-минутни инкубации в 2mL ACK буфер (Quality Biological; Gaithersburg, MD) и охлаждане в R10 преди пелетиране. Лимфните възли бяха физически дезагрегирани с бутало на спринцовка от 1 ml в 48-плочката с ямки, след което суспензиите бяха филтрирани през 40-um филтри. Всички проби бяха поставени в плаки с U-дъно 96-ямки за оцветяване.

Поточна цитометрия. Пробите се промиват с PBS. Мъртвите клетки се оцветяват чрез повторно суспендиране в 100 ul PBS плюс живо/мъртво фиксируемо синьо багрило (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Това и всички следващи стъпки на оцветяване или фиксиране се извършват в продължение на 30 минути при стайна температура върху шейкър за плаки, защитен от светлина. Пробите бяха промити 2 пъти с PBS, след това бяха ресуспендирани в FACS (PBS плюс 3 процента FBS плюс 1 mM EDTA плюс 10 mM HEPES), допълнен с TruStain FcX (1:50; BioLegend; Сан Диего, Калифорния) и TruStain моноцитен блокер (1:20; BioLegend; Сан Диего, Калифорния) и поставен върху лед.

Повърхностните антитела се приготвят при оптимални разреждания (вижте допълнителна таблица S1) в FACS, допълнен с буфер Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), след което се добавят към пробите в блокиращ разтвор. След оцветяване, пробите се промиват 2 пъти с FACS буфер и се фиксират в 100 ul FoxP3 буфер за фиксиране/пропускливост на комплект (eBioscience; Сан Диего, Калифорния). Пробите се промиват два пъти с 1X пермеабилизиращ буфер (1X PW) и след това се оцветяват в 1X PW плюс вътреклетъчни антитела. След това пробите се промиват два пъти в 1X PW, след което се фиксират в 100 ul буфер FluoroFix (BioLegend: Сан Диего, Калифорния), промиват се два пъти с FACS, след това се ресуспендират в 200 ul FACS и се запечатват в 96-ямковите плаки за получаване на следващия ден на Cytek Aurora 5-лазерен цитометър.

Едновременно оцветени проби от спленоцити бяха използвани за единични контроли на оцветяване. Анализ и статистика. Експериментите за надлъжно профилиране бяха проведени веднъж за моделите MC38 и NPK-C1. Бяха оценени общо n=10-25 мишки за времева точка. Данните от поточната цитометрия бяха анализирани във FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ) и високоразмерните плъгин алгоритми UMAP и FlowSOM бяха изтеглени от FlowJo Exchange. До 30 000 живи CD45 плюс тумор-инфилтриращи клетки и до 15 000 живи CD45 плюс кръвни или LN-получени клетки на проба бяха свързани за високоразмерен анализ.

Цялото намаляване на размерността и групиране бяха извършени във FlowJo. Статистическите анализи бяха извършени в GraphPad Prism v9.3.1. Корелацията на Pearson беше използвана за генериране на коефициенти на корелация и несдвоени Т-тестове на Student с корекция на Welch бяха използвани за сравняване на честотите на клъстерите между групите. Аналитични методи за една клетка са описани по-рано (10,11).

Регулонът KLRG1 беше извлечен от консенсусния метаVIPER KLRG1 регулон от Obradovic, et al (11). За да изчислим сигнатурата на регулон KLRG1, ние напасваме модел на произволна горска регресия с гени на регулони като характеристики и KLRG1 като цел, след което изчислихме оценките на Gini за важност на гените на регулон, за да определим тяхното въздействие върху експресията на KLRG1. KLRG1 регулоновият резултат на всяка клетка беше даден от претеглената сума на експресионните мерки на всички регулонови гени в клетката с оценки на важност като тегла.

For more information:1950477648nn@gmail.com